Name: rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography
Uploaded: 2023-01-06T13:05:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

ברצוננו להודות על העזרה והתמיכה של כל צוות Peak Proteins. מצוות מדעי התא, ברצוננו להודות לאיאן המפטון על תובנותיו יקרות הערך והדרכתו בביטוי תאי חרקים. ברצוננו להודות למארק אבוט על שסיפק את המשאבים וההזדמנות להמשיך בפרויקט זה.

<ol>
	<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography:+Rules+of+thumb,+limitations,+and+troubleshooting.">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+protein+molecules+at+the+nanometer+level+determined+by+sedimentation,+gel+filtration,+and+electron+microscopy.">Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy.</a> Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+and+estimation+of+their+relative+molecular+sizes+by+the+use+of+columns+of+starch+in+water.">The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water.</a> Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+on+the+basis+of+their+molecular+weights,+using+columns+of+starch+and+water.">The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water.</a> Biochemical Journal. 60 (4), (1955).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+protein+mixtures+on+columns+of+granulated+agar.">Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).</li><li>Hjert&#233;n, S., Mosbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Molecular-sieve&amp;#34;+chromatography+of+proteins+on+columns+of+cross-linked+polyacrylamide.">34;Molecular-sieve&amp;#34; chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide.</a> Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).</li><li>Porath, J., Flodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+filtration:+A+method+for+desalting+and+group+separation.">Gel filtration: A method for desalting and group separation.</a> Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+mutations+thermostabilize+G-protein-coupled+receptors.">How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).</li><li>Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+bottlenecks+in+the+membrane+protein+structural+biology+pipeline.">Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).</li><li>Hanson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335 (6070), 851-855 (2012).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+fluorescent+thermal+stability+assay+for+membrane+proteins.">Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostability+assays:+A+generic+and+versatile+tool+for+studying+the+functional+and+structural+properties+of+membrane+proteins+in+detergents.">Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents.</a> Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).</li><li>Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+thermal-shift+screen+reveals+specific+lipid+preferences+of+eukaryotic+and+prokaryotic+membrane+proteins.">An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).</li><li>Harborne, S. P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMPROvER:+The+Integral+Membrane+Protein+Stability+Selector.">IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).</li><li>Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+thermostability+of+membrane+proteins+by+western+blotting.">Defining thermostability of membrane proteins by western blotting.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).</li><li>Pedersen, M. E., &#216;stergaard, J., Jensen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+dispersion+analysis+(FIDA)+for+protein+quantification+and+characterization.">Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).</li></ol>

Peak Proteins הוא ארגון מחקר קבלני המספק ביטוי חלבונים, טיהור, ספקטרומטריית מסות וקביעה מבנית תמורת תשלום.

הגישות השיטתיות הגנריות לבדיקת מצבים עם FSEC המוצגות כאן מאפשרות אופטימיזציה מהירה של פרמטרים של מסיסות וטיהור לייצור חלבוני ממברנה. משמעות הדבר היא כי חלבוני ממברנה יציבים ופעילים מבחינה תפקודית יכולים להיות מיוצרים במהירות עבור מחקרים ביופיזיים ומבניים. יתר על כן, ניתן להפעיל FSEC באמצעות ציוד מעבדה שככל הנראה כבר קיים במעבדות חלבון ממברנה, ולכן אין דרישה לרכישת מכשיר מומחה להפעלת הבדיקות.
שלבים קריטיים הזמן שלוקח בין נקודת המסיסות מתאים בחומר ניקוי לנקודה שבה הדגימה מועברת במורד עמודת SEC (שלבים 2.1.5-3.2.5) הוא קריטי לזמן, ואסור שיהיו הפסקות בין שלבים אלה. כל השלבים צריכים להתבצע ב 4 ° C או על קרח, ואת הזמן שלקח לבצע צעדים אלה צריך להישמר למינימום האפשרי. אילוצי זמן וטמפרטורה אלה נחוצים על מנת לרשום את פרופיל FSEC עבור חלבון הממברנה לפני כל התפתחות פוטנציאלית או התפרקות. לאחר שחלבון הממברנה היה מסיס, קיים סיכון גדול יותר לפתיחה, צבירה והתפרקות, אפילו ב -4 מעלות צלזיוס. באופן אידיאלי, כל הדגימות שעבורן יש להשוות את עקבות FSEC צריכות לעבור את עמודת ה- SEC באותו משך זמן לאחר שלב המסיסות. בפועל, זה קשה, במיוחד אם הדגימות מועברות ברצף לאורך עמודה אחת, אך ניתן לאסוף עד חמש עקבות SEC בהפרש של 3 שעות זו מזו, ובמסגרת זמן זו, לא אמורה להיות השפלה משמעותית.
פתרון בעיות אם, בעת ביצוע ניסוי FSEC, יש אות פלואורסצנטי נמוך או לא, ייתכן שחלבון הממברנה המעניין לא ביטא את קו התאים שנבחר, יש לו ביטוי נמוך מאוד של קו התאים שנבחר, או לא היה מסיס בחומר הניקוי שנבחר. אם הדגימות היו מדוללות לפני איסוף אות הפלואורסצנטיות ורישום עקבות FSEC, צעד ראשון פשוט יהיה לנסות דילול נמוך יותר או ללא דילול של שברי SEC. אם זה עדיין לא מניב עקבות FSEC הניתנים לפרשנות, יש לבדוק את הביטוי והמסיסות של החלבון.
