Name: rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography
Uploaded: 2023-01-06T13:05:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Vi vil gjerne anerkjenne hjelp og støtte fra hele Peak Proteins-teamet. Fra cellevitenskapsteamet vil vi gjerne anerkjenne Ian Hampton for hans verdifulle innsikt og veiledning i insektcelleuttrykk. Vi vil gjerne takke Abbott for å gi ressurser og mulighet til å forfølge dette prosjektet.

1. Klargjøring av vaskemiddel og buffer for FSEC
<ol><li>Forbered en vaskemiddelløsning.<ol><li>For å tilberede en 20 ml stamløsning, veier du 4 g dodecylmaltosid (DDM) pulver og 0,4 g kolesterylhemisuccinat (CHS) pulver, og gjør det til 20 ml med laboratoriedestillert H2O.</li>
		<li>Etter tilsetning av alle komponentene, bland med ende-over-ende-inversjon ved 4 °C til komponentene er fullstendig løseliggjort. Ende-over-ende-blanding over natten ved 4 °C anbefales.</li>
		<li>Aliquot og oppbevar vaskemiddellagrene ved -20 °C til bruk. Hvis skjeftet må brukes umiddelbart, må du oppbevare vaskemiddelet på is. MERK: Standard vaskemiddelmateriell som ble brukt i dette arbeidet var en 20% (w / v) DDM og 2% (w / v) CHS-blanding (se materialfortegnelse). Ulike vaskemidler kan brukes (f.eks. laurylmaltose neopentylglykol; LMNG), eller bruk av vaskemiddelfri ekstraksjon med polymerer som styren-maleinsyre (SMA) kan testes. Dette må avgjøres ved utforming av de eksperimentelle forholdene som skal testes.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered en oppløselighetsbuffer.<ol><li>Forbered en oppløsningsbuffer ved å kombinere riktig vekt eller volum av komponentene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v / v) glyserol og 1x proteaseinhibitorcocktail (se materialtabell) i et beger. MERK: I denne studien var fremstillingen av 50 ml oppløselighetsbuffer tilstrekkelig til å behandle fem prøver.</li>
		<li>Tilsett et 0,7 volum (f.eks. 35 ml hvis du lager 50 ml buffer) av laboratoriedestillert H2O til begeret.</li>
		<li>Bland på en magnetomrører, og bruk en pH-måler, juster bufferens pH til 7,5 ved dråpevis tilsetning av konsentrert NaOH.</li>
		<li>Bruk en målesylinder til å fylle på bufferen til det endelige nødvendige volumet med destillert H2O av laboratoriekvalitet.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered SEC-løpende buffer.<ol><li>Forbered SEC-løpebufferen ved å kombinere riktig vekt eller volum av komponentene for å oppnå en endelig konsentrasjon på 100 mM HEPES, 150 mM NaCl og 10% (v / v) glyserol i et beger. MERK: I denne studien var forberedelse av 600 ml SEC-buffer tilstrekkelig for å kjøre fem prøver.</li>
		<li>Tilsett et 0,7 volum (f.eks. 420 ml hvis du lager 600 ml buffer) av laboratoriedestillert H2O til begeret.</li>
		<li>Bland på en magnetomrører, og bruk en pH-måler, juster bufferens pH til 7,5 ved dråpevis tilsetning av konsentrert NaOH.</li>
		<li>Bruk en målesylinder til å fylle på bufferen til det endelige nødvendige volumet med destillert H2O av laboratoriekvalitet.</li>
		<li>Filtrer SEC-bufferen gjennom et 0,45 μm porefilter med flasketopp under vakuum (se materialfortegnelse).</li>
		<li>Når bufferen har passert gjennom filteret, avgasser den ved å la den ligge under vakuumet til det ikke oppstår flere bobler når den ristes.</li>
		<li>Legg til en endelig konsentrasjon på 0,03 % (w/v) DDM og 0,003 % (w/v) CHS til SEC-bufferen ved å tilsette det nødvendige volumet av vaskemiddellageret klargjort i trinn 1 (f.eks. 0,9 ml hvis du lager 600 ml SEC-buffer).</li>
		<li>Forkjøl bufferen før bruk. MERK: Ulike buffere kan brukes avhengig av forholdene som testes. For eksempel, hvis du tester effekten av forskjellige vaskemidler på proteinet av interesse, vil det ideelt sett måtte lages en buffer med samme vaskemiddel som den som brukes til å solubilisere proteinet. Ved testing av vaskemiddelfrie forhold med SMA, bør vaskemiddel utelates helt fra SEC-bufferen. Se imidlertid diskusjonsdelen for mer informasjon om protokollendringer for vaskemiddelscreening.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Prøveklargjøring for FSEC
<ol><li>Forbered cellepelletsene. MERK: Utgangspunktet for analysen er å høste cellepelleten fra en suspensjonscelleekspresjonskultur av det GFP-merkede (eller annet fluorescerende merket) proteinet av interesse. De nøyaktige tidspunktene og betingelsene for høsting vil avhenge av proteinet som uttrykkes, cellelinjen som brukes, forholdene som cellene som har blitt dyrket i, og metoden der proteinuttrykk er indusert. Disse detaljene er utenfor omfanget av denne protokollen. I denne studien ble det brukt 0,5-1 g Sf21 cellepellet per tilstand som skulle testes, tilsvarende 25-50 ml kultur 2-3 dager etter infeksjon med ca. 4 x 106 levedyktige celler/ml av en 1:20 fortynning av P2 baculovirus. Vær oppmerksom på at protokollen beskrevet her er testet og funnet å fungere like godt med lignende våtvekter av cellepellets fra andre eukaryotiske cellelinjer (f.eks. HEK293E).<ol><li>Når cellene fra suspensjonskulturene er klare til å høste, overfør 25-50 ml kulturalikoter til 50 ml koniske rør.</li>
		<li>Motvekt rørene, og bruk en stasjonær sentrifuge i en utsvingbar bøtte (se materialtabellen) ved 2000 x g i 15 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene.</li>
		<li>Fjern og kast dyrkningssupernatanten ved å vippe den forsiktig bort, eller bruk en 50 ml pipet med pipetfyller hvis cellepelleten er spesielt løs.</li>
		<li>Hvis cellene skal brukes umiddelbart til analyse, legg cellepelleten på is og fortsett direkte til trinn 5. Hvis cellene skal lagres for senere bruk, fryser du cellene ved å plassere dem ved -80 °C.</li>
		<li>Hvis cellepelleten har vært lagret ved -80 °C, tines den raskt ved å inkubere den ved romtemperatur i 15 minutter eller til prøven ikke lenger er frossen. Flytt prøven umiddelbart til is etter dette trinnet.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspender og oppløselig prøven.<ol><li>Tilsett 2 ml av oppløselighetsbufferen (trinn 1,2) til cellepelleten.</li>
		<li>Inkuber med ende-over-ende-inversjon ved 4 °C i 15-30 minutter til homogen.</li>
		<li>Tilsett ferdigblandet vaskemiddellager (trinn 1.1) (f.eks. 100 μL 20 % DDM/2 % CHS-lager) for en endelig konsentrasjon på 1 % DDM/0,1 % CHS.</li>
		<li>Løselig i 30 minutter med ende-over-ende-inversjon ved 4 °C. MERK: Om ønskelig kan flere forhold testes parallelt. Antall parallelle prøver som kan behandles samtidig, vil avhenge av det tilgjengelige systemet for å kjøre SEC-eksperimentet. I oppsettet som er beskrevet her, var det mulig å behandle opptil fem prøver om gangen.</li>
