Name: rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography
Uploaded: 2023-01-06T13:05:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Мы хотели бы выразить благодарность за помощь и поддержку всей команде Peak Proteins. От имени команды клеточных ученых мы хотели бы поблагодарить Яна Хэмптона за его ценные идеи и рекомендации в области экспрессии клеток насекомых. Мы хотели бы поблагодарить Марка Эбботта за предоставление ресурсов и возможностей для реализации этого проекта.

<ol>
	<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography:+Rules+of+thumb,+limitations,+and+troubleshooting.">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+and+shape+of+protein+molecules+at+the+nanometer+level+determined+by+sedimentation,+gel+filtration,+and+electron+microscopy.">Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy.</a> Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+and+estimation+of+their+relative+molecular+sizes+by+the+use+of+columns+of+starch+in+water.">The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water.</a> Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).</li><li>Lathe, G. H., Ruthven, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+separation+of+substances+on+the+basis+of+their+molecular+weights,+using+columns+of+starch+and+water.">The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water.</a> Biochemical Journal. 60 (4), (1955).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+protein+mixtures+on+columns+of+granulated+agar.">Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).</li><li>Hjert&#233;n, S., Mosbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Molecular-sieve&amp;#34;+chromatography+of+proteins+on+columns+of+cross-linked+polyacrylamide.">34;Molecular-sieve&amp;#34; chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide.</a> Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).</li><li>Porath, J., Flodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+filtration:+A+method+for+desalting+and+group+separation.">Gel filtration: A method for desalting and group separation.</a> Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+mutations+thermostabilize+G-protein-coupled+receptors.">How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).</li><li>Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+bottlenecks+in+the+membrane+protein+structural+biology+pipeline.">Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline.</a> Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).</li><li>Hanson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335 (6070), 851-855 (2012).</li><li>Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+fluorescent+thermal+stability+assay+for+membrane+proteins.">Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins.</a> Structure. 16 (3), 351-359 (2008).</li><li>Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostability+assays:+A+generic+and+versatile+tool+for+studying+the+functional+and+structural+properties+of+membrane+proteins+in+detergents.">Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents.</a> Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).</li><li>Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+thermal-shift+screen+reveals+specific+lipid+preferences+of+eukaryotic+and+prokaryotic+membrane+proteins.">An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).</li><li>Harborne, S. P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMPROvER:+The+Integral+Membrane+Protein+Stability+Selector.">IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).</li><li>Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+thermostability+of+membrane+proteins+by+western+blotting.">Defining thermostability of membrane proteins by western blotting.</a> Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).</li><li>Pedersen, M. E., &#216;stergaard, J., Jensen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-induced+dispersion+analysis+(FIDA)+for+protein+quantification+and+characterization.">Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization.</a> Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).</li></ol>

Peak Proteins — это контрактная исследовательская организация, которая за определенную плату обеспечивает экспрессию, очистку, масс-спектрометрию и структурное определение белка.

Эксклюзионная хроматография (SEC), также известная как гель-фильтрационная хроматография, обычно используется в науке о белках1. Во время SEC белки разделяются на основе их гидродинамического радиуса, который является функцией размера и формы белка2. Короче говоря, это разделение достигается путем нанесения образцов белка под потоком на упакованный слой пористых шариков, которые действуют как молекулярное сито. Используемые шарики часто представляют собой сшитую агарозу с определенным диапазоном размеров пор, что позволяет белкам либо входить, либо исключаться из пор шариков 3,4,5,6,7. Белки с меньшими гидродинамическими радиусами проводят большую часть времени в порах и, таким образом, проходят через упакованный слой с меньшей скоростью, тогда как более крупные белки проводят большую часть времени вне шариков (исключенный объем) и перемещаются через упакованный слой с большей скоростью. SEC можно использовать в качестве этапа очистки белка, когда используется препаративная колонка1. При использовании аналитической колонки SEC можно использовать для анализа качества и свойств белка2. Например, белковые агрегаты, которые могут присутствовать в образце и указывать на белок низкого качества, как правило, очень большие, то есть они перемещаются только в исключенном объеме и, таким образом, вымываются из колонки в самой ранней точке; Этот том называется пустотой столбца или пустотой. Кроме того, стандарты молекулярной массы могут быть использованы для калибровки колонки, что позволяет интерполировать расчетную молекулярную массу интересующего белка из стандартной кривой.