ניתוח ביטוי החלבון יכול להיות מושג על ידי בדיקת הפלואורסצנטיות של המדגם לאחר שלב 2.2.2. אם יש אות פלואורסצנטי נמוך מאוד או ללא אות כלל מדגימה זו (למשל, אות קרוב מאוד לרקע), סביר להניח שיש בעיה עם ביטוי החלבון. ניתן לנקוט צעדים לשיפור רמות הביטוי של חלבון הממברנה, כגון מעבר לקו תאים חלופי או התאמת תנאי הגידול, השראת הביטוי והזמן בין האינדוקציה/זיהום/טרנספקציה לבין הקציר. עם זאת, ביטוי חלבון גרוע במיוחד יכול להצביע על חלבון קרום לא יציב, ולכן, בחירת מבנה גרועה.
אם הביטוי נבדק ויש אות פלואורסצנטי ברור מעל הרקע לפני FSEC, ניתן לבדוק את יעילות המסיסות על ידי מדידת האות הפלואורסצנטי הנותר של הדגימה לאחר שלב 2.4.3 (חלבון ממברנה מסיס) בהשוואה לדגימה לאחר שלב 2.2.2 (חלבון כולל). מקובל שיעילות המסיסות היא 20%-30% ועדיין מאפשרת ניתוח וטיהור מוצלחים של חלבון הממברנה. עם זאת, אם יעילות המסיסות נמוכה מ-20%, ייתכן שיהיה צורך בדטרגנט שונה למסיסות או בתנאי מסיסות שונים. אם הניסיונות לשפר את המסיסות אינם מצליחים, הדבר יכול להצביע על חלבון קרום לא יציב במיוחד, ולכן בחירת מבנה גרועה.
אם שיא פליטה מאוחר מאוד נצפה בעקבות FSEC (למשל, 18-24 מ"ל), זה מצביע על כך שלחלבון הפלואורסצנטי יש משקל מולקולרי חלבוני נמוך בהרבה מהצפוי. זה יכול להיגרם על ידי חלבון הממברנה של עניין להיות מפורק, וכתוצאה מכך GFP "חופשי". יש לבדוק אם החלבון שלם לפני ואחרי המסיסות באמצעות פלואורסצנטיות GFP בג'ל. אם נראה שהחלבון המעניין מתפרק או עובר פרוטאוליזה, ניתן להגדיל את כמות מעכבי הפרוטאז פי שניים עד פי ארבעה. עם זאת, רגישות גבוהה לפרוטאזות או חלבון מפורק עוד לפני המסיסות יכולה להצביע על חלבון לא יציב במיוחד, ולכן בחירת מבנה גרועה.
שינויים ויישומים נוספים של FSEC בדרך כלל, התג הפלואורסצנטי המשמש ב- FSEC הוא GFP או eGFP, כמתואר בפרוטוקול זה. עם זאת, קיימים תגי חלבון פלואורסצנטיים רבים ושונים. בחירת התג הפלואורסצנטי לשימוש תלויה בכך שיש קורא לוחות שיכול להשיג את פרמטרי העירור והפליטה הנכונים כדי להקליט את האות הפלואורסצנטי עבור התג הפלואורסצנטי שנבחר ובעל פלואורופור עם שינוי מועט או ללא שינוי בתפוקה הקוונטית בתנאי סביבה שונים. יתר על כן, FSEC אינו מוגבל לחלבונים פלואורסצנטיים, אך יכול לעבוד באותה מידה גם עם חלבון שסומן בצבע פלואורסצנטי. לדוגמה, ניתן להשתמש בצבע NTA, אשר ייקשר באופן חיובי למבנים של חלבון ממברנה מתויג היסטידין. יתר על כן, נוגדן מסומן פלואורסצנטית המסומן כימית בצבע פלואורסצנטי וספציפי לקשירת חלבון הממברנה המעניין או תג טיהור הכלול במבנה חלבון הממברנה יכול לסמן בעקיפין מטרה עבור FSEC.
בעת ביצוע סינון חומרי ניקוי באמצעות FSEC, ניתן לבחור אם המאגר המשמש להפעלת עמודת SEC צריך להכיל את חומר הניקוי התואם שבו החלבון היה מסיס או אם יש להשתמש בדטרגנט סטנדרטי בכל הריצות. ייצוג מדויק יותר של התנהגות החלבון יתקבל אם כל הניסוי יבוצע עם חומר הניקוי התואם לכל אורכו. עם זאת, זה יכול לגזול זמן רב ובזבזני של חומר ניקוי אם יש צורך לאזן מחדש את העמוד בחומר ניקוי חדש לפני כל ריצה. יתר על כן, מכיוון שהמטרה העיקרית של בדיקת חומרי ניקוי היא להשוות עקבות, המגמות יישארו בעקבות גם אם התנאים אינם אידיאליים. לפיכך, ניתן להגיע לפשרה לפיה החלבון מסיס בחומר הניקוי המעניין, אך הטור מופעל בחיץ סטנדרטי עם חומר ניקוי יחיד בכל הריצות (למשל, DDM)11, מה שיכול לחסוך זמן וחומרים מתכלים לחומרי ניקוי.