	</ol></li>
	<li>Utfør et sentrifugeringstrinn med lav hastighet.<ol><li>Sentrifuger prøven i en forkjølt (4 °C) stasjonær sentrifuge i en utsvingbar bøtte ved 2000 x g i 15 minutter.</li>
	</ol></li>
	<li>Utfør et høyhastighets sentrifugeringstrinn.<ol><li>Overfør supernatanten forsiktig fra sentrifugeringen i lav hastighet til ultrasentrifugeringsrør (f.eks. 0,5-2 ml rør) ved å bruke en butt nål festet til en 5 ml sprøyte, og pass på at du ikke forstyrrer pelleten fra sentrifugeringen i lav hastighet.</li>
		<li>Balanser rørpar til innenfor 0,05 g, og plasser dem i en fast vinklet ultrasentrifugeringsrotor (se materialtabell).</li>
		<li>Sentrifuge ved 4 °C i 30 minutter ved 250 000 x g.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Størrelse ekskluderingskromatografi (SEC)
<ol><li>Forbered det raske proteinvæskekromatografisystemet (FPLC), og sett kolonnen i balanse.<ol><li>Forbered systemet etter produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse), for eksempel ved å fylle systemet med SEC-buffer og rense pumpene for luft.</li>
		<li>Koble SEC-kolonnen til FPLC, slik at ingen luft kommer inn i kolonnen. Dette oppnås ved å påføre tilbaketrykk på SEC-kolonnen med en sprøyte fylt med vann (festet til bunnen av kolonnen) for å utføre en drop-to-drop-forbindelse med strømningsbanen til FPLC-systemet.</li>
		<li>Pre-balansere SEC-kolonnen ved å vaske den først i 1,5 kolonnevolumer (36 ml for en 24 ml kolonne) av laboratoriedestillert og filtrert H2O, etterfulgt av 1,5 kolonnevolumer av SEC-buffer ved anbefalt strømningshastighet og trykk for kolonnen (se materialfortegnelse). MERK: FPLC-systemet som ble brukt i denne studien for å utføre FSEC, var i et kaldt miljø og hadde en fem-posisjons sløyfeventil og en seks-posisjons platefraksjonskollektor montert. Dette oppsettet gjør at fem prøver kan lastes inn og kjøres sekvensielt nedover samme kolonne på en automatisert måte uten å kreve manuell inngripen mellom kjøringene. For å kjøre SEC-eksperimentene ble det brukt en kommersielt tilgjengelig ferdigpakket 24 ml kolonne (se materialtabell), som inneholdt en harpiks som tillot proteiner i molekylvektområdet 10-600 kDa å bli løst. Hvis proteinet av interesse er spesielt stort, kan en alternativ kolonnematrise brukes i stedet, noe som tillater separasjon av proteiner opp til 5000 kDa i molekylvekt. Vær oppmerksom på at tilstedeværelsen av vaskemiddel / lipid micelle vil øke den totale størrelsen på membranproteinet med >150 kDa, avhengig av protein og vaskemiddel som brukes.</li>
	</ol></li>
	<li>Bruk eksemplet på kolonnen, og kjør SEC-eksperimentet.<ol><li>Overfør supernatanten fra sentrifugeringstrinnet i høy hastighet til en 1 ml sprøyte ved hjelp av en butt kanyle festet til sprøyten. Dette muliggjør prøveutvinning fra sentrifugerøret uten å forstyrre pelleten.</li>
		<li>Angi at prøvesløyfen skal lastes inn. Overfyll en 500 μL prøvesløyfe ved å injisere 600-700 μL av prøven fra sprøyten inn i lasteporten. Avhengig av systemet som brukes, kan dette lastetrinnet programmeres inn i metoden for å sikre at ingen feil blir gjort.</li>
		<li>Under metoden injiseres prøven fra sløyfen i kolonnen ved å tømme den med 4 ml SEC-buffer ved anbefalt strømningshastighet og trykk for kolonnen (se materialfortegnelse).</li>
		<li>Kjør kolonnen med samme strømningshastighet til 1,5 kolonnevolumer (36 ml for en 24 ml kolonne) av bufferen har gått ned.</li>
		<li>Ved 0,25 av kolonnevolumet (6 ml for en 24 ml kolonne), begynn å samle 0,2 ml fraksjoner for å samle 90 fraksjoner. MERK: Siden tomromsvolumet i kolonnen forventes å være 0,3 kolonnevolumer, vil innsamlingen av fraksjoner umiddelbart før dette sikre at elueringen av alt proteinet overvåkes, inkludert protein som er tilstede i tomromsvolumet.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Fluorescerende sporinnsamling og analyse
<ol><li>Overfør prøvene fra fraksjonskollektoren (trinn 3.2.5) til en 96-brønnsplate, og les det fluorescerende signalet.<ol><li>Før du tar en fluorescensavlesning, fortynn de innsamlede prøvene. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 90 μL destillert H2O av laboratoriekvalitet fra et reservoar til hver brønn i en ugjennomsiktig flatbunns 96-brønnplate (se materialtabell).</li>
		<li>Hvis fraksjoner ble samlet inn i en 96-brønnblokk i trinn 3.2.5, bruk en flerkanalspiperte til å overføre 10 μL av SEC-fraksjonene fra blokken til den ugjennomsiktige platen med flat bunn 96-brønn, og bland ved å pipettere opp og ned. Ellers, hvis SEC-fraksjoner ble samlet inn i individuelle rør i trinn 3.2.5, overfør 10 μL av hver fraksjon til den ugjennomsiktige platen med flat bunn 96-brønn en etter en, og pipetter opp og ned hver gang for å blande prøvene.</li>
		<li>Plasser den ugjennomsiktige platen med flat bunn 96-brønn i plateleseren, og mål fluorescensen. Hvis GFP er fluorescerende etiketten (brukt her), sett eksitasjonen så nært som mulig til 488 nm, og oppdag fluorescerende utslipp så nært som mulig til 507 nm. MERK: Fortynningen som kreves før fluorescensavlesningen tas, vil avhenge av den totale mengden protein av interesse som er tilstede i uttrykkskulturen og følsomheten til plateleseren som brukes. I eksemplene vist i denne studien ble prøvene fortynnet 10 ganger i vann. Som et utgangspunkt bør fraksjonene fortynnes 5-10 ganger i vann eller buffer før deteksjon. Hvis det registrerte FSEC-sporsignalet er spesielt lavt, kan mindre fortynninger eller til og med en ufortynnet prøve brukes i stedet. Enheten som ble brukt til deteksjon i denne studien var en plateleser som var i stand til eksitasjon ved 488 nm og detektering av fluorescerende utslipp ved 507 nm (se materialtabell).</li>
	</ol></li>
	<li>Plott FSEC-sporene.<ol><li>Eksporter dataene fra plateleseren i et RAW-format (RAW-tekst eller en fil med kommadelte verdier). Disse rådataene vil bli plottet på Y-aksen til FSEC-sporet.</li>
		<li>For X-aksen beregner du volumet der hver fraksjon ble samlet. Den første brønnen må være elueringsvolumet der den første fraksjonen ble samlet inn for å ta hensyn til fraksjoneringsforsinkelsen (6 ml i dette eksemplet). Fraksjonene etter dette må sekvensielt øke med det oppsamlede fraksjonsvolumet (0,2 ml i dette eksemplet).</li>