Как правило, поглощение белка на длине волны 280 нм используется для мониторинга элюирования белка из колонки исключения размера. Это ограничивает использование SEC в качестве инструмента анализа до тех пор, пока интересующий белок не будет в значительной степени свободен от загрязняющих белков, например, на последнем этапе очистки белка. Тем не менее, флуоресцентный SEC (FSEC) использует интересующий белок, который флуоресцентно мечен. Следовательно, флуоресцентный сигнал может быть использован для специфического мониторинга элюирования интересующего белка в присутствии других белков или даже сырых смесей 8,9. Кроме того, поскольку флуоресцентные сигналы обладают высокой чувствительностью, успешный анализ может быть выполнен на образцах с чрезвычайно низким содержанием белка. Интересующий белок часто флуоресцентно мечен путем включения зеленого флуоресцентного белка (GFP) или усиленной метки GFP (eGFP) в конструкцию экспрессии. Затем флуоресцентный сигнал можно контролировать путем возбуждения на длине волны 395 нм или 488 нм и детектирования флуоресцентного излучения на длине волны 509 нм или 507 нм для GFP или eGFP соответственно10.
Преимущество использования флуоресцентного сигнала для мониторинга элюирования белка из колонки SEC делает FSEC ценным инструментом для анализа образцов мембранного белка, когда уровни экспрессии особенно низки по сравнению с растворимыми белками. Важно отметить, что качество и свойства мембранных белков могут быть проанализированы непосредственно после солюбилизации из сырых лизатов без необходимости сначала оптимизировать процесс очистки11,12. По этим причинам FSEC можно использовать для быстрого анализа качества мембранного белка при изучении различных факторов, которые могут потребоваться для улучшения поведения мембранного белка в растворе. Например, обычно тестируют многочисленные конструкции, содержащие различные метки, усечения, делеции, вставки партнеров по слиянию и стабилизирующие мутации, чтобы найти ту, которая не агрегируется после экстракции из мембраны13,14. Кроме того, буферный скрининг для определения детергента, добавки, лиганда или полимера, которые обеспечивают наиболее стабилизирующие условия для мембранного белка, может определить наилучшую буферную композицию для очистки белка или для обеспечения стабильности для последующих применений, таких как биофизические анализы или структурные характеристики.
Таким образом, общая цель метода FSEC состоит в том, чтобы собрать профиль элюирования колонки SEC для интересующего мембранного белка-мишени. Кроме того, поскольку используется флуоресценция, этот след SEC собирается на самой ранней стадии оптимизации конструкций и условий перед любой длительной очисткой. Трассировка FSEC может быть использована в качестве сравнительного инструмента для оценки вероятности успеха очистки мембранного белка с различными буферными условиями или конструкциями мембранных белков. Таким образом, сбор профилей FSEC может быть использован в качестве быстрого итеративного процесса для достижения оптимального дизайна конструкции и состава буфера, прежде чем тратить усилия на создание количеств чистого белка, необходимых для других методов анализа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL and 5 mL plastic syringes&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Syringes for transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab201111</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes&#160;&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL ultra-centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>344625&#160;</td>
			<td>Tubes for ultra-centrifuge rotor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>50 mL tubes for cell harvest&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well blocks&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>15922302</td>
			<td>For collecting 0.2 mL SEC fractions&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA&#160; V9-L loop valve</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29011358</td>
			<td>5 posiiton loop valve&#160; for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA F9-C fraction collector</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29027743</td>
			<td>6 position plate fraction collector for the &#196;KTA FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>29018224&#160;</td>
			<td>FPLC system for running the experiment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15828722&#160;</td>
			<td>Centrifuge for low-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end filling needles&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For transfer of samples&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top vacuum filter&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10005490</td>
