Name: rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography
Uploaded: 2023-01-06T13:05:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Vi vil gerne takke hele Peak Proteins teamet for hjælp og støtte. Fra cellevidenskabsteamet vil vi gerne anerkende Ian Hampton for hans værdifulde indsigt og vejledning i insektcelleekspression. Vi vil gerne takke Mark Abbott for at give ressourcerne og muligheden for at forfølge dette projekt.

1. Rengøringsmiddel og bufferforberedelse til FSEC
<ol><li>Forbered en vaskemiddelopløsning.<ol><li>For at fremstille en 20 ml stamopløsning vejes 4 g dodecylmaltosidpulver (DDM) og 0,4 g cholesterylhemisuccinat (CHS) pulver og gøres til 20 ml med destilleret H2O af laboratoriekvalitet.</li>
		<li>Efter tilsætning af alle komponenterne blandes med end-over-end-inversion ved 4 °C, indtil komponenterne er fuldstændigt opløselige. End-over-end-blanding natten over anbefales ved 4 °C.</li>
		<li>Vask og opbevar vaskemiddellagrene ved -20 °C indtil brug. Hvis lageret skal bruges med det samme, skal vaskemiddelmassen opbevares på is. BEMÆRK: Standardlageret af vaskemidler, der blev anvendt i dette arbejde, var en 20% (w/v) DDM- og 2% (w/v) CHS-blanding (se materialetabellen). Forskellige rengøringsmidler kan anvendes (f.eks. Laurylmaltose neopentylglycol; LMNG) eller brugen af vaskemiddelfri ekstraktion med polymerer såsom styren-maleinsyre (SMA) kan testes. Dette skal besluttes ved udformningen af de forsøgsbetingelser, der skal testes.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered en opløselighedsbuffer.<ol><li>Der fremstilles en opløselighedsbuffer ved at kombinere komponenternes korrekte vægt eller volumen for at opnå en slutkoncentration på 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v/v) glycerol og 1x proteasehæmmercocktail (se materialetabel) i et bægerglas. BEMÆRK: I denne undersøgelse var fremstillingen af 50 ml opløselighedsbuffer tilstrækkelig til behandling af fem prøver.</li>
		<li>Der tilsættes et 0,7 rumfang (f.eks. 35 ml, hvis der fremstilles 50 ml buffer) destilleret H2O af laboratoriekvalitet til bægerglasset.</li>
		<li>Bland på en magnetisk omrører, og brug en pH-meter til at justere bufferens pH til 7,5 ved dråbevis tilsætning af koncentreret NaOH.</li>
		<li>Brug et måleglas til at fylde bufferen op til det endelige krævede volumen med destilleret H2O af laboratoriekvalitet.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered SEC-løbebufferen.<ol><li>Forbered SEC-løbebufferen ved at kombinere den korrekte vægt eller volumen af komponenterne for at opnå en slutkoncentration på 100 mM HEPES, 150 mM NaCl og 10% (v/v) glycerol i et bægerglas. BEMÆRK: I denne undersøgelse var tilberedning af 600 ml SEC-buffer tilstrækkelig til at køre fem prøver.</li>
		<li>Der tilsættes et 0,7 rumfang (f.eks. 420 ml, hvis der fremstilles 600 ml buffer) destilleret H2O i laboratoriekvalitet.</li>
		<li>Bland på en magnetisk omrører, og brug en pH-meter til at justere bufferens pH til 7,5 ved dråbevis tilsætning af koncentreret NaOH.</li>
		<li>Brug et måleglas til at fylde bufferen op til det endelige krævede volumen med destilleret H2O af laboratoriekvalitet.</li>
		<li>Filtrer SEC-bufferen gennem et 0,45 μm porefilter på flasketoppen under vakuum (se materialetabellen).</li>
		<li>Når bufferen har passeret gennem filteret, afgasses det ved at lade det stå under vakuumet, indtil der ikke vises flere bobler, når de rystes.</li>
		<li>Der tilsættes en slutkoncentration på 0,03 % (w/v) DDM og 0,003 % (w/v) CHS til SEC-bufferen ved at tilsætte det krævede volumen af vaskemiddelbeholdningen, der er fremstillet i trin 1 (f.eks. 0,9 ml, hvis der fremstilles 600 ml SEC-buffer).</li>
		<li>Forafkøl bufferen før brug. BEMÆRK: Forskellige buffere kan bruges afhængigt af de testede forhold. For eksempel, hvis man tester effekten af forskellige vaskemidler på proteinet af interesse, skal der ideelt set laves en buffer med det samme vaskemiddel som det, der bruges til at opløse proteinet. Hvis der testes vaskemiddelfrie forhold med SMA, skal vaskemidlet helt udelades fra SEC-bufferen. Se dog diskussionsafsnittet for at få flere oplysninger om protokolændringer til screening af vaskemidler.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Forberedelse af prøver til FSEC
<ol><li>Forbered cellepillerne. BEMÆRK: Udgangspunktet for analysen er at høste cellepelleten fra en suspensionscelleekspressionskultur af det GFP-mærkede (eller andet fluorescerende mærkede) protein af interesse. De nøjagtige tidspunkter og betingelser for høst afhænger af proteinet, der udtrykkes, den cellelinje, der anvendes, de betingelser, som cellerne, der er dyrket i, og metoden, hvormed proteinekspression er blevet induceret. Disse detaljer ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. I dette studie blev der anvendt 0,5-1 g Sf21-cellepiller pr. tilstand, der skulle testes, svarende til 25-50 ml dyrkning 2-3 dage efter infektion med ca. 4 x 106 levedygtige celler/ml af en 1:20 fortynding af P2-baculovirus. Bemærk, at protokollen beskrevet her er blevet testet og fundet at fungere lige så godt med lignende vådvægte af cellepiller fra andre eukaryotcellelinjer (f.eks. HEK293E).<ol><li>Når cellerne fra suspensionskulturerne er klar til høst, overføres 25-50 ml kulturalikvoter til 50 ml koniske rør.</li>
		<li>Modvægt rørene, og brug en bordcentrifuge i en svingbar spand (se materialetabellen) ved 2.000 x g i 15 minutter ved stuetemperatur til at pelletere cellerne.</li>
		<li>Fjern og kassér kultursupernatanten ved forsigtigt at vippe den væk, eller brug en 50 ml pipet med et pipetfyldstof, hvis cellepillen er særlig løs.</li>
		<li>Hvis cellerne straks skal bruges til analyse, skal du placere cellepillen på is og fortsætte direkte til trin 5. Hvis cellerne skal gemmes til brug på et senere tidspunkt, fryses cellerne ned ved at placere dem ved -80 °C.</li>
		<li>Hvis cellepillen har været opbevaret ved -80 °C, tøs den hurtigt op ved at inkubere den ved stuetemperatur i 15 minutter, eller indtil prøven ikke længere er frossen. Flyt straks prøven til is ved at følge dette trin.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspender og opløs prøven.<ol><li>Der tilsættes 2 ml opløselighedsbuffer (trin 1.2) til cellepelleten.</li>
		<li>Der inkuberes med ende-over-ende-inversion ved 4 °C i 15-30 minutter, indtil det er homogent.</li>