על ידי שינוי ציוד FLPC בשימוש, התפוקה של פרוטוקול FSEC ניתן להגדיל באופן משמעותי, ואת דרישת המדגם ניתן למזער. לדוגמה, מערכת FPLC או HPLC יכולה להיות מצוידת בדוגמית אוטומטית, עמודה אנליטית קטנה יותר של נפח מיטה (כגון עמודת SEC אנליטית של 3.2 מ"ל), וגלאי פלואורסצנטי מובנה לניטור עקבות FSEC רציפים ישירות מהעמודה. ההתקנה שתתקבל תאפשר לבצע יותר ריצות FSEC בפרק זמן קצר יותר ותסיר את שלב התוויית הידניים, ובכך תאפשר למספר רב יותר של תנאים להיבדק במסגרת זמן קצרה יותר. יתר על כן, דרישת הדגימה תצומצם עוד יותר, מכיוון שיהיה צורך להכין פחות דגימות ולהעמיס אותן על עמודת FSEC עבור כל ריצה. זה יפתח אפשרויות לצמצום תרבויות הביטוי לפורמט מבוסס לוחות, מכיוון שיידרש חומר כה מועט לניתוח.
חוזקות וחולשות של FSEC בהשוואה לשיטות אחרות החיסרון של FSEC הוא שיש לתכנן את מבני חלבון הממברנה כך שיציגו את התווית הפלואורסצנטית, ועם ההקדמה קיימת אפשרות קטנה שמיקום התווית עלול להפריע לתפקוד או לקיפול של חלבון הממברנה המעניין. בנוסף, פרוטוקול FSEC, כמתואר כאן, עוקב אחר המאפיינים של חלבון ממברנה בנוכחות ליזט התא, שהוא תערובת גסה של חלבונים. התנהגותו של חלבון ממברנה בסביבה זו עשויה להיות שונה מאשר כאשר חלבון הממברנה המעניין נתון לעמודת SEC מוכנה בסוף הטיהור כאשר הוא מבודד לחלוטין מחלבונים אחרים. יתר על כן, FSEC מספק מדד איכותי למדי של איכות החלבון. עם זאת, על ידי המרת עקבות FSEC למדד חד-פיזור, כמתואר בשלב 4.3.3 של הפרוטוקול, ניתן לקבל מדד כמותי של איכות החלבון.
FSEC אינה השיטה היחידה שניתן להשתמש בה בניתוח מוקדם של מבני חלבון ממברנה, תנאי מסיסות והרכב חיץ טיהור. לגישות החלופיות יש יתרונות וחסרונות על פני FSEC. לדוגמה, קיימות בדיקות יציבות תרמיות מבוססות פלואורופור, במיוחד השימוש בצבע 7-diethylamino-3-(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin (CPM)16,17. היתרון של שיטה זו הוא שבניגוד ל- FSEC, המספק מדד איכותי לאיכות החלבון, מבחני יציבות תרמית מספקים מדד כמותי בצורה של טמפרטורת התכה יחסית. יתר על כן, אין דרישה להכניס תג פלואורסצנטי על מבנה החלבון. עם זאת, החסרונות של בדיקות יציבות תרמית בהשוואה ל- FSEC הם שיש להשתמש בחלבון מטוהר וכי הבדיקה אינה תואמת את כל מבני החלבון, מכיוון שהיא מסתמכת על עמדות היתרון של שאריות ציסטאין טבעיות בחלבון המקופל.
שיטה נוספת שיש לה קווי דמיון הן למבחני FSEC והן למבחני יציבות תרמית מבוססי פלואורופור היא בדיקה המודדת את רגישות הטמפרטורה של חלבון ממברנה. בבדיקה זו, החלבון מאותגר בטמפרטורות שונות, והחלבון שנשאר בתמיסה לאחר זיהוי הצנטריפוגה. הזיהוי בשיטה זו נעשה במספר דרכים, כולל מדידת הפלואורסצנטיות בתמיסה18, הפלואורסצנטיות של רצועת ג'ל SDS-PAGE19, או עוצמת האות בכתם מערבי20. עם זאת, חסרון משמעותי של גישות אלה הוא כי הבדיקה היא מאוד אינטנסיבית עבודה נוטה רעש גבוה בתוצאות, כמו כל נקודת טמפרטורה בודדת יש לאסוף בנפרד.
לבסוף, ניתן להשתמש במספר טכניקות ביופיזיקליות מתקדמות יותר כדי להעריך את איכות חלבון הממברנה באופן דומה ל- FSEC, לדוגמה, ניתוח פיזור המושרה על ידי זרימה21, תרמופורזה מיקרוסקולית22, או SPR. למרות גישות חזקות מאוד, החיסרון של שיטות אלה הוא הדרישה למכשירים מיוחדים מאוד להריץ את הניתוחים.