			<td>Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl hemisuccinate (CHS)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>CH210-5GM&#160;</td>
			<td>Additive for detergent solubilisation&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable multichannel reseviour&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecyl maltoside (DDM)&#160;</td>
			<td>Glycon&#160;</td>
			<td>D97002-C-25g&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP protein standards</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K815-100</td>
			<td>eGFP standards for fluorescent calibration curve&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>11443297</td>
			<td>Glycerol for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>10411451</td>
			<td>HEPES for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High molecular weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403842</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)&#160;</td>
			<td>Generon&#160;</td>
			<td>NB-19-0055-5G&#160;</td>
			<td>Detergent for solubilisation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low molecular&#160; weight SEC calibration standards kit</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28403841</td>
			<td>Molecular weight calibration kit for SEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLA-130 ultra-centrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>367114&#160;</td>
			<td>Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opaque 96-well flat-bottom micro-plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10656853</td>
			<td>96-well for reading fluorescent signal in plate reader&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima MAX-XP ultra-centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter&#160;</td>
			<td>393315&#160;</td>
			<td>Centrifuge for high-speed spin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For adjusting the pH of buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>Graphing software for plotting traces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary mixer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12027144&#160;</td>
			<td>Mixer for end over end mixing in the cold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10316943</td>
			<td>Sodium chloride for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10488790</td>
			<td>Sodium hydroxide for buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax ID3 Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>735-0391</td>
			<td>Micro-plate reader capable of reading fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer plate</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>-&#160;</td>
			<td>For stirring buffers during preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrene maleic acid (SMA)&#160;</td>
			<td>Orbiscope&#160;</td>
			<td>SMALP 300&#160;</td>
			<td>Polymer for detergent free extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL&#160;</td>
			<td>Cytiva&#160;</td>
			<td>28990944&#160;</td>
			<td>SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 &#176;C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16694-2-50-06</td>
			<td>For filtering and degassing buffers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assessment of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography

Во время выяснения структуры мембранного белка и биофизической характеристики обычно тестируются многочисленные белковые конструкции, содержащие различные метки, усечения, делеции, вставки партнеров по слиянию и стабилизирующие мутации, чтобы найти ту, которая не агрегируется после экстракции из мембраны. Кроме того, важной практикой является буферный скрининг для определения детергента, добавки, лиганда или полимера, которые обеспечивают наиболее стабилизирующие условия для мембранного белка. Ранняя характеристика качества мембранного белка с помощью флуоресцентной эксклюзионной хроматографии обеспечивает мощный инструмент для оценки и ранжирования различных конструкций или условий без необходимости очистки белка, и этот инструмент также сводит к минимуму потребность в образце. Мембранные белки должны быть флуоресцентно помечены, обычно путем экспрессии их с помощью метки GFP или аналогичной. Белок может быть солюбилизирован непосредственно из целых клеток, а затем грубо осветлен центрифугированием; Затем белок передается по колонке исключения размера, и собирается флуоресцентный след. Здесь представлен метод проведения FSEC и репрезентативные данные FSEC по мишеням GPCR сфингозин-1-фосфатный рецептор (S1PR1) и серотониновый рецептор (5HT2AR).