		<li>Når dataene for X-akse og Y-akse er beregnet, kopierer og limer du inn dataene i grafikkprogramvaren (se Materialfortegnelse) for å plotte det fluorescerende signalet i hver brønn mot volumet det eluerte fra kolonnen. MERK: Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av trinnene som kreves for å kjøre et FSEC-eksperiment.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser FSEC-sporene.<ol><li>Vurder mengden proteineluering ved voidvolumet (ca. 8 ml for en 24 ml kolonne), noe som indikerer at proteinet er veldig stort i størrelse og sannsynligvis er utfoldet / aggregert.</li>
		<li>Vurder mengden protein som eluerer i senere topper, noe som indikerer foldet protein. Dette forventes å være mellom 10 ml og 16 ml for en 24 ml kolonne, avhengig av proteinstørrelsen (når assosiert med et vaskemiddel / lipid micelle). Vær nøye med toppformen, spesielt hvis det er en bred eller delt topp som spenner over større enn 3-4 ml (for en 24 ml kolonne), da dette indikerer en polydisperseprøve.</li>
		<li>Beregn forholdet mellom den monomere topphøyden og tomrommets topphøyde ved å dele det maksimale signalet som er registrert i monomertoppen med det maksimale signalet i tomrommet. MERK: Denne verdien representerer monodispersitetsindeksen og tillater et kvantitativt mål på proteinkvalitet; Større verdier indikerer best mulig kvalitet, mens verdier under 1 indikerer problematiske prøver, da de har mer aggregert protein enn foldet protein.</li>
		<li>Hvis flere FSEC-kjøringer skal sammenlignes, og den viktigste funksjonen er mengden monomer i hvert tilfelle, plotter du sporene som råsignalet som registreres av plateleseren (f.eks. RFU). MERK: Hvis en sammenligning av mengden monomer sammenlignet med det utfoldede proteinet er viktigere, må signalet normaliseres til en prosentandel av det totale signalet ved å bruke minimums- og maksimumsavlesningene i sporet, noe som vil fremheve forskjeller i forholdet mellom aggregert og monomert protein mellom sporene.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk fremstilling av trinnene som kreves for å kjøre et FSEC-eksperiment. (1) Celler som uttrykker det fluorescerende merkede proteinet av interesse, blir solubilisert. (2) Den grove løseliggjøringen avklares først med et spinn i lav hastighet, etterfulgt av (3) et høyhastighetsspinn. (4) Den klargjorte prøvesupernatanten lastes og kjøres på en passende SEC-kolonne, og (5) fraksjonene samles inn. (6) Prøver av fraksjonene overføres til en 96-brønnsplate, og et GFP-fluorescerende signal detekteres ved hjelp av en plateleser for å (7) plotte FSEC-sporet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<ol>
	<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography:+Rules+of+thumb,+limitations,+and+troubleshooting.">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+protein+molecules+at+the+nanometer+level+determined+by+sedimentation,+gel+filtration,+and+electron+microscopy.">Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy.</a> Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+and+estimation+of+their+relative+molecular+sizes+by+the+use+of+columns+of+starch+in+water.">The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water.</a> Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+on+the+basis+of+their+molecular+weights,+using+columns+of+starch+and+water.">The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water.</a> Biochemical Journal. 60 (4), (1955).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+protein+mixtures+on+columns+of+granulated+agar.">Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).</li><li>Hjert&#233;n, S., Mosbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Molecular-sieve&amp;#34;+chromatography+of+proteins+on+columns+of+cross-linked+polyacrylamide.">34;Molecular-sieve&amp;#34; chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide.</a> Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).</li><li>Porath, J., Flodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+filtration:+A+method+for+desalting+and+group+separation.">Gel filtration: A method for desalting and group separation.</a> Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+mutations+thermostabilize+G-protein-coupled+receptors.">How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).</li><li>Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+bottlenecks+in+the+membrane+protein+structural+biology+pipeline.">Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).</li><li>Hanson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335 (6070), 851-855 (2012).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+fluorescent+thermal+stability+assay+for+membrane+proteins.">Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostability+assays:+A+generic+and+versatile+tool+for+studying+the+functional+and+structural+properties+of+membrane+proteins+in+detergents.">Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents.</a> Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).</li><li>Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+thermal-shift+screen+reveals+specific+lipid+preferences+of+eukaryotic+and+prokaryotic+membrane+proteins.">An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).</li><li>Harborne, S. P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMPROvER:+The+Integral+Membrane+Protein+Stability+Selector.">IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).</li><li>Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+thermostability+of+membrane+proteins+by+western+blotting.">Defining thermostability of membrane proteins by western blotting.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).</li><li>Pedersen, M. E., &#216;stergaard, J., Jensen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+dispersion+analysis+(FIDA)+for+protein+quantification+and+characterization.">Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).</li></ol>

Peak Proteins er en oppdragsforskningsorganisasjon som tilbyr proteinuttrykk, rensing, massespektrometri og strukturell bestemmelse mot betaling.

De generiske systematiske tilnærmingene for tilstandsscreening med FSEC som presenteres her, tillater rask optimalisering av oppløselighets- og renseparametere for produksjon av membranproteiner. Dette betyr at stabile og funksjonelt aktive membranproteiner raskt kan produseres for biofysiske og strukturelle studier. Videre kan FSEC kjøres ved hjelp av laboratorieutstyr som sannsynligvis allerede er på plass i membranproteinlaboratorier, og det er derfor ikke krav om kjøp av et spesialinstrument for å kjøre analysene.