לסיכום, FSEC מספק כלי רב ערך לשימוש בקמפיינים לייצור חלבון ממברנה, ולמרות שהוא אינו האפשרות היחידה, יש לו מספר יתרונות מובהקים על פני שיטות אחרות, כמפורט לעיל. אימות צולב של התוצאות על ידי בדיקות אורתוגונליות מומלץ תמיד, ואף אחת מהשיטות שנדונו לעיל אינה סותרת זו את זו.

כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC), הידועה גם בשם כרומטוגרפיית סינון ג'ל, משמשת בדרך כלל במדעי החלבונים1. במהלך SEC, חלבונים מופרדים בהתבסס על הרדיוס ההידרודינמי שלהם, שהוא פונקציה של גודל החלבון וצורתו2. בקצרה, הפרדה זו מושגת על ידי יישום דגימות החלבון תחת זרימה על מצע ארוז של חרוזים נקבוביים הפועלים כמסננת מולקולרית. החרוזים המשמשים הם לעתים קרובות צולבים עם טווח מוגדר של גדלי נקבוביות כדי לאפשר לחלבונים להיכנס או להיות מחוץ לנקבוביות החרוזים 3,4,5,6,7. חלבונים בעלי רדיוסים הידרודינמיים קטנים יותר מבלים חלק גדול יותר של זמן בתוך הנקבוביות, ולכן זורמים דרך המיטה הארוזה בקצב איטי יותר, בעוד שחלבונים גדולים יותר מבלים חלק גדול יותר מהזמן מחוץ לחרוזים (הנפח המוחרג) ונעים דרך המיטה הארוזה בקצב מהיר יותר. SEC יכול לשמש כשלב טיהור חלבון כאשר נעשה שימוש בטור הכנה1. כאשר נעשה שימוש בעמודה אנליטית, ניתן להשתמש ב-SEC כדי לנתח את איכות החלבון ותכונותיו2. לדוגמה, צברי חלבונים שעשויים להימצא בדגימה ולהצביע על חלבון באיכות ירודה נוטים להיות גדולים מאוד, כלומר הם נעים רק בנפח המוחרג, ולכן הם מדוללים מהעמודה בנקודה המוקדמת ביותר; אמצעי אחסון זה מכונה אמצעי אחסון ריק או ריק עמודה. יתר על כן, ניתן להשתמש בתקני משקל מולקולרי כדי לכייל את העמודה, מה שמאפשר אינטרפולציה של משקל מולקולרי משוער של החלבון המעניין מעקומה סטנדרטית.
בדרך כלל, ספיגת החלבון ב-280 ננומטר משמשת לניטור פליטת החלבון מעמודת אי הכללת גודל. זה מגביל את השימוש ב-SEC ככלי ניתוח עד שהחלבון המעניין יהיה נקי במידה רבה מחלבונים מזהמים, למשל, בשלב האחרון של טיהור החלבון. עם זאת, SEC פלואורסצנטי (FSEC) משתמש בחלבון בעל עניין המסומן באופן פלואורסצנטי. לכן, אות פלואורסצנטי יכול לשמש כדי לפקח באופן ספציפי על eution של חלבון עניין בנוכחות חלבונים אחרים או אפילו תערובות גסות 8,9. יתר על כן, מכיוון שאותות פלואורסצנטיים רגישים מאוד, ניתן לבצע ניתוח מוצלח על דגימות עם כמויות חלבון נמוכות במיוחד. החלבון המעניין מסומן לעתים קרובות באופן פלואורסצנטי על ידי הכללת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או תג GFP משופר (eGFP) במבנה הביטוי. לאחר מכן ניתן לנטר את האות הפלואורסצנטי על ידי עירור ב 395 ננומטר או 488 ננומטר וזיהוי הפליטה הפלואורסצנטית ב 509 ננומטר או 507 ננומטר עבור GFP או eGFP, בהתאמה10.
היתרון של שימוש באות פלואורסצנטי לניטור פליטת חלבונים מעמודת SEC הופך את FSEC לכלי רב ערך לניתוח דגימות חלבון ממברנות כאשר רמות הביטוי נמוכות במיוחד בהשוואה לחלבונים מסיסים. באופן מכריע, ניתן לנתח את האיכות והתכונות של חלבוני הממברנה ישירות לאחר המסיסות מליזטים גולמיים ללא צורך לייעל את תהליך הטיהור תחילה11,12. מסיבות אלה, FSEC יכול לשמש לניתוח מהיר של איכות חלבון הממברנה תוך בחינת הגורמים השונים שעשויים להידרש כדי לשפר את ההתנהגות של חלבון הממברנה בתמיסה. לדוגמה, מקובל לנסות מבנים רבים המכילים תגים שונים, חיתוכים, מחיקות, החדרות שותפי היתוך ומוטציות מייצבות כדי למצוא מבנה שאינו מצטבר לאחר חילוץ מהממברנה13,14. יתר על כן, בדיקת חיץ לקביעת חומר הניקוי, התוסף, הליגנד או הפולימר המספק את המצב המייצב ביותר עבור חלבון הממברנה יכולה להגדיר את הרכב החיץ הטוב ביותר לטיהור חלבונים או למתן יציבות לשימושים במורד הזרם, כגון בדיקות ביופיזיות או אפיון מבני.