Во-первых, были исследованы динамический диапазон и нижние пределы обнаружения eGFP для планшетного считывателя, используемого в этом исследовании. Очищенный стандарт eGFP известной концентрации разбавляли в конечном объеме 50 мкл до 50 нг·мкл-1, 25 нг·мкл-1, 12,5 нг·мкл-1, 6,25 нг·мкл-1, 3,125 нг·мкл-1, 1,5625 нг·мкл-1, 0,78125 нг·мкл-1 и 0,390625 нг·мкл-1, и флуоресценцию считывали с использованием возбуждения 488 нм и излучения 507 нм (рис. 2 ). Этот эксперимент показал, что планшетный считыватель имел нижний предел обнаружения 30 нг белка, меченного eGFP, на лунку и динамический диапазон до 500 нг белка, меченного eGFP, на лунку до насыщения сигнала. Используя значение нижнего предела и предполагая, что элюирование белка ограничено 0,33 объема колонки, для загрузки колонки требуется всего 1,28 мкг белка, меченного eGFP, для загрузки колонки SEC, чтобы можно было наблюдать обнаруживаемый сигнал FSEC.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig02.jpg"> Рисунок 2: Стандартная кривая eGFP. Диаграмма рассеяния флуоресцентного сигнала для очищенного стандарта eGFP, разбавленного до 50 нг·мкл−1, 25 нг·мкл−1, 12,5 нг·мкл−1, 6,25 нг·мкл−1, 3,125 нг·мкл−1, 1,5625 нг·мкл−1, 0,78125 и 0,390625 нг·мкл−1. (A) Отображаются все разбавления, в том числе с насыщенным сигналом. (B) Увеличенная точечная диаграмма, включающая только стандарты, попадающие в динамический диапазон считывателя пластин. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Во-вторых, колонка объемом 24 мл, используемая для этого исследования, была откалибрована в соответствии со стандартами молекулярной массы. Используя те же буферные и рабочие условия, которые использовались для анализа FSEC, стандарты молекулярной массы синего декстрана (>2000 кДа), ферритина (440 кДа), альдолазы (158 кДа), кональбумина (75 кДа) и овальбумина (43 кДа) вводили индивидуально и пропускали через колонку, а следы элюирования собирали при поглощении 280 нм. Зарегистрированные объемы элюирования составляли 8,9 мл, 12,4 мл, 15,2 мл, 16,9 мл и 18 мл соответственно. Когда эти объемы элюирования были преобразованы в Kav (уравнение 1) и построены на графике относительно логарифмических молекулярных масс, можно было подогнать стандартную кривую. Это позволило оценить молекулярную массу GPCR, протестированных в этом исследовании, путем интерполяции стандартной кривой (рис. 3). Например, след FSEC серотонинового рецептора GPCR 2A (5HT2AR) после солюбилизации в детергенте DDM указывал на объем элюирования 13,4 мл. Этот объем элюирования 5HT2AR находится между объемами элюирования, зарегистрированными для ферритина и альдолазы, и обеспечивает расчетную молекулярную массу примерно 300 кДа. Конструкция 5HT 2A R, используемая в этом исследовании, составляет приблизительно 50 кДа (включая метку eGFP), что означает, что если предположить, что 5HT2AR является мономерным, молекулярная масса 250 кДа может быть отнесена к детергенту/липидной мицелле DDM. Уравнение для преобразования объемов элюирования выглядит следующим образом (уравнение 1):
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64322/64322eq01.jpg" style="margin: auto;">(Уравнение 1)
где V e — объем элюирования, V 0 — объем пустот столбца, V c — общий объем столбца.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig03.jpg"> Рисунок 3: Калибровочная кривая колонки SEC с использованием стандартов молекулярной массы. (A) Репрезентативный след FSEC 5HT 2A R, растворенный в DDM, с относительными позициями элюирования стандартов молекулярной массы синего декстрана (пустоты), ферритина, альдолазы, кональбумина и овальбумина. Ферритин, альдолаза, кональбумин и овальбумин окрашены в зеленый, фиолетовый, красный и голубой цвета соответственно. (B) Калибровочная кривая молекулярной массы с использованием положений элюирования эталонов после преобразования в Kav (уравнение 1), построенная по отношению к логарифмической молекулярной массе (Mr). Mr 5HT2AR в DDM был интерполирован из кривой с помощью Kav и отображается на кривой (синий квадрат). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Затем FSEC использовали для оценки качества и свойств рецептора сфингозин-1-фосфата GPCR (S1PR1)15. Клетки насекомых, экспрессирующие GFP-меченный человеческий S1PR 1, обрабатывали для FSEC, как описано в протоколе (рис. 1). 
Во-первых, оптимальные условия мембранной экстракции были исследованы путем тестирования моющих средств DDM и LMNG против экстракции без моющих средств с помощью SMA (рис. 4A). Индекс монодисперсности использовался для оценки качества образца белка и соотношения между белком в пустоте (удержание колонки ~8 мл) по сравнению с монодисперсным образцом (удержание колонки 14-15 мл). Образец, солюбилизированный в LMNG, показал превосходный профиль FSEC с лучшей формой пика мономера и более низким пиком белкового агрегата, что указывает на то, что солюбилизация и очистка в LMNG были наиболее стабилизирующими условиями для этого мембранного белка. Напротив, образец, солюбилизированный в DDM, имел относительно худший профиль FSEC с большим агрегированным пиком и более широким мономерным пиком, что указывает на полидисперсность в образце.