Kritiske skritt Tiden det tar fra solubiliseringspunktet fra celler i vaskemiddel til det punktet hvor prøven sendes nedover SEC-kolonnen (trinn 2.1.5-3.2.5) er tidskritisk, og det må ikke være noen pauser mellom disse trinnene. Alle trinnene bør utføres ved 4 °C eller på is, og tiden det tar å utføre disse trinnene må holdes på et minimum som mulig. Disse tids- og temperaturbegrensningene er nødvendige for å registrere FSEC-profilen for membranproteinet før potensiell utfolding eller nedbrytning. Etter at membranproteinet er solubilisert, er det større risiko for utfolding, aggregering og nedbrytning, selv ved 4 °C. Ideelt sett bør alle prøver som FSEC-sporene skal sammenlignes for, passere SEC-kolonnen i samme tid etter oppløselighetstrinnet. I praksis er dette vanskelig, spesielt hvis prøvene sendes sekvensielt ned i en enkelt kolonne, men det er mulig å samle opptil fem SEC-spor innen 3 timer fra hverandre, og i denne tidsrammen bør det ikke være betydelig nedbrytning.
Feilsøking Hvis det ved utførelse av FSEC-eksperimentet er lavt eller ingen fluorescerende signal, er det mulig at membranproteinet av interesse ikke har uttrykt den valgte cellelinjen, har svært lavt uttrykk for den valgte cellelinjen, eller ikke har blitt solubilisert i det valgte vaskemiddelet. Hvis prøvene ble fortynnet før innsamling av fluorescenssignalet og registrering av FSEC-sporet, ville et enkelt første skritt være å prøve en lavere fortynning eller ingen fortynning av SEC-fraksjonene. Hvis dette fortsatt ikke gir et tolkbart FSEC-spor, bør uttrykket og oppløseliggjøringen av proteinet kontrolleres.
Analysen av proteinuttrykk kan oppnås ved å kontrollere fluorescensen av prøven etter trinn 2.2.2. Hvis det er et veldig lavt eller ingen fluorescerende signal fra denne prøven (f.eks. et signal veldig nær bakgrunnen), er det sannsynligvis et problem med proteinuttrykket. Det kan tas skritt for å forbedre ekspresjonsnivåene av membranproteinet, for eksempel å bytte til en alternativ cellelinje eller justere vekstbetingelsene, induksjonen av ekspresjon og tiden mellom induksjonen / infeksjonen / transfeksjonen og høstingen. Imidlertid kan spesielt dårlig proteinuttrykk indikere et ustabilt membranprotein og dermed et dårlig konstruksjonsvalg.
Hvis uttrykket er kontrollert og det er et klart fluorescerende signal over bakgrunnen før FSEC, kan oppløselighetseffektiviteten kontrolleres ved å måle det gjenværende fluorescerende signalet til prøven etter trinn 2.4.3 (løselig membranprotein) sammenlignet med prøven etter trinn 2.2.2 (totalt protein). Det er vanlig at oppløselighetseffektiviteten er 20% -30% og fortsatt tillater vellykket analyse og rensing av membranproteinet. Imidlertid, hvis oppløselighetseffektiviteten er mindre enn 20%, kan det være nødvendig med et annet vaskemiddel for oppløseliggjøring eller forskjellige oppløselighetsforhold. Hvis forsøk på å forbedre oppløseliggjøringen ikke lykkes, kan dette indikere et spesielt ustabilt membranprotein og dermed et dårlig konstruksjonsvalg.
Hvis en veldig sen eluerende topp observeres i FSEC-sporet (f.eks. 18-24 ml), indikerer dette at det fluorescerende proteinet har en proteinmolekylvekt som er mye lavere enn forventet. Dette kan skyldes at membranproteinet av interesse brytes ned, noe som resulterer i "fri" GFP. Man bør sjekke om proteinet er intakt før og etter oppløseliggjøring ved bruk av GFP-fluorescens i gel. Hvis proteinet av interesse ser ut til å være nedbrytende eller blir proteolysert, kan mengden proteaseinhibitor økes to ganger til fire ganger. Imidlertid kan en høy følsomhet for proteaser eller degradert protein selv før solubilisering indikere et spesielt ustabilt protein og dermed et dårlig konstruksjonsvalg.
Modifikasjoner og videre anvendelser av FSEC Vanligvis er fluorescerende tag som brukes i FSEC GFP eller eGFP, som beskrevet i denne protokollen. Imidlertid er mange forskjellige fluorescerende proteinkoder tilgjengelige. Valget av fluorescerende tag som skal brukes, avhenger av å ha en plateleser som kan oppnå de riktige eksitasjons- og utslippsparametrene for å registrere det fluorescerende signalet for den valgte fluorescerende taggen og ha en fluorofor med liten eller ingen endring i kvanteutbyttet under forskjellige miljøforhold. Videre er FSEC ikke begrenset til fluorescerende proteiner, men kan også fungere like godt med et protein som er merket med et fluorescerende fargestoff. For eksempel kan et NTA-fargestoff brukes, noe som gunstig vil binde seg til histidinmerkede membranproteinkonstruksjoner. Videre kan enten et fluorescerende merket antistoff kjemisk merket med et fluorescerende fargestoff og spesifikt for binding av membranproteinet av interesse eller en rensekode inkludert i membranproteinkonstruksjonen indirekte merke et mål for FSEC.
Når du utfører vaskemiddelscreening ved hjelp av FSEC, kan det velges om bufferen som brukes til å kjøre SEC-kolonnen, skal inneholde det matchende vaskemiddelet som proteinet er solubilisert i, eller om et standard vaskemiddel skal brukes på tvers av alle løpene. En mer nøyaktig representasjon av proteinets oppførsel vil bli oppnådd dersom hele forsøket utføres med det matchende vaskemiddelet gjennom. Det kan imidlertid være tidkrevende og bortkastet vaskemiddel hvis kolonnen må balanseres i et nytt vaskemiddel før hver kjøring utføres. Siden hovedformålet med vaskemiddelscreening er å sammenligne spor, vil trendene forbli i sporene selv om forholdene ikke er ideelle. Dermed kan man oppnå et kompromiss der proteinet solubiliseres i vaskemiddelet av interesse, men kolonnen kjøres i en standardbuffer med et enkelt vaskemiddel over alle løpene (f.eks. DDM)11, noe som kan spare tid og forbruksvarer for vaskemiddel.