		<li>Der tilsættes forblandet vaskemiddelmateriale (trin 1.1) (f.eks. 100 μL 20 % DDM/2 % CHS-lager) for at opnå en slutkoncentration på 1 % DDM/0,1 % CHS.</li>
		<li>Opløses i 30 minutter med end-over-end inversion ved 4 °C. BEMÆRK: Hvis det er ønskeligt, kan flere forhold testes parallelt. Antallet af parallelle prøver, der kan behandles på én gang, afhænger af det tilgængelige system til kørsel af SEC-eksperimentet. I opsætningen beskrevet her var det muligt at behandle op til fem prøver ad gangen.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør et centrifugeringstrin med lav hastighed.<ol><li>Prøven centrifugeres i en forkølet (4 °C) bordcentrifuge i en svingbar spand ved 2 000 x g i 15 minutter.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør et højhastighedscentrifugeringstrin.<ol><li>Supernatanten overføres forsigtigt fra lavhastighedscentrifugeringen til ultracentrifugeringsglas (f.eks. 0,5-2 ml reagensglas) ved hjælp af en stump kanyle fastgjort til en 5 ml sprøjte, idet man skal passe på ikke at forstyrre pellet fra spindet ved lav hastighed.</li>
		<li>Balancer rørpar inden for 0,05 g, og placer dem i en ultracentrifugeringsrotor med fast vinkel (se materialetabel).</li>
		<li>Der centrifugeres ved 4 °C i 30 minutter ved 250.000 x g.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC)
<ol><li>Forbered det hurtige proteinvæskekromatografisystem (FPLC), og ekvilibrer søjlen.<ol><li>Forbered systemet efter producentens anvisninger (se materialetabellen), for eksempel ved at fylde systemet med SEC-buffer og rense luftpumperne.</li>
		<li>Tilslut SEC-søjlen til FPLC, og sørg for, at der ikke kommer luft ind i søjlen. Dette opnås ved at påføre modtryk på SEC-søjlen med en sprøjte fyldt med vand (fastgjort til bunden af søjlen) for at udføre en drop-to-drop-forbindelse med FPLC-systemets strømningsvej.</li>
		<li>Præ-ligevægt af SEC-søjlen ved først at vaske den i 1,5 kolonnevolumener (36 ml for en 24 ml søjle) destilleret og filtreret H2O af laboratoriekvalitet efterfulgt af 1,5 kolonnevolumener SEC-buffer ved den anbefalede strømningshastighed og tryk for søjlen (se materialetabel). BEMÆRK: FPLC-systemet, der blev brugt i denne undersøgelse til at udføre FSEC, var i et koldt miljø og havde en fem-positions sløjfeventil og en seks-positions pladefraktionsopsamler monteret. Denne opsætning gør det muligt at indlæse fem prøver og køre sekventielt ned ad den samme kolonne på en automatiseret måde uden at kræve manuel indgriben mellem kørslerne. Til kørsel af SEC-eksperimenterne blev der anvendt en kommercielt tilgængelig færdigpakket 24 ml søjle (se materialetabel), som indeholdt en harpiks, der gjorde det muligt at løse proteiner i molekylvægtområdet 10-600 kDa. Hvis proteinet af interesse er særlig stort, kan en alternativ søjlematrix anvendes i stedet, hvilket tillader adskillelse af proteiner op til 5.000 kDa i molekylvægt. Bemærk, at tilstedeværelsen af vaskemiddel/lipidmicelle vil øge membranproteinets samlede størrelse med >150 kDa, afhængigt af det anvendte protein og vaskemiddel.</li>
	</ol></li>
	<li>Anvend eksemplet på kolonnen, og kør SEC-eksperimentet.<ol><li>Supernatanten overføres fra højhastighedscentrifugeringstrinnet til en 1 ml sprøjte med en kanyle med stump påsætning til sprøjten. Dette giver mulighed for prøvegenvinding fra centrifugerøret uden at forstyrre pelleten.</li>
		<li>Indstil prøvesløjfen til at indlæse. Overfyld en 500 μL prøveløkke ved at injicere 600-700 μL af prøven fra sprøjten i påfyldningsporten. Afhængigt af det anvendte system kan dette indlæsningstrin programmeres ind i metoden for at sikre, at der ikke begås fejl.</li>
		<li>Under metoden injiceres prøven fra sløjfen i kolonnen ved at tømme den med 4 ml SEC-buffer ved den anbefalede strømningshastighed og tryk for kolonnen (se materialetabel).</li>
		<li>Kør kolonnen med samme flowhastighed, indtil 1,5 kolonnevolumener (36 ml for en 24 ml kolonne) af bufferen er gået ned.</li>
		<li>Ved 0,25 af kolonnevolumen (6 ml for en 24 ml kolonne) skal du begynde at indsamle 0,2 ml fraktioner for at indsamle 90 fraktioner. BEMÆRK: Da kolonnens tomrumsvolumen forventes at være 0,3 kolonnevolumener, sikrer begyndende indsamling af fraktioner umiddelbart før dette, at elueringen af alt proteinet overvåges, inklusive ethvert protein, der er til stede i hulrumsvolumenet.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Indsamling og analyse af fluorescerende spor
<ol><li>Prøverne overføres fra fraktionsopsamleren (trin 3.2.5) til en plade med 96 brønde, og lysstofrøret aflæses.<ol><li>Før du tager en fluorescenslæsning, fortyndes de indsamlede prøver. Ved hjælp af en flerkanalpipette overføres 90 μL destilleret H2O i laboratoriekvalitet fra et reservoir til hvert hul i en uigennemsigtig fladbundet 96-brøndplade (se materialetabellen).</li>
		<li>Hvis fraktioner blev opsamlet i en 96-brønds blok under trin 3.2.5, skal du bruge en multikanalpipette til at overføre 10 μL af SEC-fraktionerne fra blokken til den uigennemsigtige fladbundede 96-brøndsplade og blande ved pipettering op og ned. Hvis SEC-fraktioner blev opsamlet i individuelle reagensglas i trin 3.2.5, overføres 10 μL af hver fraktion til den uigennemsigtige fladbundede 96-brøndsplade én efter én, idet prøverne pipetteres op og ned hver gang for at blande prøverne.</li>
		<li>Anbring den uigennemsigtige fladbundede plade med 96 brønde i pladelæseren, og mål fluorescensen. Hvis GFP er den fluorescerende etiket (anvendes her), indstilles excitationen så tæt som muligt på 488 nm, og fluorescerende emission detekteres så tæt som muligt på 507 nm. BEMÆRK: Den fortynding, der kræves, før fluorescensaflæsningen tages, afhænger af den samlede mængde protein af interesse, der er til stede i ekspressionskulturen, og følsomheden af den pladelæser, der anvendes. I eksemplerne vist i denne undersøgelse blev prøverne fortyndet 10 gange i vand. Som udgangspunkt skal fraktionerne fortyndes 5-10 gange i vand eller buffer før påvisning. Hvis det registrerede FSEC-sporsignal er særligt lavt, kan der i stedet anvendes mindre fortyndinger eller endda en ufortyndet prøve. Den enhed, der blev anvendt til detektion i denne undersøgelse, var en pladelæser, der var i stand til excitation ved 488 nm og detektering af fluorescerende emission ved 507 nm (se materialetabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Afbild FSEC-sporene.<ol><li>Eksportér dataene fra pladelæseren i et råformat (rå tekst eller en fil med kommaseparerede værdier). Disse rådata vil blive plottet på Y-aksen for FSEC-sporingen.</li>