לפיכך, המטרה הכוללת של שיטת FSEC היא לאסוף פרופיל אלוציה של עמודת SEC עבור חלבון קרום המטרה המעניין. יתר על כן, כאשר נעשה שימוש בפלואורסצנטיות, עקבות SEC אלה נאספות בנקודה המוקדמת ביותר האפשרית באופטימיזציה של המבנים והתנאים לפני כל טיהור ממושך. מעקב FSEC יכול לשמש ככלי השוואתי כדי לשפוט את הסבירות להצלחה של טיהור חלבון ממברנה עם תנאי חיץ שונים או מבנים חלבון הממברנה. בדרך זו, אוסף פרופילי FSEC יכול לשמש כתהליך איטרטיבי מהיר כדי להגיע לתכנון מבנה אופטימלי והרכב חיץ לפני ההשקעה מאמץ לייצר את כמויות החלבון הטהור הדרושות לשיטות ניתוח אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL and 5 mL plastic syringes&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Syringes for transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab201111</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes&#160;&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>344625&#160;</td>
			<td>Tubes for ultra-centrifuge rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>50 mL tubes for cell harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well blocks&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>15922302</td>
			<td>For collecting 0.2 mL SEC fractions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA&#160; V9-L loop valve</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29011358</td>
			<td>5 posiiton loop valve&#160; for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA F9-C fraction collector</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29027743</td>
			<td>6 position plate fraction collector for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29018224&#160;</td>
			<td>FPLC system for running the experiment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15828722&#160;</td>
			<td>Centrifuge for low-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end filling needles&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top vacuum filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10005490</td>
			<td>Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl hemisuccinate (CHS)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>CH210-5GM&#160;</td>
			<td>Additive for detergent solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable multichannel reseviour&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecyl maltoside (DDM)&#160;</td>
			<td>Glycon&#160;</td>
			<td>D97002-C-25g&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP protein standards</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K815-100</td>
			<td>eGFP standards for fluorescent calibration curve&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>11443297</td>
			<td>Glycerol for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10411451</td>
			<td>HEPES for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403842</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>NB-19-0055-5G&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular&#160; weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403841</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLA-130 ultra-centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>367114&#160;</td>
			<td>Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque 96-well flat-bottom micro-plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10656853</td>
			<td>96-well for reading fluorescent signal in plate reader&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-XP ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393315&#160;</td>
			<td>Centrifuge for high-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For adjusting the pH of buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Graphing software for plotting traces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary mixer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12027144&#160;</td>
			<td>Mixer for end over end mixing in the cold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10316943</td>
			<td>Sodium chloride for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10488790</td>
			<td>Sodium hydroxide for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax ID3 Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>735-0391</td>
			<td>Micro-plate reader capable of reading fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer plate</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For stirring buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene maleic acid (SMA)&#160;</td>
			<td>Orbiscope&#160;</td>
			<td>SMALP 300&#160;</td>
			<td>Polymer for detergent free extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28990944&#160;</td>
			<td>SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 &#176;C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16694-2-50-06</td>
			<td>For filtering and degassing buffers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography

במהלך הבהרה מבנית של חלבון ממברנה ואפיון ביופיזיקלי, מקובל לנסות מבנים חלבוניים רבים המכילים תגים שונים, חתכים, מחיקות, החדרות שותפי היתוך ומוטציות מייצבות כדי למצוא אחד שאינו מצטבר לאחר מיצוי מהממברנה. יתר על כן, בדיקת חיץ כדי לקבוע את חומר הניקוי, התוסף, הליגנד או הפולימר המספק את המצב המייצב ביותר עבור חלבון הממברנה היא פרקטיקה חשובה. האפיון המוקדם של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי מספק כלי רב עוצמה להעריך ולדרג מבנים או תנאים שונים ללא צורך בטיהור חלבונים, וכלי זה גם ממזער את דרישת הדגימה. חלבוני הממברנה חייבים להיות מתויגים באופן פלואורסצנטי, בדרך כלל על ידי ביטוי שלהם עם תג GFP או דומה. ניתן להמיס את החלבון ישירות מתאים שלמים ולאחר מכן להבהיר אותו בצורה גסה באמצעות צנטריפוגה; לאחר מכן, החלבון מועבר במורד עמודת אי הכללת גודל, ועקבות פלואורסצנטיות נאספות. כאן מוצגת שיטה להפעלת FSEC ונתוני FSEC מייצגים על מטרות GPCR קולטן ספינגוזין-1-פוספט (S1PR1) וקולטן סרוטונין (5HT2AR).