Ved å modifisere FLPC-utstyret som brukes, kan gjennomstrømningen til FSEC-protokollen økes betydelig, og prøvekravet kan minimeres. For eksempel kan et FPLC- eller HPLC-system utstyres med en automatisk prøvetaker, en mindre sengvolumanalytisk kolonne (for eksempel en 3,2 ml analytisk SEC-kolonne) og en inline-fluorescerende detektor for overvåking av kontinuerlige FSEC-spor direkte fra kolonnen. Det resulterende oppsettet vil tillate at flere FSEC-kjøringer utføres på kortere tid og fjerne det manuelle plottetrinnet, slik at et større antall forhold kan testes i en kortere tidsramme. Videre vil prøvekravet bli ytterligere redusert, ettersom færre prøver må utarbeides og lastes inn på FSEC-kolonnen for hver kjøring. Dette ville åpne muligheter for å redusere uttrykkskulturene til et platebasert format, da så lite materiale ville være nødvendig for analysen.
Styrker og svakheter ved FSEC sammenlignet med andre metoder En ulempe med FSEC er at membranproteinkonstruksjonene må utformes for å introdusere fluorescerende etiketten, og ved introduksjon er det en liten mulighet for at plasseringen av etiketten kan forstyrre funksjonen eller foldingen av membranproteinet av interesse. I tillegg overvåker FSEC-protokollen, som beskrevet her, egenskapene til et membranprotein i nærvær av cellelysat, som er en rå blanding av proteiner. Oppførselen til et membranprotein i dette miljøet kan være annerledes enn når membranproteinet av interesse blir utsatt for en forberedende SEC-kolonne ved slutten av rensingen når den er fullstendig isolert fra andre proteiner. Videre gir FSEC et noe kvalitativt mål på proteinkvalitet. Ved å konvertere FSEC-sporet til en monodispersitetsindeks, som beskrevet i trinn 4.3.3 i protokollen, kan man imidlertid oppnå et kvantitativt mål for proteinkvalitet.
FSEC er ikke den eneste metoden som kan brukes i tidlig analyse av membranproteinkonstruksjoner, oppløselighetsbetingelser og rensingsbuffersammensetning. De alternative tilnærmingene har både fordeler og ulemper i forhold til FSEC. For eksempel finnes fluoroforbaserte termostabilitetsanalyser, spesielt bruken av fargestoffet 7-dietylamino-3-(4'-maleimidylfenyl)-4-metylkumarin (CPM)16,17. Fordelen med denne metoden er at, i motsetning til FSEC, som gir et kvalitativt mål på proteinkvalitet, gir termostabilitetsanalyser et kvantitativt mål i form av en relativ smeltetemperatur. Videre er det ikke noe krav om å innføre en fluorescerende tag på proteinkonstruksjonen. Ulempene med termostabilitetsanalyser sammenlignet med FSEC er imidlertid at renset protein må brukes, og at analysen ikke er kompatibel med alle proteinkonstruksjoner, da den er avhengig av de fordelaktige posisjonene til innfødte cysteinrester i det foldede proteinet.
En annen metode som har likheter med både FSEC og fluoroforbaserte termostabilitetsanalyser er en analyse som måler temperaturfølsomheten til et membranprotein. I denne analysen utfordres proteinet med forskjellige temperaturer, og proteinet som blir igjen i oppløsning etter sentrifugering detekteres. Deteksjon i denne metoden har blitt utført på flere måter, inkludert måling av fluorescens i løsning18, fluorescensen til et SDS-PAGE gelbånd19, eller signalintensiteten i en western blot20. En betydelig ulempe ved disse tilnærmingene er imidlertid at analysen er svært arbeidsintensiv og utsatt for høy støy i resultatene, da hvert enkelt temperaturpunkt må samles uavhengig.
Endelig kan flere mer avanserte biofysiske teknikker brukes til å vurdere membranproteinkvalitet på samme måte som FSEC, for eksempel strømningsindusert dispersjonsanalyse21, mikroskala termoforese22 eller SPR. Selv om det er svært kraftige tilnærminger, er ulempen med disse metodene kravet om høyt spesialiserte instrumenter for å kjøre analysene.
Avslutningsvis gir FSEC et uvurderlig verktøy for bruk i membranproteinproduksjonskampanjer, og selv om det ikke er det eneste alternativet, har det flere forskjellige fordeler i forhold til andre metoder, som nevnt ovenfor. Kryssvalidering av resultatene ved hjelp av ortogonale analyser anbefales alltid, og ingen av metodene diskutert ovenfor utelukker hverandre gjensidig.

Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), også kjent som gelfiltreringskromatografi, brukes ofte i proteinvitenskap1. Under SEC separeres proteiner basert på deres hydrodynamiske radius, som er en funksjon av proteinstørrelsen og formen2. Kort fortalt oppnås denne separasjonen ved å påføre proteinprøvene under strømmen på en pakket seng av porøse perler som fungerer som en molekylsikt. Perlene som brukes er ofte tverrbundet agarose med et definert utvalg av porestørrelser for å tillate proteiner å enten komme inn eller bli ekskludert fra porene i perlene 3,4,5,6,7. Proteiner med mindre hydrodynamiske radier tilbringer en større andel tid i porene og strømmer dermed gjennom det pakkede bedet i en langsommere hastighet, mens større proteiner tilbringer en større andel tid utenfor perlene (det ekskluderte volumet) og beveger seg raskere gjennom det pakkede bedet. SEC kan brukes som et proteinrensingstrinn når en forberedende kolonne brukes1. Når en analytisk kolonne brukes, kan SEC brukes til å analysere proteinkvalitet og egenskaper2. For eksempel har proteinaggregater som kan være tilstede i en prøve og indikerer protein av dårlig kvalitet, en tendens til å være svært store, noe som betyr at de bare reiser i det ekskluderte volumet og dermed blir eluert fra kolonnen på det tidligste punktet; Dette volumet refereres til som Column Void eller Void Volume. Videre kan molekylvektstandarder brukes til å kalibrere kolonnen, slik at en estimert molekylvekt av proteinet av interesse kan interpoleres fra en standardkurve.
Vanligvis brukes proteinabsorbansen ved 280 nm til å overvåke proteinelusjonen fra en størrelsesekskluderingskolonne. Dette begrenser bruken av SEC som et analyseverktøy til proteinet av interesse i stor grad er fri for forurensende proteiner, for eksempel ved det siste trinnet av proteinrensing. Imidlertid bruker fluorescerende SEC (FSEC) et protein av interesse som er fluorescerende merket. Derfor kan et fluorescerende signal brukes til å spesifikt overvåke eluering av proteinet av interesse i nærvær av andre proteiner eller til og med råblandinger 8,9. Videre, da fluorescerende signaler er svært følsomme, kan vellykket analyse utføres på prøver med ekstremt lave proteinmengder. Proteinet av interesse er ofte fluorescerende merket ved å inkludere et grønt fluorescerende protein (GFP) eller forbedret GFP (eGFP) tag i uttrykkskonstruksjonen. Det fluorescerende signalet kan deretter overvåkes ved eksitasjon ved 395 nm eller 488 nm og detektering av fluorescerende utslipp ved henholdsvis 509 nm eller 507 nm for GFP eller eGFP10.