		<li>For X-aksen beregnes det volumen, hvormed hver brøk blev indsamlet. Den første brønd skal være elueringsvolumenet, hvor den første fraktion blev indsamlet for at tage højde for fraktioneringsforsinkelsen (6 ml i dette eksempel). Fraktionerne efter dette skal øges sekventielt med det indsamlede fraktionsvolumen (0,2 ml i dette eksempel).</li>
		<li>Når X-akse- og Y-aksedataene er beregnet, skal du kopiere og indsætte dataene i grafsoftwaren (se materialetabellen) for at plotte det fluorescerende signal i hver brønd mod det volumen, hvormed det eluerede fra kolonnen. BEMÆRK: Figur 1 viser en skematisk gengivelse af de trin, der kræves for at køre et FSEC-eksperiment.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser FSEC-sporene.<ol><li>Vurder mængden af proteineluering ved tomrumsvolumen (ca. 8 ml for en 24 ml søjle), hvilket indikerer, at proteinet er meget stort i størrelse og sandsynligvis er udfoldet/aggregeret.</li>
		<li>Vurder mængden af proteineluering i eventuelle senere toppe, hvilket indikerer foldet protein. Dette forventes at være mellem 10 ml og 16 ml for en 24 ml søjle afhængigt af proteinstørrelsen (når det er forbundet med et vaskemiddel / lipidmicelle). Vær meget opmærksom på topformen, især hvis det er en bred eller delt top, der spænder over mere end 3-4 ml (for en 24 ml søjle), da dette indikerer en polydispers prøve.</li>
		<li>Forholdet mellem den monomere tophøjde og tomrumstophøjden beregnes ved at dividere det maksimale signal, der er registreret i monomertoppen, med det maksimale signal i tomrumstoppet. BEMÆRK: Denne værdi repræsenterer monodispersitetsindekset og tillader et kvantitativt mål for proteinkvalitet; Større værdier angiver den bedst mulige kvalitet, mens værdier under 1 indikerer problematiske prøver, da de har mere aggregeret protein end foldet protein.</li>
		<li>Hvis flere FSEC-kørsler skal sammenlignes, og den vigtigste funktion er mængden af monomer i hvert enkelt tilfælde, skal sporene plottes som det rå signal, der registreres af pladelæseren (f.eks. RFU). BEMÆRK: Hvis en sammenligning af mængden af monomer sammenlignet med det ufoldede protein er vigtigere, skal signalet normaliseres til en procentdel af det samlede signal ved hjælp af minimums- og maksimumaflæsningerne i sporet, hvilket vil fremhæve forskelle i forholdet mellem aggregeret og monomert protein mellem sporene.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk gengivelse af de trin, der kræves for at køre et FSEC-eksperiment. (1) Celler, der udtrykker det fluorescerende mærkede protein af interesse, opløses. (2) Den rå opløselighed afklares først med et lavhastighedsspin, efterfulgt af (3) et højhastighedsspin. (4) Den klarede prøvesupernatant fyldes og anbringes på en passende SEC-kolonne, og 5) fraktionerne opsamles. (6) Prøver af fraktionerne overføres til en plade med 96 brønde, og et GFP-fluorescerende signal detekteres ved hjælp af en pladelæser for at (7) plotte FSEC-sporet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<ol>
	<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography:+Rules+of+thumb,+limitations,+and+troubleshooting.">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+protein+molecules+at+the+nanometer+level+determined+by+sedimentation,+gel+filtration,+and+electron+microscopy.">Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy.</a> Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+and+estimation+of+their+relative+molecular+sizes+by+the+use+of+columns+of+starch+in+water.">The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water.</a> Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+on+the+basis+of+their+molecular+weights,+using+columns+of+starch+and+water.">The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water.</a> Biochemical Journal. 60 (4), (1955).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+protein+mixtures+on+columns+of+granulated+agar.">Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).</li><li>Hjert&#233;n, S., Mosbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Molecular-sieve&amp;#34;+chromatography+of+proteins+on+columns+of+cross-linked+polyacrylamide.">34;Molecular-sieve&amp;#34; chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide.</a> Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).</li><li>Porath, J., Flodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+filtration:+A+method+for+desalting+and+group+separation.">Gel filtration: A method for desalting and group separation.</a> Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+mutations+thermostabilize+G-protein-coupled+receptors.">How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).</li><li>Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+bottlenecks+in+the+membrane+protein+structural+biology+pipeline.">Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).</li><li>Hanson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335 (6070), 851-855 (2012).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+fluorescent+thermal+stability+assay+for+membrane+proteins.">Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostability+assays:+A+generic+and+versatile+tool+for+studying+the+functional+and+structural+properties+of+membrane+proteins+in+detergents.">Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents.</a> Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).</li><li>Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+thermal-shift+screen+reveals+specific+lipid+preferences+of+eukaryotic+and+prokaryotic+membrane+proteins.">An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).</li><li>Harborne, S. P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMPROvER:+The+Integral+Membrane+Protein+Stability+Selector.">IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).</li><li>Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+thermostability+of+membrane+proteins+by+western+blotting.">Defining thermostability of membrane proteins by western blotting.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).</li><li>Pedersen, M. E., &#216;stergaard, J., Jensen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+dispersion+analysis+(FIDA)+for+protein+quantification+and+characterization.">Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).</li></ol>

Peak Proteins er en kontraktforskningsorganisation, der leverer proteinekspression, oprensning, massespektrometri og strukturbestemmelse mod et gebyr.