ראשית, נחקרו הטווח הדינמי והגבולות התחתונים של זיהוי eGFP עבור קורא הלוחות ששימש במחקר זה. תקן eGFP מטוהר של ריכוז ידוע דולל בנפח סופי של 50 μL ל-50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12.5 ng·μL−1, 6.25 ng·μL−1, 3.125 ng·μL−1, 1.5625 ng·μL−1, 0.78125 ng·μL−1 ו-0.390625 ng·μL−1, והפלואורסצנטיות נקראה באמצעות עירור של 488 ננומטר ופליטה של 507 ננומטר (איור 2) ). ניסוי זה הצביע על כך שלקורא הלוחות הייתה מגבלת זיהוי נמוכה יותר של 30 ננוגרם של חלבון המסומן ב-eGFP לכל באר וטווח דינמי של עד 500 ננוגרם של חלבון המסומן ב-eGFP לכל באר לפני רוויית האותות. אם נשתמש בערך עבור הגבול התחתון ובהנחה שאלוציית החלבון מוגבלת ל-0.33 מנפח העמודה, נדרש רק 1.28 מיקרוגרם של חלבון eGFP המסומן כחלבון מעניין עבור טעינת עמודת SEC על מנת שניתן יהיה להבחין באות FSEC ניתן לזיהוי.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig02.jpg"> איור 2: עקומת תקן eGFP. גרף פיזור של האות הפלואורסצנטי עבור תקן eGFP מטוהר מדולל ל- 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12.5 ng·μL−1, 6.25 ng·μL−1, 3.125 ng·μL−1, 1.5625 ng·μL−1, 0.78125 ו- 0.390625 ng·μL−1. (A) כל הדילולים מוצגים, כולל אלה עם האות הרווי. (B) גרף פיזור מוגדל הכולל רק את התקנים הכלולים בטווח הדינמי של קורא הלוחות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
שנית, עמודת 24 מ"ל ששימשה למחקר זה כוילה עם תקני משקל מולקולרי. תוך שימוש באותם תנאי חיץ וריצה ששימשו לניתוח FSEC, תקני המשקל המולקולרי דקסטרן כחול (>2,000 kDa), פריטין (440 kDa), אלדולאז (158 kDa), קונאלבומין (75 kDa) ואובלבומין (43 kDa) הוזרקו בנפרד ועברו דרך העמודה, ועקבות אלוציה נאספו בספיגה של 280 ננומטר. נפחי האלוציה שתועדו היו 8.9 מ"ל, 12.4 מ"ל, 15.2 מ"ל, 16.9 מ"ל ו-18 מ"ל, בהתאמה. כאשר נפחי אלוציה אלה הומרו ל-Kav (משוואה 1) ושורטטו כנגד משקלים מולקולריים של לוג, עקומה סטנדרטית יכולה להתאים. זה איפשר להעריך את המשקל המולקולרי של GPCRs שנבדקו במחקר זה באמצעות אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית (איור 3). לדוגמה, עקבות FSEC של קולטן הסרוטונין GPCR 2A (5HT2AR) לאחר מסיסות בחומר הניקוי DDM הצביעו על נפח elution של 13.4 מ"ל. נפח אלוציה 5HT2AR זה נופל בין נפחי אלוציה אלה שנרשמו עבור פריטין ואלדולאז ומספק משקל מולקולרי מוערך של כ -300 kDa. מבנה 5HT 2A R ששימש במחקר זה הוא בערך 50 kDa (כולל תג eGFP), כלומר אם מניחים ש- 5HT2AR הוא מונומרי, ניתן לייחס250kDa של משקל מולקולרי למיצלה דטרגנט DDM/שומנים. המשוואה להמרת נפחי אלוציה היא כדלקמן (משוואה 1):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64322/64322eq01.jpg" style="margin: auto;">(משוואה 1)
כאשר V e הוא נפח ה- e- elution, V 0 הוא אמצעי האחסון של ריק העמודה, ו- Vc הוא נפח העמודה הכולל.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig03.jpg"> איור 3: עקומת כיול של עמודת SEC באמצעות תקני משקל מולקולריים . (A) עקבות FSEC מייצגות של 5HT2AR המסיסות ב-DDM, כאשר מיקומי האלוטיון היחסיים של תקני המשקל המולקולרי מסומנים דקסטרן כחול (Void), פריטין, אלדולאז, קונאלבומין ואובלבומין. פריטין, אלדולאז, קונאלבומין ואובלבומין צבועים בירוק, סגול, אדום וציאן, בהתאמה. (B) עקומת כיול המשקל המולקולרי באמצעות מיקומי האלוציה של התקנים לאחר ההמרה ל-Kav (משוואה 1) המשורטטת כנגד המשקל המולקולרי של לוג (Mr). ה-Mr של 5HT2AR ב-DDM עבר אינטרפולציה מהעקומה באמצעות Kav ומוצג על העקומה (ריבוע כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לאחר מכן נעשה שימוש ב-FSEC כדי להעריך את האיכות והמאפיינים של קולטן GPCR sphingosine-1-phosphate (S1PR1)15. תאי חרקים המבטאים S1PR1 אנושי המתויג ב-GFP עובדו עבור FSEC כמתואר בפרוטוקול (איור 1).
ראשית, תנאי מיצוי הממברנות האופטימליים נחקרו על-ידי בדיקת הדטרגנטים DDM ו-LMNG כנגד מיצוי ללא חומרי ניקוי באמצעות SMA (איור 4A). מדד הפיזור החד-פעמי שימש להערכת איכות דגימת החלבון והיחס בין החלבון בחלל (~ 8 מ"ל שימור עמודות) בהשוואה למדגם החד-פיזור (שימור טורים של 14-15 מ"ל). הדגימה המסיסה ב- LMNG הציגה פרופיל FSEC מעולה עם צורת שיא מונומר טובה יותר ושיא צבירת חלבון נמוך יותר, מה שמצביע על כך שמסיסות וטיהור ב- LMNG היו התנאים המייצבים ביותר עבור חלבון ממברנה זה. לעומת זאת, הדגימה המסיסה ב-DDM הייתה בעלת פרופיל FSEC נמוך יחסית, עם שיא צבירה גדול יותר ושיא מונומרי רחב יותר, מה שמצביע על פיזור רב בדגימה.