Fordelen med å bruke et fluorescerende signal for å overvåke proteineluering fra en SEC-kolonne gjør FSEC til et verdifullt verktøy for å analysere membranproteinprøver når ekspresjonsnivåene er spesielt dårlige i forhold til løselige proteiner. Avgjørende er at kvaliteten og egenskapene til membranproteiner kan analyseres direkte etter oppløseliggjøring fra rålysater uten krav om å optimalisere renseprosessen først11,12. Av disse grunner kan FSEC brukes til raskt å analysere membranproteinkvaliteten mens du utforsker de forskjellige faktorene som kan være nødvendige for å forbedre oppførselen til membranproteinet i oppløsning. For eksempel er det vanlig å prøve mange konstruksjoner som inneholder forskjellige tagger, trunkeringer, delesjoner, fusjonspartnerinnsettinger og stabiliserende mutasjoner for å finne en som ikke er aggregert etter ekstraksjon fra membranen13,14. Videre kan bufferscreening for å bestemme vaskemiddelet, additivet, liganden eller polymeren som gir den mest stabiliserende tilstanden for membranproteinet, definere den beste buffersammensetningen for proteinrensing eller for å gi stabilitet for nedstrøms bruk, for eksempel biofysiske analyser eller strukturell karakterisering.
Dermed er det overordnede målet med FSEC-metoden å samle en SEC-kolonneelueringsprofil for et målmembranprotein av interesse. Videre, når fluorescens brukes, samles dette SEC-sporet så tidlig som mulig i optimaliseringen av konstruksjonene og forholdene før langvarig rensing. FSEC-sporet kan brukes som et komparativt verktøy for å bedømme sannsynligheten for suksess for å rense et membranprotein med forskjellige bufferbetingelser eller membranproteinkonstruksjoner. På denne måten kan samlingen av FSEC-profiler brukes som en rask iterativ prosess for å komme frem til optimal konstruksjonsdesign og buffersammensetning før du bruker krefter på å generere mengdene rent protein som kreves for andre analysemetoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL and 5 mL plastic syringes&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Syringes for transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab201111</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes&#160;&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>344625&#160;</td>
			<td>Tubes for ultra-centrifuge rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>50 mL tubes for cell harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well blocks&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>15922302</td>
			<td>For collecting 0.2 mL SEC fractions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA&#160; V9-L loop valve</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29011358</td>
			<td>5 posiiton loop valve&#160; for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA F9-C fraction collector</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29027743</td>
			<td>6 position plate fraction collector for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29018224&#160;</td>
			<td>FPLC system for running the experiment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15828722&#160;</td>
			<td>Centrifuge for low-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end filling needles&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top vacuum filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10005490</td>
			<td>Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl hemisuccinate (CHS)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>CH210-5GM&#160;</td>
			<td>Additive for detergent solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable multichannel reseviour&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecyl maltoside (DDM)&#160;</td>
			<td>Glycon&#160;</td>
			<td>D97002-C-25g&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP protein standards</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K815-100</td>
			<td>eGFP standards for fluorescent calibration curve&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>11443297</td>
			<td>Glycerol for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10411451</td>
			<td>HEPES for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403842</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>NB-19-0055-5G&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular&#160; weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403841</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLA-130 ultra-centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>367114&#160;</td>
			<td>Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque 96-well flat-bottom micro-plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10656853</td>
			<td>96-well for reading fluorescent signal in plate reader&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-XP ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393315&#160;</td>
			<td>Centrifuge for high-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For adjusting the pH of buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Graphing software for plotting traces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary mixer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12027144&#160;</td>
			<td>Mixer for end over end mixing in the cold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10316943</td>
			<td>Sodium chloride for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10488790</td>
			<td>Sodium hydroxide for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax ID3 Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>735-0391</td>
			<td>Micro-plate reader capable of reading fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer plate</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For stirring buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene maleic acid (SMA)&#160;</td>
			<td>Orbiscope&#160;</td>
			<td>SMALP 300&#160;</td>
			<td>Polymer for detergent free extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28990944&#160;</td>
			<td>SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 &#176;C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16694-2-50-06</td>
			<td>For filtering and degassing buffers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography

Under strukturell oppklaring av membranprotein og biofysisk karakterisering er det vanlig å prøve mange proteinkonstruksjoner som inneholder forskjellige tagger, trunkeringer, delesjoner, fusjonspartnerinnsettinger og stabiliserende mutasjoner for å finne en som ikke er aggregert etter ekstraksjon fra membranen. Videre er bufferscreening for å bestemme vaskemiddelet, additivet, liganden eller polymeren som gir den mest stabiliserende tilstanden for membranproteinet en viktig praksis. Den tidlige karakteriseringen av membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelsesekskluderingskromatografi gir et kraftig verktøy for å vurdere og rangere forskjellige konstruksjoner eller forhold uten krav om proteinrensing, og dette verktøyet minimerer også prøvekravet. Membranproteinene må være fluorescerende merket, vanligvis ved å uttrykke dem med en GFP-tag eller lignende. Proteinet kan solubiliseres direkte fra hele celler og deretter crudely klargjort ved sentrifugering; Deretter sendes proteinet ned i en størrelsesekskluderingskolonne, og et fluorescerende spor oppsamles. Her presenteres en metode for å kjøre FSEC og representative FSEC-data på GPCR-målene sfingosin-1-fosfatreseptor (S1PR1) og serotoninreseptor (5HT2AR).