De generiske systematiske tilgange til tilstandsscreening med FSEC, der præsenteres her, muliggør hurtig optimering af opløseligheds- og oprensningsparametre til produktion af membranproteiner. Det betyder, at stabile og funktionelt aktive membranproteiner hurtigt kan produceres til biofysiske og strukturelle undersøgelser. Desuden kan FSEC køres ved hjælp af laboratorieudstyr, der sandsynligvis allerede er på plads i membranproteinlaboratorier, og der er således ikke krav om køb af et specialinstrument til at køre analyserne.
Kritiske trin Den tid, der går mellem opløselighedspunktet fra cellerne i vaskemidlet til det punkt, hvor prøven sendes ned i SEC-kolonnen (trin 2.1.5-3.2.5), er tidskritisk, og der må ikke være pauser mellem disse trin. Alle trin skal udføres ved 4 °C eller på is, og den tid, det tager at udføre disse trin, skal holdes på et minimum. Disse tids- og temperaturbegrænsninger er nødvendige for at registrere FSEC-profilen for membranproteinet før enhver potentiel udfoldelse eller nedbrydning. Efter at membranproteinet er blevet opløseligt, er der større risiko for udfoldelse, aggregering og nedbrydning, selv ved 4 °C. Ideelt set bør alle prøver, for hvilke FSEC-sporene skal sammenlignes, passere SEC-kolonnen i samme tid efter opløselighedstrinnet. I praksis er dette vanskeligt, især hvis prøverne sendes sekventielt ned ad en enkelt kolonne, men det er muligt at indsamle op til fem SEC-spor inden for 3 timer fra hinanden, og inden for denne tidsramme bør der ikke være væsentlig nedbrydning.
Fejlfinding Hvis der ved udførelsen af FSEC-eksperimentet er lavt eller intet fluorescerende signal, er det muligt, at det pågældende membranprotein ikke har udtrykt den valgte cellelinje, har meget lav ekspression af den valgte cellelinje eller ikke er blevet opløseligt i det valgte vaskemiddel. Hvis prøverne blev fortyndet, før fluorescenssignalet blev opsamlet, og FSEC-sporet blev registreret, ville et simpelt første skridt være at prøve en lavere fortynding eller ingen fortynding af SEC-fraktionerne. Hvis dette stadig ikke giver et fortolkeligt FSEC-spor, skal proteinets ekspression og opløselighed kontrolleres.
Analysen af proteinekspression kan opnås ved at kontrollere prøvens fluorescens efter trin 2.2.2. Hvis der er et meget lavt eller intet fluorescerende signal fra denne prøve (f.eks. et signal meget tæt på baggrunden), er der sandsynligvis et problem med proteinekspressionen. Der kan tages skridt til at forbedre ekspressionsniveauerne for membranproteinet, såsom at skifte til en alternativ cellelinje eller justere vækstbetingelserne, induktionen af ekspression og tiden mellem induktion / infektion / transfektion og høsten. Imidlertid kan især dårlig proteinekspression indikere et ustabilt membranprotein og dermed et dårligt konstruktionsvalg.
Hvis ekspressionen er blevet kontrolleret, og der er et klart fluorescerende signal over baggrunden før FSEC, kan opløselighedseffektiviteten kontrolleres ved at måle prøvens resterende fluorescerende signal efter trin 2.4.3 (opløseligt membranprotein) sammenlignet med prøven efter trin 2.2.2 (total protein). Det er almindeligt, at opløselighedseffektiviteten er 20% -30% og stadig muliggør en vellykket analyse og oprensning af membranproteinet. Men hvis opløselighedseffektiviteten er mindre end 20%, kan det være nødvendigt med et andet rengøringsmiddel til opløselighed eller forskellige opløselighedsbetingelser. Hvis forsøg på at forbedre opløseligheden ikke lykkes, kan dette indikere et særligt ustabilt membranprotein og dermed et dårligt konstruktionsvalg.
Hvis der observeres en meget sen elueringstop i FSEC-sporet (f.eks. 18-24 ml), indikerer dette, at det fluorescerende protein har en proteinmolekylvægt, der er meget lavere end forventet. Dette kan skyldes, at membranproteinet af interesse nedbrydes, hvilket resulterer i "fri" GFP. Man bør kontrollere, om proteinet er intakt før og efter opløselighed ved hjælp af in-gel GFP-fluorescens. Hvis proteinet af interesse synes at være nedbrydende eller proteolyseret, kan mængden af proteasehæmmer øges to gange til fire gange. Imidlertid kan en høj følsomhed over for proteaser eller nedbrudt protein, selv før opløselighed, indikere et særligt ustabilt protein og dermed et dårligt konstruktionsvalg.
Ændringer og yderligere anvendelser af FSEC Almindeligvis er det fluorescerende mærke, der bruges i FSEC, GFP eller eGFP, som beskrevet i denne protokol. Der findes dog mange forskellige fluorescerende proteinmærker. Valget af det fluorescerende mærke, der skal bruges, afhænger af at have en pladelæser, der kan opnå de korrekte excitations- og emissionsparametre til registrering af fluorescerende signal for det valgte fluorescerende mærke og have en fluorofor med ringe eller ingen ændring i kvanteudbytte under forskellige miljøforhold. Desuden er FSEC ikke begrænset til fluorescerende proteiner, men kan også fungere lige så godt med et protein, der er mærket med et fluorescerende farvestof. For eksempel kunne et NTA-farvestof anvendes, hvilket med fordel ville binde til histidinmærkede membranproteinkonstruktioner. Desuden kan enten et fluorescerende mærket antistof, der er kemisk mærket med et fluorescerende farvestof og specifikt til binding af membranproteinet af interesse, eller et oprensningsmærke inkluderet i membranproteinkonstruktionen indirekte mærke et mål for FSEC.
Når der udføres screening af vaskemiddel ved hjælp af FSEC, kan der træffes et valg om, hvorvidt bufferen, der bruges til at køre SEC-kolonnen, skal indeholde det matchende vaskemiddel, som proteinet er opløseligt i, eller om der skal bruges et standardvaskemiddel på tværs af alle kørsler. En mere nøjagtig repræsentation af proteinets opførsel opnås, hvis hele eksperimentet udføres med det matchende vaskemiddel hele vejen igennem. Det kan dog være tidskrævende og spild af vaskemiddel, hvis søjlen skal genbalanceres i et nyt vaskemiddel, før hver kørsel udføres. Da hovedformålet med screening af vaskemidler desuden er at sammenligne spor, vil tendenserne forblive i sporene, selvom forholdene ikke er ideelle. Således kan der opnås et kompromis, hvor proteinet opløses i det relevante vaskemiddel, men søjlen køres i en standardbuffer med et enkelt vaskemiddel på tværs af alle kørsler (f.eks. DDM)11, hvilket kan spare tid og forbrugsstoffer til vaskemiddel.