שנית, ההשפעה של הוספת ליגנד על פרופיל FSEC נחקרה על ידי הוספת ספינגוזין-1-פוספט (S1P) לדגימה במהלך מסיסות. במקרה זה, DDM שימש כמגיב מסיסות, ועקבות FSEC של S1PR1 בנוכחות ובהיעדר S1P הושוו (איור 4B). הדגימה המסיסה, בנוכחות S1P, הראתה עקבות FSEC מעולים עם צבירה מופחתת. זה הצביע על כך שטיהור בנוכחות ליגנד היה יתרון לשיפור איכות דגימת החלבון על ידי ייצוב הקולטן בתמיסה, אך היה גם יתרון גם כסמן חלופי לפעילות החלבון, שכן התוצאות הצביעו על כך שהחלבון מקופל כראוי וכשיר לקשירת ליגנדים.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig04.jpg"> איור 4: FSEC באמצעות תמצית גולמית של S1PR 1 המציינת תנאי מיצוי אופטימליים של הממברנה וקשירת ליגנד. (A) השוואה בין עקבות FSEC של S1PR1 המסיסים בקו-פולימר חומצה סטירן-מאלית (SMA; כחול), לאוריל מלטוז נאופנטיל גליקול (LMNG; אדום), או דודציל מלטוזיד (DDM; שחור). (B) השוואה של עקבות FSEC של S1PR 1 המסיס ב- DDM בנוכחות (אדום) או היעדרו (שחור) של האגוניסט ספינגוזין-1-פוספט (S1P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
FSEC שימש גם כדי לחקור את היציבות ארוכת הטווח של 5HT2AR בתנאים שונים. 5HT 2A R אנושי מתויג GFP הוסס מקרום תאי חרקים בפולימר דטרגנט (DDM) אוSMAונותח על-ידי FSEC בכמה נקודות זמן לאחר אחסון ב-4°C או בטמפרטורת החדר (איור 5). לאחר מספר ימי דגירה, 5HT2AR ב-DDM הראה ירידה משמעותית בגובה השיא המונומרי בשתי הטמפרטורות, ונצפו עליות משמעותיות בשיא המצרפי. לעומת זאת, 5HT2AR בחלקיק שומנים SMA (SMALP) לא הראה ירידה משמעותית בגובה השיא המונומרי במהלך הניסוי, מה שמצביע על כך שהחלבון ב-SMALP נשאר יציב למשך זמן רב יותר, אפילו בטמפרטורות שליליות. זה עשוי להיות חשוב כאשר בוחנים הכנות חלבוניות ליישומים ביופיזיים במורד הזרם, כגון ניסויי תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), שעבורם יש דרישה שהדגימה תהיה יציבה ופעילה לאורך תקופת זמן ארוכה לצורך סיום מוצלח של ניסויי הקשירה.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig05.jpg"> איור 5: השפעת הזמן והטמפרטורה על האיכות של 5HT 2A R שמופקים מהממברנה באמצעות DDM או SMALP, כפי שנותח על-ידי FSEC. (A) עקבות FSEC מייצגים של 5HT2AR מסיסים ב-DDM ומאוחסנים בטמפרטורת החדר למשך יום אחד (אפור), יומיים (ירוק) או 5 ימים (כחול). (B) היסטוגרמות של גובה השיא המונומרי המנורמל עבור דגימות DDM המאוחסנות ב- 4 ° C (כחול) או RT (ירוק) בהשוואה לדגימות SMALP המאוחסנות ב- 4 ° C (אפור) או RT (שחור). קווי שגיאה מייצגים את ה- SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לביצוע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי (FSEC) על חלבוני ממברנה כדי להעריך את איכותם לניתוח פונקציונלי ומבני במורד הזרם. מוצגות תוצאות FSEC מייצגות שנאספו עבור מספר קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) בתנאים מסיסים בדטרגנטים וללא חומרי ניקוי.