Først ble det dynamiske området og nedre grenser for eGFP-deteksjon for plateleseren som ble brukt i denne studien undersøkt. En renset eGFP-standard med kjent konsentrasjon ble fortynnet i et 50 μL endelig volum til 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 ng·μL−1 og 0,390625 ng·μL−1, og fluorescensen ble avlest ved hjelp av en eksitasjon på 488 nm og en emisjon på 507 nm (figur 2 ). Dette eksperimentet indikerte at plateleseren hadde en lavere deteksjonsgrense på 30 ng eGFP-merket protein per brønn og et dynamisk område på opptil 500 ng eGFP-merket protein per brønn før signalmetning. Ved å bruke verdien for den nedre grensen og anta at proteinelusjonen er begrenset til 0,33 av kolonnevolumet, kreves så lite som 1,28 μg eGFP-merket protein av interesse for lasting av SEC-kolonnen for at et detekterbart FSEC-signal skal observeres.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig02.jpg"> Figur 2: eGFP-standardkurve. Spredningsgraf over fluorescerende signal for renset eGFP-standard fortynnet til 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 og 0,390625 ng·μL−1. (A) Alle fortynninger vises, inkludert de med mettet signal. (B) En zoomet inn punktgraf som bare inkluderer standardene som faller inn i det dynamiske området til plateleseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For det andre ble 24 ml kolonnen som ble brukt til denne studien kalibrert med molekylvektstandarder. Ved å bruke samme buffer og driftsforhold som brukes til FSEC-analysen, ble molekylvektstandardene blå dextran (>2000 kDa), ferritin (440 kDa), aldolase (158 kDa), konalbumin (75 kDa) og ovalbumin (43 kDa) injisert individuelt og kjørt gjennom kolonnen, og elueringsspor ble samlet ved 280 nm absorpsjon. De registrerte elueringsvolumene var henholdsvis 8,9 ml, 12,4 ml, 15,2 ml, 16,9 ml og 18 ml. Når disse elueringsvolumene ble konvertert til Kav (ligning 1) og plottet mot logmolekylære vekter, kunne en standardkurve være passende. Dette gjorde at molekylvekten til GPCR-ene som ble testet i denne studien, kunne estimeres ved interpolering av standardkurven (figur 3). For eksempel indikerte FSEC-sporet av GPCR-serotoninreseptoren 2A (5HT2AR) etter oppløseliggjøring i vaskemiddelet DDM et elueringsvolum på 13,4 ml. Dette 5HT2AR-elueringsvolumet faller mellom de elueringsvolumene som er registrert for ferritin og aldolase og gir en estimert molekylvekt på ca. 300 kDa. 5HT2AR-konstruksjonen som ble brukt i denne studien er ca. 50 kDa (inkludert eGFP-taggen), noe som betyr at hvis 5HT2AR antas å være monomer, kan 250 kDa molekylvekt tilskrives DDM-vaskemiddelet / lipidmicellen. Ligningen for omregning av elueringsvolumer er som følger (ligning 1):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64322/64322eq01.jpg" style="margin: auto;">(Ligning 1)
hvor V e er elueringsvolumet, V 0 er kolonnetomromsvolumet, og Vc er det totale kolonnevolumet.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig03.jpg"> Figur 3: Kalibreringskurve for SEC-kolonnen ved bruk av molekylvektstandarder . (A) Et representativt FSEC-spor av 5HT2AR solubilisert i DDM, med de relative elueringsposisjonene til molekylvektstandardene blå dextran (Void), ferritin, aldolase, konalbumin og ovalbumin merket. Ferritin, aldolase, konalbumin og ovalbumin er farget i henholdsvis grønt, lilla, rødt og cyan. (B) Molekylvektskalibreringskurven ved bruk av elueringsposisjonene til standardene etter konverteringtil K av (ligning 1) plottet mot logmolekylvekten (Mr). Mr for 5HT2AR i DDM ble interpolert fra kurven ved hjelpav K av og vises på kurven (blå firkant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
FSEC ble deretter brukt til å vurdere kvaliteten og egenskapene til GPCR-sfingosin-1-fosfatreseptoren (S1PR1)15. Insektceller som uttrykker GFP-merket humant S1PR 1 ble behandlet for FSEC som beskrevet i protokollen (figur 1).
For det første ble de optimale membranekstraksjonsforholdene utforsket ved å teste vaskemidlene DDM og LMNG mot vaskemiddelfri ekstraksjon med SMA (figur 4A). Monodispersitetsindeksen ble brukt til å vurdere kvaliteten på proteinprøven og forholdet mellom proteinet i tomrommet (~ 8 ml kolonneretensjon) sammenlignet med den monodispergerte prøven (14-15 ml kolonneretensjon). Prøven solubilisert i LMNG viste en overlegen FSEC-profil med en bedre monomer toppform og en lavere proteinaggregattopp, noe som indikerer at solubilisering og rensing i LMNG var de mest stabiliserende forholdene for dette membranproteinet. I motsetning til dette hadde prøven solubilisert i DDM en relativt dårligere FSEC-profil, med en større aggregattopp og en bredere monomerisk topp, noe som indikerer polydispersitet i prøven.
For det andre ble effekten av ligandaddisjon på FSEC-profilen undersøkt ved å tilsette sfingosin-1-fosfat (S1P) til prøven under oppløseliggjøring. I dette tilfellet ble DDM brukt som oppløselighetsreagens, og FSEC-sporene av S1PR1 i nærvær og fravær av S1P ble sammenlignet (figur 4B). Prøven solubilisert i nærvær av S1P viste et overlegent FSEC-spor med redusert aggregering. Dette indikerte at rensing i nærvær av en ligand var fordelaktig for å forbedre proteinprøvekvaliteten ved å stabilisere reseptoren i oppløsning, men var også fordelaktig også som en surrogatmarkør for proteinaktivitet, da resultatene antydet at proteinet var riktig foldet og kompetent for ligandbinding.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig04.jpg"> Figur 4: FSEC ved bruk av et råekstrakt av S1PR 1 som indikerer optimale membranekstraksjonsbetingelser og ligandbinding. (A) Sammenligning av FSEC-sporene av S1PR1 solubilisert i styren-maleinsyre-kopolymer (SMA; blå), laurylmaltose neopentylglykol (LMNG; rød) eller dodecylmaltosid (DDM; svart). (B) Sammenligning av FSEC-sporene av S1PR 1 solubilisert i DDM i nærvær (rød) eller fravær (svart) av agonisten sfingosin-1-fosfat (S1P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
FSEC ble også brukt til å undersøke den langsiktige stabiliteten til 5HT2AR under forskjellige forhold. GFP-merket humant 5HT2AR ble solubilisert fra insektcellemembraner i enten vaskemiddel (DDM) eller SMA-polymer og analysert med FSEC ved flere tidspunkter etter lagring ved 4 °C eller romtemperatur (figur 5). Etter flere dager med inkubasjon viste 5HT2AR i DDM et signifikant fall i den monomere topphøyden ved hver temperatur, og signifikante økninger i den samlede toppen ble observert. I motsetning til dette viste 5HT2AR i SMA-lipidpartikkel (SMALP) ikke et signifikant fall i den monomere topphøyden i løpet av forsøket, noe som indikerer at proteinet i SMALP forblir stabilt lenger, selv ved ugunstige temperaturer. Dette kan være viktig når man vurderer proteinpreparater for nedstrøms biofysiske anvendelser som overflateplasmonresonans (SPR) eksperimenter der det er krav om at prøven skal være stabil og aktiv over lang tid for vellykket gjennomføring av bindingsforsøkene.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig05.jpg"> Figur 5: Effekt av tid og temperatur på kvaliteten på 5HT 2A R ekstrahert fra membranen ved bruk av enten DDM eller SMALP, som analysert av FSEC. (A) Representative FSEC-spor av 5HT2AR solubilisert i DDM og lagret ved romtemperatur i 1 dag (grå),2dager (grønn) eller 5 dager (blå). (B) Histogrammer av normalisert monomerisk topphøyde for DDM-prøver lagret ved 4 °C (blå) eller RT (grønn) sammenlignet med SMALP-prøver lagret ved 4 °C (grå) eller RT (svart). Feilfelt er representative for SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

Denne protokollen beskriver en prosedyre for å utføre fluorescerende størrelsesekskluderingskromatografi (FSEC) på membranproteiner for å vurdere kvaliteten for nedstrøms funksjonell og strukturell analyse. Representative FSEC-resultater samlet for flere G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) under vaskemiddelløselige og vaskemiddelfrie forhold presenteres.