Ved at ændre det anvendte FLPC-udstyr kan gennemstrømningen af FSEC-protokollen øges betydeligt, og prøvekravet kan minimeres. For eksempel kan et FPLC- eller HPLC-system udstyres med en autosampler, en mindre bedvolumenanalysekolonne (såsom en 3,2 ml analytisk SEC-kolonne) og en in-line fluorescerende detektor til overvågning af kontinuerlige FSEC-spor direkte fra søjlen. Den resulterende opsætning vil gøre det muligt at udføre flere FSEC-kørsler på kortere tid og fjerne det manuelle plotningstrin, hvilket gør det muligt at teste et større antal betingelser inden for en kortere tidsramme. Desuden vil prøvekravet blive yderligere reduceret, da færre prøver vil skulle forberedes og indlæses på FSEC-kolonnen for hver kørsel. Dette ville åbne muligheder for at reducere ekspressionskulturerne til et pladebaseret format, da der ville være behov for så lidt materiale til analysen.
FSEC's styrker og svagheder sammenlignet med andre metoder En ulempe ved FSEC er, at membranproteinkonstruktionerne skal designes til at introducere den fluorescerende etiket, og ved introduktion er der en lille mulighed for, at placeringen af etiketten kan forstyrre funktionen eller foldningen af membranproteinet af interesse. Derudover overvåger FSEC-protokollen, som beskrevet her, egenskaberne ved et membranprotein i nærvær af cellelysat, som er en rå blanding af proteiner. Opførelsen af et membranprotein i dette miljø kan være anderledes end når membranproteinet af interesse udsættes for en præparativ SEC-søjle ved afslutningen af oprensningen, når den er fuldt isoleret fra andre proteiner. Desuden giver FSEC et noget kvalitativt mål for proteinkvalitet. Ved at konvertere FSEC-sporet til et monodispersitetsindeks som beskrevet i trin 4.3.3 i protokollen kan der imidlertid opnås et kvantitativt mål for proteinkvaliteten.
FSEC er ikke den eneste metode, der kan bruges i den tidlige analyse af membranproteinkonstruktioner, opløselighedsbetingelser og oprensningsbuffersammensætning. De alternative tilgange har både fordele og ulemper i forhold til FSEC. For eksempel findes fluoroforbaserede termostabilitetsassays, især brugen af farvestoffet 7-diethylamino-3-(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin (CPM)16,17. Fordelen ved denne metode er, at termostabilitetsassays i modsætning til FSEC, som giver et kvalitativt mål for proteinkvalitet, giver et kvantitativt mål i form af en relativ smeltetemperatur. Desuden er der ikke noget krav om at indføre et fluorescerende mærke på proteinkonstruktionen. Ulemperne ved termostabilitetsassays sammenlignet med FSEC er imidlertid, at renset protein skal anvendes, og at analysen ikke er kompatibel med alle proteinkonstruktioner, da den er afhængig af de fordelagtige positioner af indfødte cysteinrester i det foldede protein.
En anden metode, der har ligheder med både FSEC- og fluoroforbaserede termostabilitetsassays, er et assay, der måler temperaturfølsomheden af et membranprotein. I dette assay udfordres proteinet med forskellige temperaturer, og proteinet, der forbliver i opløsning efter centrifugering, detekteres. Detektion i denne metode er blevet udført på flere måder, herunder måling af fluorescensen i opløsning18, fluorescensen af et SDS-PAGE gelbånd19 eller signalintensiteten i en western blot20. En væsentlig ulempe ved disse tilgange er imidlertid, at analysen er meget arbejdskrævende og tilbøjelig til høj støj i resultaterne, da hvert enkelt temperaturpunkt skal indsamles uafhængigt.
Endelig kan flere mere avancerede biofysiske teknikker bruges til at vurdere membranproteinkvalitet på samme måde som FSEC, for eksempel flowinduceret dispersionsanalyse21, mikroskala termoforese22 eller SPR. Selv om disse metoder er meget effektive, er ulempen ved disse metoder kravet om, at højt specialiserede instrumenter skal køre analyserne.
Afslutningsvis giver FSEC et uvurderligt værktøj til brug i membranproteinproduktionskampagner, og selvom det ikke er den eneste mulighed, har det flere forskellige fordele i forhold til andre metoder, som anført ovenfor. Krydsvalidering af resultaterne ved ortogonale assays anbefales altid, og ingen af de ovenfor beskrevne metoder udelukker hinanden.

Størrelseseksklusionskromatografi (SEC), også kendt som gelfiltreringskromatografi, anvendes almindeligvis i proteinvidenskab1. Under SEC adskilles proteiner baseret på deres hydrodynamiske radius, som er en funktion af proteinstørrelsen og formen2. Kort fortalt opnås denne adskillelse ved at anvende proteinprøverne under flow på et pakket leje af porøse perler, der fungerer som en molekylær sigte. De anvendte perler er ofte tværbundet agarose med et defineret interval af porestørrelser, så proteiner enten kan trænge ind i eller udelukkes fra porerne i perlerne 3,4,5,6,7. Proteiner med mindre hydrodynamiske radier tilbringer en større andel af tiden i porerne og strømmer således langsommere gennem det pakkede leje, mens større proteiner tilbringer en større andel af tiden uden for perlerne (det ekskluderede volumen) og bevæger sig hurtigere gennem det pakkede leje. SEC kan bruges som et proteinrensningstrin, når der anvendes en præparativ søjle1. Når der anvendes en analytisk kolonne, kan SEC bruges til at analysere proteinkvaliteten og egenskaberne2. For eksempel har proteinaggregater, der kan være til stede i en prøve og indikerer protein af dårlig kvalitet, tendens til at være meget store, hvilket betyder, at de kun rejser i det udelukkede volumen og således elueres fra kolonnen tidligst muligt; Dette volumen kaldes kolonnens ugyldige eller ugyldige volumen. Desuden kan molekylvægtstandarder bruges til at kalibrere søjlen, hvilket gør det muligt at interpolere en estimeret molekylvægt af det pågældende protein fra en standardkurve.
Typisk anvendes proteinabsorbansen ved 280 nm til at overvåge proteinelueringen fra en størrelseseksklusionskolonne. Dette begrænser brugen af SEC som analyseværktøj, indtil proteinet af interesse stort set er fri for forurenende proteiner, for eksempel i det sidste trin af proteinrensning. Imidlertid bruger fluorescerende SEC (FSEC) et protein af interesse, der er fluorescerende mærket. Derfor kan et fluorescerende signal bruges til specifikt at overvåge elueringen af proteinet af interesse i tilstedeværelsen af andre proteiner eller endda råblandinger 8,9. Da fluorescerende signaler desuden er meget følsomme, kan en vellykket analyse udføres på prøver med ekstremt lave proteinmængder. Proteinet af interesse er ofte fluorescerende mærket ved at inkludere et grønt fluorescerende protein (GFP) eller forbedret GFP (eGFP) tag i ekspressionskonstruktionen. Det fluorescerende signal kan derefter overvåges ved excitation ved 395 nm eller 488 nm og detektere fluorescerende emission ved 509 nm eller 507 nm for henholdsvis GFP eller eGFP10.