Во-вторых, было исследовано влияние добавления лиганда на профиль FSEC путем добавления сфингозин-1-фосфата (S1P) в образец во время солюбилизации. В этом случае в качестве реагента солюбилизации использовали DDM, и сравнивали следы FSEC S1PR1 в присутствии и отсутствии S1P (рис. 4B). Образец, солюбилизированный в присутствии S1P, показал превосходный след FSEC с уменьшенной агрегацией. Это указывало на то, что очистка в присутствии лиганда была выгодна для улучшения качества образца белка за счет стабилизации рецептора в растворе, но также была выгодна также в качестве суррогатного маркера активности белка, поскольку результаты показали, что белок был правильно свернут и компетентен для связывания лиганда.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig04.jpg"> Рисунок 4: FSEC с использованием сырого экстракта S1PR 1 с указанием оптимальных условий мембранной экстракции и связывания лигандов. (A) Сравнение следов FSEC S1PR1, солюбилизированных в сополимере стирол-малеиновой кислоты (SMA; синий), лаурилмальтозный неопентилгликоль (LMNG; красный) или додецилмальтозид (DDM; черный). (B) Сравнение следов FSEC S1PR 1, солюбилизированных в DDM, в присутствии (красный) или отсутствии (черный) агониста сфингозин-1-фосфата (S1P). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
FSEC также использовался для исследования долгосрочной стабильности 5HT2AR в различных условиях. 5HT2AR человека, помеченный GFP, растворяли из клеточных мембран насекомых либо в детергенте (DDM), либо в полимере SMA и анализировали с помощью FSEC в несколько моментов времени после хранения при 4 ° C или комнатной температуре (рис. 5). После нескольких дней инкубации 5HT2AR в DDM показал значительное падение высоты мономерного пика при любой температуре, и наблюдалось значительное увеличение совокупного пика. Напротив, 5HT2AR в липидной частице SMA (SMALP) не показал значительного падения высоты мономерного пика в ходе эксперимента, что указывает на то, что белок в SMALP оставался стабильным дольше даже при неблагоприятных температурах. Это может быть важно при рассмотрении белковых препаратов для последующих биофизических применений, таких как эксперименты по поверхностному плазмонному резонансу (SPR), для которых требуется, чтобы образец был стабильным и активным в течение длительного периода времени для успешного завершения экспериментов по связыванию.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64322/64322fig05.jpg"> Рисунок 5: Влияние времени и температуры на качество 5HT 2A R, извлеченного из мембраны с использованием DDM или SMALP, проанализированного FSEC. (A) Репрезентативные следы FSEC 5HT2AR, растворенные в DDM и хранящиеся при комнатной температуре в течение 1 дня (серый),2дня (зеленый) или 5 дней (синий). (B) Гистограммы нормализованной высоты мономерного пика для образцов DDM, хранящихся при 4°C (синий) или RT (зеленый), по сравнению с образцами SMALP, хранящимися при 4°C (серый) или RT (черный). Полосы погрешностей являются репрезентативными для SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64322/64322fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography at JoVE.com

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

В настоящем протоколе описывается процедура проведения флуоресцентной эксклюзионной хроматографии (ФСЭС) мембранных белков для оценки их качества для последующего функционального и структурного анализа. Представлены репрезентативные результаты FSEC, собранные для нескольких рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), в условиях, солюбилизированных моющими средствами и без детергентов.