Rask vurdering av membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelsesekskluderingskromatografi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

En SEC-profil er en kraftig måte å analysere kvaliteten på et protein på. Målet er å samle inn en SEC-profil for et membranprotein ved hjelp av fluorescens, som kan informere om prøvekvalitet. FSEC bruker små mengder prøver og kan utføres for rensing, er relativt enkel, og kan utføres på utstyr tilgjengelig i mange laboratorier.Demonstrere prosedyren vil være Jack Wright, en senior proteinforsker fra Peak Proteins. Begynn med klargjøring av cellepaletter ved å tine cellepaletten som er lagret ved minus 80 grader Celsius ved romtemperatur i 15 minutter, eller til prøven ikke lenger er frossen. Flytt prøven umiddelbart til is.For å re-suspendere og oppløse prøven, legg til to milliliter av oppløselighetsbufferen til cellepaletten. Inkuber med ende-over-ende-inversjon ved fire grader Celsius i 15 til 30 minutter. Deretter tilsettes ferdigblandet vaskemiddellager for å lage en endelig konsentrasjon på 1% dodecylmaltosid eller DDM, og 0,1% kolesterolhemisuccinat eller CHS.Løselig i 30 minutter med ende-over-ende-inversjon ved fire grader Celsius. For å utføre et sentrifugeringstrinn med lav hastighet, sentrifuger prøven i en stasjonær sentrifuge ved hjelp av en svingbar bøtte og sentrifuge ved 2000 g i 15 minutter. Deretter utfører høyhastighets sentrifugering ved å overføre supernatanten fra lavhastighets sentrifugering til ultrasentrifugeringsrør ved hjelp av en stump nål festet til en fem milliliter sprøyte.Pass på at du ikke forstyrrer paletten. Etter å ha balansert rørparene, plasser dem i en fast vinklet ultrasentrifugeringsrotor og sentrifuge ved fire grader Celsius i 30 minutter ved 250 000g. Forbered den raske proteinvæskekromatografien, eller FPLC-systemet, ved å fylle systemet med størrelsesekskluderingskromatografi, eller SEC-buffer, og rense pumpene for luft.Koble SEC-kolonnen til FPLC, slik at ingen luft kommer inn i kolonnen. Pre-balansere SEC-kolonnen ved å vaske den i 1,5 ganger kolonnevolumer av laboratoriedestillert og filtrert vann, etterfulgt av 1,5 ganger kolonnevolumer av SEC-buffer ved anbefalt strømningshastighet og trykk for kolonnen. For å kjøre SEC-eksperimentet, overfør supernatanten fra høyhastighets sentrifugeringstrinnet til en en-milliliter sprøyte ved hjelp av en stump nål festet til sprøyten.Angi at prøvesløyfen skal lastes inn. Overfyll en prøvesløyfe på 500 mikroliter ved å injisere 600 til 700 mikroliter av prøven fra sprøyten i lasteporten. Deretter injiserer du prøven fra sløyfen i kolonnen ved å tømme den med fire milliliter SEC-buffer ved anbefalt strømningshastighet og trykk.Kjør kolonnen med samme strømningshastighet til passering av 1,5 ganger buffervolumet, og begynn å samle 90 fraksjoner på 0,2 milliliter etter passering av 0,25 ganger kolonnevolumet. Bruk en flerkanals pipette til å overføre 90 mikroliter destillert vann av laboratoriekvalitet fra et reservoar til hver brønn i en ugjennomsiktig, flatbunnet, 96-brønnsplate. Overfør deretter 10 mikroliter av prøvene fra en 96-brønnplate til den ugjennomsiktige, flatbunns, 96-brønnplaten, og plasser brønnplaten i en plateleser.For fluorescerende merket GFP, et eksitasjonen så nært som mulig til 488 nanometer og oppdag fluorescerende utslipp så nært som mulig til 507 nanometer før måling av signalet. Undersøkelsen av dynamisk område og nedre grenser for forbedret grønt fluorescerende protein, eller EGFP-deteksjon for plateleseren, indikerte at plateleseren hadde en lavere deteksjonsgrense på 30 nanogram og et dynamisk område på opptil 500 nanogram EGFP-merket protein per brønn før signalmetning. Omdannelsen av elueringsvolumene til Kav og plotting av den mot logmolekylære vekter tillot estimering av molekylvekten til G-proteinkoblede reseptorer ved interpolering av standardkurven.De optimale membranekstraksjonsforholdene ble utforsket ved å teste DDM og laurylmaltose neopentylglykol mot vaskemiddelfri ekstraksjon med styrenmaleinsyrekopolymer. Effekten av ligandaddisjon på fluorescensstørrelse-eksklusjonskromatografiprofilen ble undersøkt ved å tilsette sfingosin-1-fosfat, eller S1P, til prøven under solubilisering. Prøven solubilisert i nærvær av S1P viste et overlegent spor med redusert aggregering.Undersøkelsen av den langsiktige stabiliteten til serotoninreseptor 5HT2AR under forskjellige forhold indikerte at proteinet i styren-maleinsyre-lipidpartikler holdt seg stabilt lenger, selv ved ugunstige temperaturer. Tiden mellom oppløselighetspunktet og prøven som passerer ned SEC-kolonnen er tidskritisk. Det må ikke være pauser, og prøven må holdes kald.Etter FSEC vil man få en forståelse av den beste konstruksjonen, vaskemiddelet eller bufferen. Dette gjør at proteinrensing kan optimaliseres og støtter nedstrøms biofysisk og strukturell karakterisering.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Online Size-eksklusjon og ionebytterkromatografi på en SAXS tros

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse av Thylakoid membran Protein komplekser av blå innfødt Gel geleelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Strukturen løsning av fluorescerende Protein Cerulean bruker MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Karakterisering av proteiner etter størrelses-ekskludering kromatografi koblet til multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...