Fordelen ved at bruge et fluorescerende signal til at overvåge proteineluering fra en SEC-søjle gør FSEC til et værdifuldt værktøj til analyse af membranproteinprøver, når ekspressionsniveauerne er særligt dårlige sammenlignet med opløselige proteiner. Det afgørende er, at membranproteiners kvalitet og egenskaber kan analyseres direkte efter opløselighed fra rålysater uden krav om at optimere rensningsprocessen først11,12. Af disse grunde kan FSEC bruges til hurtigt at analysere membranproteinkvaliteten, mens man udforsker de forskellige faktorer, der kan være nødvendige for at forbedre membranproteinets opførsel i opløsningen. For eksempel er det almindeligt at prøve adskillige konstruktioner, der indeholder forskellige tags, trunkeringer, deletioner, indsættelser af fusionspartnere og stabiliserende mutationer for at finde en, der ikke aggregeres efter ekstraktion fra membranen13,14. Desuden kan bufferscreening for at bestemme vaskemidlet, additivet, liganden eller polymeren, der giver den mest stabiliserende tilstand for membranproteinet, definere den bedste buffersammensætning til proteinrensning eller til at tilvejebringe stabilitet til downstream-anvendelser, såsom biofysiske assays eller strukturel karakterisering.
Det overordnede mål med FSEC-metoden er således at indsamle en SEC-søjleelueringsprofil for et målmembranprotein af interesse. Da fluorescens anvendes, indsamles dette SEC-spor desuden så tidligt som muligt i optimeringen af konstruktionerne og betingelserne forud for enhver langvarig rensning. FSEC-sporet kan bruges som et komparativt værktøj til at bedømme sandsynligheden for succes med at rense et membranprotein med forskellige bufferbetingelser eller membranproteinkonstruktioner. På denne måde kan indsamlingen af FSEC-profiler bruges som en hurtig iterativ proces til at nå frem til optimalt konstruktionsdesign og buffersammensætning, inden der bruges kræfter på at generere de mængder rent protein, der kræves til andre analysemetoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL and 5 mL plastic syringes&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Syringes for transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab201111</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes&#160;&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>344625&#160;</td>
			<td>Tubes for ultra-centrifuge rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>50 mL tubes for cell harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well blocks&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>15922302</td>
			<td>For collecting 0.2 mL SEC fractions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA&#160; V9-L loop valve</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29011358</td>
			<td>5 posiiton loop valve&#160; for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA F9-C fraction collector</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29027743</td>
			<td>6 position plate fraction collector for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29018224&#160;</td>
			<td>FPLC system for running the experiment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15828722&#160;</td>
			<td>Centrifuge for low-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end filling needles&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top vacuum filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10005490</td>
			<td>Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl hemisuccinate (CHS)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>CH210-5GM&#160;</td>
			<td>Additive for detergent solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable multichannel reseviour&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecyl maltoside (DDM)&#160;</td>
			<td>Glycon&#160;</td>
			<td>D97002-C-25g&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP protein standards</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K815-100</td>
			<td>eGFP standards for fluorescent calibration curve&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>11443297</td>
			<td>Glycerol for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10411451</td>
			<td>HEPES for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403842</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>NB-19-0055-5G&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular&#160; weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403841</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLA-130 ultra-centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>367114&#160;</td>
			<td>Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque 96-well flat-bottom micro-plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10656853</td>
			<td>96-well for reading fluorescent signal in plate reader&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-XP ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393315&#160;</td>
			<td>Centrifuge for high-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For adjusting the pH of buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Graphing software for plotting traces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary mixer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12027144&#160;</td>
			<td>Mixer for end over end mixing in the cold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10316943</td>
			<td>Sodium chloride for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10488790</td>
			<td>Sodium hydroxide for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax ID3 Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>735-0391</td>
			<td>Micro-plate reader capable of reading fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer plate</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For stirring buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene maleic acid (SMA)&#160;</td>
			<td>Orbiscope&#160;</td>
			<td>SMALP 300&#160;</td>
			<td>Polymer for detergent free extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28990944&#160;</td>
			<td>SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 &#176;C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16694-2-50-06</td>
			<td>For filtering and degassing buffers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography

Under membranproteinstrukturel belysning og biofysisk karakterisering er det almindeligt at prøve adskillige proteinkonstruktioner, der indeholder forskellige tags, trunkeringer, deletioner, indsættelser af fusionspartnere og stabiliserende mutationer for at finde en, der ikke er aggregeret efter ekstraktion fra membranen. Desuden er bufferscreening for at bestemme vaskemidlet, additivet, liganden eller polymeren, der giver den mest stabiliserende tilstand for membranproteinet, en vigtig praksis. Den tidlige karakterisering af membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelseseksklusionskromatografi giver et kraftfuldt værktøj til at vurdere og rangordne forskellige konstruktioner eller betingelser uden krav om proteinoprensning, og dette værktøj minimerer også prøvekravet. Membranproteinerne skal mærkes fluorescerende, almindeligvis ved at udtrykke dem med et GFP-mærke eller lignende. Proteinet kan opløses direkte fra hele celler og derefter groft afklares ved centrifugering; Derefter overføres proteinet ned i en størrelsesudelukkelseskolonne, og der opsamles et fluorescerende spor. Her præsenteres en metode til kørsel af FSEC og repræsentative FSEC-data på GPCR-målene sphingosin-1-phosphatreceptor (S1PR1) og serotoninreceptor (5HT2AR).