Экспресс-оценка качества мембранного белка методом флуоресцентной эксклюзионной хроматографии

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Профиль SEC — это мощный способ анализа качества белка. Цель состоит в том, чтобы собрать профиль SEC для мембранного белка с использованием флуоресценции, который может информировать о качестве образца. FSEC использует небольшое количество образца и может быть проведена для очистки, относительно проста и может проводиться на оборудовании, имеющемся во многих лабораториях.Продемонстрирует процедуру Джек Райт, старший ученый по белкам из Peak Proteins. Начните с подготовки ячеек, разморозив ячеечную палитру, хранящуюся при температуре минус 80 градусов Цельсия при комнатной температуре, в течение 15 минут или до тех пор, пока образец не перестанет быть замороженным. Немедленно переместите образец на лед.Чтобы повторно суспендировать и растворить образец, добавьте два миллилитра буфера солюбилизации в палитру клеток. Инкубировать со сквозной инверсией при четырех градусах Цельсия в течение 15-30 минут. Затем добавьте предварительно смешанный моющий состав, чтобы получить конечную концентрацию 1% додецилмальтозида, или DDM, и 0,1% гемисукцината холестерина, или CHS.Солюбилизируйте в течение 30 минут с сквозной инверсией при четырех градусах Цельсия. Чтобы выполнить этап низкоскоростного центрифугирования, центрифугируйте образец в настольной центрифуге с помощью поворотного ведра и центрифуги при 2000 г в течение 15 минут. Затем выполняют высокоскоростное центрифугирование, перенося надосадочную жидкость из низкоскоростного центрифугирования в ультрацентрифугирующие пробирки с помощью иглы с тупым концом, прикрепленной к пятимиллилитровому шприцу.Следите за тем, чтобы не нарушить палитру. После балансировки пар пробирок поместите их в ультрацентрифугирующий ротор с фиксированным углом и центрифугу при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут при 250 000 г. Подготовьте быструю белковую жидкостную хроматографию или систему FPLC, заполнив систему экспозиционной хроматографией или буфером SEC и продув насосы воздуха.Подключите колонку SEC к FPLC, чтобы воздух не попадал в колонну. Предварительно уравновесьте колонну SEC, промыв ее в 1,5-кратном объеме лабораторной дистиллированной и фильтрованной воды, а затем в 1,5-кратном объеме буфера SEC при рекомендуемом расходе и давлении для колонны. Чтобы провести эксперимент SEC, перенесите надосадочную жидкость со стадии высокоскоростного центрифугирования в шприц объемом один миллилитр с помощью иглы с тупым концом, прикрепленной к шприцу.Установите цикл выборки на загрузку. Переполните петлю для отбора проб объемом 500 микролитров, впрыснув от 600 до 700 микролитров образца из шприца в загрузочное отверстие. Затем введите образец из контура в колонну, опорожнив ее четырьмя миллилитрами буфера SEC при рекомендуемой скорости потока и давлении.Запустите колонну с той же скоростью потока, пока объем буфера не увеличится в 1,5 раза, и начните собирать 90 фракций по 0,2 миллилитра после прохождения в 0,25 раза больше объема колонны. С помощью многоканальной пипетки передайте 90 микролитров лабораторной дистиллированной воды из резервуара в каждую лунку непрозрачной плоскодонной 96-луночной пластины. Затем перенесите 10 микролитров образцов с 96-луночной пластины на непрозрачную пластину с плоским дном на 96-луночную пластину и поместите луночную пластину в планшетный считыватель.Для GFP с флуоресцентной меткой et возбуждение как можно ближе к 488 нанометрам и обнаружить флуоресцентное излучение как можно ближе к 507 нанометрам перед измерением сигнала. Исследование динамического диапазона и нижних пределов усиленного зеленого флуоресцентного белка или обнаружения EGFP для считывателя пластин показало, что считыватель планшетов имел нижний предел обнаружения 30 нанограммов и динамический диапазон до 500 нанограммов белка, меченного EGFP, на задолго до насыщения сигнала. Преобразование объемов элюирования в Kav и построение графика его по логарифмическим молекулярным массам позволило оценить молекулярную массу рецепторов, связанных с G-белком, путем интерполяции стандартной кривой.Оптимальные условия мембранной экстракции были исследованы путем тестирования неопентилгликоля DDM и лаурилмальтозы против экстракции без моющих средств сополимером малеиновой кислоты стирола. Влияние добавления лиганда на профиль флуоресцентной эксклюзионной хроматографии исследовали путем добавления сфингозин-1-фосфата, или S1P, к образцу во время солюбилизации. Образец, солюбилизированный в присутствии S1P, показал превосходный след с уменьшенной агрегацией.Исследование долговременной стабильности серотонинового рецептора 5HT2AR в различных условиях показало, что белок в липидных частицах малеиновой кислоты стирола дольше оставался стабильным даже при неблагоприятных температурах. Время между точкой растворения и прохождением образца вниз по столбцу SEC является критическим по времени. Пауз быть не должно, а образец должен храниться в холоде.После FSEC будет получено представление о наилучшей конструкции, моющем средстве или буфере. Это позволяет оптимизировать очистку белка и поддерживает последующую биофизическую и структурную характеристику.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Интернет эксклюзионной и ионообменной хроматографии на МУРР пучкового

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...