הערכה מהירה של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

פרופיל SEC הוא דרך רבת עוצמה לנתח את איכות החלבון. המטרה היא לאסוף פרופיל SEC עבור חלבון ממברנה באמצעות פלואורסצנטיות, אשר יכול להשפיע על איכות הדגימה. FSEC משתמש בכמויות קטנות של דגימה וניתן לבצע אותו לטיהור, הוא פשוט יחסית, וניתן לבצע אותו על ציוד הזמין במעבדות רבות.מי שידגים את ההליך יהיה ג'ק רייט, מדען חלבונים בכיר מחברת Peak Proteins. התחילו בהכנת פלטות התאים על ידי הפשרת פלטת התאים המאוחסנת במינוס 80 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, או עד שהדגימה כבר לא קפואה. העבר את הדגימה מיד לקרח.כדי להשהות מחדש ולהמיס את הדגימה, הוסף שני מיליליטר של מאגר המסיסות ללוח התא. יש לדגור עם היפוך מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן הוסיפו חומר ניקוי מעורבב מראש כדי לקבל ריכוז סופי של 1%דודציל מלטוזיד, או DDM, ו-0.1% כולסטרול המיסוקצינאט, או CHS.יש להמיס במשך 30 דקות עם היפוך מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע שלב צנטריפוגה במהירות נמוכה, צנטריפוגה את הדגימה בצנטריפוגה על ספסל באמצעות דלי מתנודד החוצה וצנטריפוגה ב 2000 גרם במשך 15 דקות. לאחר מכן בצע צנטריפוגה במהירות גבוהה על ידי העברת הסופרנאטנט מהצנטריפוגה במהירות נמוכה לצינורות אולטרה צנטריפוגה באמצעות מחט קהה המחוברת למזרק חמישה מיליליטר.הקפידו לא להפריע לפלטת הצבעים. לאחר איזון זוגות הצינורות, מניחים אותם ברוטור אולטרה-צנטריפוגה בזווית קבועה וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 250, 000 גרם. הכן את הכרומטוגרפיה הנוזלית החלבונית המהירה, או מערכת FPLC על ידי מילוי המערכת בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, או חיץ SEC, וטיהור משאבות האוויר.חבר את עמודת ה-SEC ל-FPLC, וודא שאף אוויר לא נכנס לעמודה. יש לאזן מראש את עמודת ה-SEC על ידי שטיפתה בנפחי עמודות של פי 1.5 של מים מזוקקים ומסוננים ברמת מעבדה, ולאחר מכן נפחי עמודות של פי 1.5 של חיץ SEC בקצב הזרימה והלחץ המומלצים עבור העמודה. כדי להריץ את ניסוי ה-SEC, העבירו את הסופרנאטנט משלב הצנטריפוגה במהירות גבוהה למזרק של מיליליטר באמצעות מחט קהה המחוברת למזרק.הגדר את לולאת הדגימה להיטען. מלא לולאת דגימה של 500 מיקרוליטר על ידי הזרקת 600 עד 700 מיקרוליטר של הדגימה מהמזרק ליציאת הטעינה. לאחר מכן, הזריקו את הדגימה מהלולאה לתוך העמודה על ידי ריקונה עם ארבעה מיליליטר של חיץ SEC בקצב הזרימה והלחץ המומלצים.הפעל את העמודה באותו קצב זרימה עד למעבר של פי 1.5 מנפח המאגר, והתחל לאסוף 90 שברים של 0.2 מיליליטר לאחר מעבר של פי 0.25 מנפח העמודה. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 90 מיקרוליטר של מים מזוקקים באיכות מעבדה ממאגר לכל באר של צלחת אטומה, שטוחה, 96 בארות. לאחר מכן מעבירים את 10 המיקרוליטרים של הדגימות מצלחת 96 בארות לצלחת האטומה, בעלת התחתית השטוחה, 96 בארות, ומניחים את צלחת הבאר בקורא צלחות.עבור GFP המסומן פלואורסצנטי, et את העירור קרוב ככל האפשר ל 488 ננומטר ולזהות את הפליטה הפלואורסצנטית קרוב ככל האפשר ל 507 ננומטר לפני מדידת האות. חקירת הטווח הדינמי והגבולות התחתונים של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר, או זיהוי EGFP עבור קורא הלוחות, הצביעה על כך שלקורא הלוחות היה גבול זיהוי נמוך יותר של 30 ננוגרם וטווח דינמי של עד 500 ננוגרם חלבון המסומן בתווית EGFP לכל באר לפני רוויית האותות. המרת נפחי האלוטיון לקו והתאמתם כנגד משקלים מולקולריים של לוג אפשרה להעריך את המשקל המולקולרי של הקולטנים המצמדים לחלבון G על ידי אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית.תנאי מיצוי הממברנה האופטימליים נחקרו על ידי בדיקת DDM ולאוריל מלטוז נאופנטיל גליקול כנגד מיצוי ללא חומרי ניקוי עם קופולימר חומצה זכרית סטירן. ההשפעה של הוספת ליגנד על פרופיל הכרומטוגרפיה של גודל הפלואורסצנטי נחקרה על ידי הוספת ספינגוזין-1-פוספט, או S1P, לדגימה במהלך מסיסות. הדגימה המסיסה, בנוכחות S1P, הראתה עקבות עדיפים עם צבירה מופחתת.חקירת היציבות ארוכת הטווח של קולטן סרוטונין 5HT2AR בתנאים שונים הצביעה על כך שהחלבון בחלקיקי השומנים של חומצה זכרית סטירן נשאר יציב למשך זמן רב יותר, אפילו בטמפרטורות שליליות. הזמן בין נקודת המסיסות לבין העברת המדגם בטור ה-SEC הוא קריטי לזמן. אסור שיהיו הפסקות, ויש לשמור על הדגימה קרה.לאחר FSEC, תושג הבנה של המבנה, חומר הניקוי או החיץ הטובים ביותר. זה מאפשר אופטימיזציה של טיהור חלבונים ותומך באפיון ביופיזי ומבני במורד הזרם.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...