Først blev det dynamiske område og de nedre grænser for eGFP-detektion for pladelæseren, der blev brugt i denne undersøgelse, undersøgt. En renset eGFP-standard med kendt koncentration blev fortyndet i et 50 μL slutvolumen til 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 ng·μL−1 og 0,390625 ng·μL−1, og fluorescensen blev aflæst ved hjælp af en excitation på 488 nm og en emission på 507 nm (figur 2 ). Dette eksperiment viste, at pladelæseren havde en lavere detektionsgrænse på 30 ng eGFP-mærket protein pr. brønd og et dynamisk område på op til 500 ng eGFP-mærket protein pr. brønd før signalmætning. Ved hjælp af værdien for den nedre grænse og forudsat at proteinelueringen er begrænset til 0,33 af kolonnevolumenet, kræves så lidt som 1,28 μg eGFP-mærket protein af interesse for SEC-søjleindlæsning for at et detekterbart FSEC-signal kan observeres.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig02.jpg"> Figur 2: eGFP-standardkurve. Spredningsgraf over fluorescerende signal for renset eGFP-standard fortyndet til 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 og 0,390625 ng·μL−1. (A) Alle fortyndinger vises, inklusive dem med det mættede signal. (B) En zoomet spredningsgraf, der kun omfatter de standarder, der falder ind under pladelæserens dynamiske område. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
For det andet blev den 24 ml kolonne, der blev brugt til denne undersøgelse, kalibreret med molekylvægtstandarder. Ved anvendelse af de samme buffer- og driftsbetingelser som anvendt til FSEC-analysen blev molekylvægtstandarderne blue dextran (>2.000 kDa), ferritin (440 kDa), aldolase (158 kDa), conalbumin (75 kDa) og ovalbumin (43 kDa) injiceret individuelt og kørt gennem kolonnen, og elueringsspor blev indsamlet ved 280 nm absorption. De registrerede elueringsvolumener var henholdsvis 8,9 ml, 12,4 ml, 15,2 ml, 16,9 ml og 18 ml. Når disse elueringsvolumener blev konverteret til Kav (ligning 1) og plottet mod logmolekylvægte, kunne en standardkurve passes. Dette gjorde det muligt at estimere molekylvægten af de GPCR'er, der blev testet i denne undersøgelse, ved interpolation af standardkurven (figur 3). For eksempel indikerede FSEC-sporet af GPCR-serotoninreceptoren 2A (5HT2AR) efter opløselighed i vaskemidlet DDM et elueringsvolumen på 13,4 ml. Dette elueringsvolumen på 5HT2AR ligger mellem de elueringsvolumener, der er registreret for ferritin og aldolase, og giver en anslået molekylvægt på ca. 300 kDa. 5HT2AR-konstruktionen, der anvendes i denne undersøgelse, er ca. 50 kDa (inklusive eGFP-tagget), hvilket betyder, at hvis 5HT2AR antages at være monomer, kan 250 kDa molekylvægt tilskrives DDM-vaskemiddel/lipidmicellen. Ligningen for omregning af elueringsvolumener er som følger (ligning 1):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64322/64322eq01.jpg" style="margin: auto;">(Ligning 1)
hvor V e er elueringsvolumenet, V 0 er kolonnens ugyldige volumen, og Vc er det samlede kolonnevolumen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig03.jpg"> Figur 3: Kalibreringskurve for SEC-kolonnen ved hjælp af molekylvægtstandarder. (A) Et repræsentativt FSEC-spor af 5HT2AR opløseligt i DDM med de relative elueringspositioner for molekylvægtstandarderne blå dextran (Void), ferritin, aldolase, conalbumin og ovalbumin markeret. Ferritin, aldolase, conalbumin og ovalbumin er farvet i henholdsvis grøn, lilla, rød og cyan. B) Molekylvægtskalibreringskurven ved hjælp af elueringspositionerne for standarderne efter omregning til Kav (ligning 1) afbildet mod logemolekylvægten (Mr). Mr på 5HT2AR i DDM blev interpoleret fra kurven ved hjælp af Kav og vises på kurven (blå firkant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
FSEC blev derefter anvendt til at vurdere kvaliteten og egenskaberne af GPCR-sphingosin-1-phosphatreceptoren (S1PR1)15. Insektceller, der udtrykker GFP-mærket humant S1PR 1, blev behandlet for FSEC som beskrevet i protokollen (figur 1).
For det første blev de optimale membranekstraktionsbetingelser undersøgt ved at teste vaskemidlerne DDM og LMNG mod vaskemiddelfri ekstraktion med SMA (figur 4A). Monodispersitetsindekset blev anvendt til at vurdere kvaliteten af proteinprøven og forholdet mellem proteinet i tomrummet (~8 ml søjleretention) sammenlignet med den monodisperserede prøve (14-15 ml søjleretention). Prøven opløst i LMNG viste en overlegen FSEC-profil med en bedre monomer topform og en lavere proteinaggregattop, hvilket indikerer, at opløselighed og oprensning i LMNG var de mest stabiliserende betingelser for dette membranprotein. I modsætning hertil havde prøven opløst i DDM en relativt dårligere FSEC-profil med en større samlet top og en bredere monomere top, hvilket indikerer polydispersitet i prøven.
For det andet blev effekten af ligandtilsætning på FSEC-profilen undersøgt ved tilsætning af sphingosin-1-phosphat (S1P) til prøven under opløselighed. I dette tilfælde blev DDM anvendt som opløselighedsreagens, og FSEC-sporene af S1PR1 i tilstedeværelse og fravær af S1P blev sammenlignet (figur 4B). Prøven opløst i nærvær af S1P viste et overlegent FSEC-spor med reduceret aggregering. Dette indikerede, at oprensning i nærvær af en ligand var fordelagtig for at forbedre proteinprøvekvaliteten ved at stabilisere receptoren i opløsning, men også var fordelagtig også som surrogatmarkør for proteinaktivitet, da resultaterne antydede, at proteinet var korrekt foldet og kompetent til ligandbinding.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig04.jpg"> Figur 4: FSEC ved anvendelse af et råekstrakt af S1PR 1, der angiver optimale membranekstraktionsbetingelser og ligandbinding. (A) Sammenligning af FSEC-sporene af S1PR1 opløseligt i styren-maleinsyre-copolymer (SMA; blå), laurylmaltoseneopentylglycol (LMNG; rød) eller dodecylmaltosid (DDM; sort). (B) Sammenligning af FSEC-sporene af S1PR 1 opløseligt i DDM i tilstedeværelse (rød) eller fravær (sort) af agonisten sphingosin-1-phosphat (S1P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
FSEC blev også brugt til at undersøge den langsigtede stabilitet af 5HT2AR under forskellige forhold. GFP-mærket human 5HT 2A R blev opløseligt fra insektcellemembraner i enten vaskemiddel (DDM) ellerSMA-polymerog analyseret af FSEC på flere tidspunkter efter opbevaring ved 4 °C eller stuetemperatur (figur 5). Efter flere dages inkubation viste 5HT2AR i DDM et signifikant fald i den monomere tophøjde ved begge temperaturer, og der blev observeret signifikante stigninger i den samlede top. I modsætning hertil viste 5HT2AR i SMA-lipidpartikel (SMALP) ikke et signifikant fald i den monomere tophøjde i løbet af eksperimentet, hvilket indikerer, at proteinet i SMALP forblev stabilt i længere tid, selv ved ugunstige temperaturer. Dette kan være vigtigt, når man overvejer proteinpræparater til downstream biofysiske anvendelser såsom overfladeplasmonresonansforsøg (SPR), hvor der er krav om, at prøven skal være stabil og aktiv over en lang periode for en vellykket gennemførelse af bindingsforsøgene.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig05.jpg"> Figur 5: Effekt af tid og temperatur på kvaliteten af 5HT 2A R ekstraheret fra membranen ved hjælp af enten DDM eller SMALP, som analyseret af FSEC. (A) Repræsentative FSEC-spor af 5HT2AR opløseligt i DDM og opbevaret ved stuetemperatur i 1 dag (grå), 2 dage (grøn) eller 5 dage (blå). B) Histogrammer for den normaliserede monomere tophøjde for DDM-prøver opbevaret ved 4 °C (blå) eller RT (grøn) sammenlignet med SMALP-prøver opbevaret ved 4 °C (grå) eller RT (sort). Fejlbjælker er repræsentative for SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Denne protokol beskriver en procedure til udførelse af fluorescerende størrelseseksklusionskromatografi (FSEC) på membranproteiner for at vurdere deres kvalitet til downstream funktionel og strukturel analyse. Repræsentative FSEC-resultater indsamlet for flere G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) under vaskemiddelopløselige og vaskemiddelfrie forhold præsenteres.

Hurtig vurdering af membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelseseksklusionskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

En SEC-profil er en effektiv måde at analysere kvaliteten af et protein på. Målet er at indsamle en SEC-profil for et membranprotein ved hjælp af fluorescens, som kan informere om prøvekvaliteten. FSEC bruger små mængder prøver og kan udføres til rensning, er relativt enkel og kan udføres på udstyr, der er tilgængeligt i mange laboratorier.Demonstration af proceduren vil være Jack Wright, en senior proteinforsker fra Peak Proteins. Begynd med at forberede cellepaletterne ved at optø cellepaletten, der opbevares ved minus 80 grader Celsius ved stuetemperatur i 15 minutter, eller indtil prøven ikke længere er frosset. Flyt straks prøven til is.For at genoplive og opløse prøven tilsættes to ml opløselighedsbuffer til cellepaletten. Inkuber med ende-over-ende inversion ved fire grader Celsius i 15 til 30 minutter. Derefter tilsættes forblandet vaskemiddelmateriale for at opnå en endelig koncentration af 1% dodecylmaltosid eller DDM og 0,1% kolesterolhemisuccinat eller CHS.Opløseligt i 30 minutter med ende-over-ende inversion ved fire grader Celsius. For at udføre et centrifugeringstrin med lav hastighed centrifugeres prøven i en bordcentrifuge ved hjælp af en svingbar spand og centrifugeres ved 2000 g i 15 minutter. Derefter udføres højhastighedscentrifugering ved at overføre supernatanten fra lavhastighedscentrifugeringen til ultracentrifugeringsrør ved hjælp af en stump kanyle fastgjort til en sprøjte på fem ml.Sørg for ikke at forstyrre paletten. Efter afbalancering af rørparene skal du placere dem i en ultracentrifugeringsrotor med fast vinkel og centrifugere ved fire grader Celsius i 30 minutter ved 250.000 g. Forbered det hurtige proteinvæskekromatografi eller FPLC-system ved at fylde systemet med størrelsesekskluderingskromatografi eller SEC-buffer og rense pumperne for luft.Tilslut SEC-søjlen til FPLC, og sørg for, at der ikke kommer luft ind i søjlen. Præ-ligevægt af SEC-søjlen ved at vaske den i 1,5 gange kolonnevolumener destilleret og filtreret vand af laboratoriekvalitet efterfulgt af 1,5 gange kolonnevolumener SEC-buffer ved den anbefalede strømningshastighed og tryk for søjlen. For at køre SEC-eksperimentet overføres supernatanten fra højhastighedscentrifugeringstrinnet til en sprøjte på en milliliter ved hjælp af en stump nål, der er fastgjort til sprøjten.Indstil prøvesløjfen til at indlæse. Overfyld en prøvesløjfe på 500 mikroliter ved at injicere 600 til 700 mikroliter af prøven fra sprøjten ind i påfyldningsporten. Injicer derefter prøven fra sløjfen i kolonnen ved at tømme den med fire ml SEC-buffer ved den anbefalede strømningshastighed og tryk.Kør kolonnen med samme strømningshastighed, indtil den passerer 1,5 gange buffervolumenet, og begynd at indsamle 90 fraktioner af 0,2 ml efter passage af 0,25 gange kolonnevolumenet. Brug en multikanalpipette til at overføre 90 mikroliter destilleret vand af laboratoriekvalitet fra et reservoir til hver brønd i en uigennemsigtig, fladbundet plade med 96 brønde. Overfør derefter de 10 mikroliter af prøverne fra en 96-brøndplade til den uigennemsigtige, fladbundede, 96-brøndsplade, og læg brøndpladen i en pladelæser.For den fluorescerende mærkede GFP, et excitationen så tæt som muligt på 488 nanometer og detekter fluorescerende emission så tæt som muligt på 507 nanometer, før signalet måles. Undersøgelsen af dynamisk område og nedre grænser for forbedret grønt fluorescerende protein eller EGFP-detektion for pladelæseren viste, at pladelæseren havde en lavere detektionsgrænse på 30 nanogram og et dynamisk område på op til 500 nanogram EGFP-mærket protein pr. brønd før signalmætning. Omdannelsen af elueringsvolumenerne til Kav og plotningen af den mod logmolekylvægte gjorde det muligt at estimere molekylvægten af de G-proteinkoblede receptorer ved interpolation af standardkurven.De optimale membranekstraktionsbetingelser blev undersøgt ved at teste DDM og laurylmaltose neopentylglycol mod vaskemiddelfri ekstraktion med styren maleinsyre copolymer. Effekten af ligandtilsætning på fluorescensstørrelsesekskluderingskromatografiprofilen blev undersøgt ved tilsætning af sphingosin-1-phosphat eller S1P til prøven under opløselighed. Prøven opløst i nærvær af S1P viste et overlegent spor med reduceret aggregering.Undersøgelsen af den langsigtede stabilitet af serotoninreceptor 5HT2AR under forskellige betingelser indikerede, at proteinet i styrenmaleinsyrelipidpartikler forblev stabilt i længere tid, selv ved ugunstige temperaturer. Tiden mellem opløselighedspunktet og prøven, der passerer ned i SEC-kolonnen, er tidskritisk. Der må ikke være pauser, og prøven skal holdes kold.Efter FSEC opnås en forståelse af den bedste konstruktion, vaskemiddel eller buffer. Dette gør det muligt at optimere proteinrensning og understøtter downstream biofysisk og strukturel karakterisering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Size-udelukkelse og ionbytningskromatografi på en SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur løsning af fluorescerende proteiner Cerulean ved hjælp af MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering af proteiner efter størrelse-eksklusions kromatografi koblet til multi-vinkel Light spredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...