Name: human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Forfatterne takker Michael Ward for at levere WTC11 hNIL iPSC-linjen til motorneurondifferentiering og Jackson Laboratories for at levere KOLF2.1J WT-klonen B03 iPSC-linjen, der bruges til mikroglia-differentiering. Vi takker også Dorothy Schafer for hendes støtte under implementeringen af protokollerne, Anthony Giampetruzzi og John Landers for deres hjælp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd for hans tekniske bidrag under revisioner og Jonathan Jung for hans samarbejde i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af Dan og Diane Riccio Fund for Neuroscience fra UMASS Chan Medical School og Angel Fund, Inc.

BEMÆRK: Alle reagenser, der anvendes i denne protokol, skal være sterile, og alle trin skal udføres i et biosikkerhedsskab under sterile forhold. Alle iPSC-linjer samt vedligeholdelses- og differentieringsmedier er beskrevet i materialetabellen. Microglia-differentieringsmetoden illustreret nedenfor er baseret på tidligere offentliggjorte protokoller 7,8,12 med nye modifikationer beskrevet heri.
<p class...

<ol>
	<li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development.">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).</li><li>Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuroinflammation+and+neurodegeneration:+from+understanding+to+therapy.">Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells.">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia.">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li><li>Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages.">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).</li><li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+and+its+regulation:+a+therapeutic+target+in+Parkinson's+disease.">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+central+nervous+system+development+and+plasticity.">Microglia function in central nervous system development and plasticity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).</li><li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections.">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).</li><li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons.">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).</li><li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening.">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).</li><li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors.">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li><li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization.">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li></ol>

Differentieringsprotokollen beskrevet her giver en effektiv metode til at opnå iPSC-afledte microglia-lignende celler i ~ 6-8 uger med høj renhed og i et tilstrækkeligt udbytte til at udføre immunfluorescensforsøg og andre assays, der kræver et højere antal celler. Denne protokol har givet op til 1 × 106 iMG'er på 1 uge, hvilket giver mulighed for protein- og RNA-ekstraktion og tilsvarende nedstrømsanalyser (f.eks. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massespektrometri). Når det er sagt, er en begrænsnin...

Microglia er de hjemmehørende immunceller i centralnervesystemet (CNS) og spiller en afgørende rolle i udviklingen af CNS. Microglia er også vigtige i den voksne hjerne for at opretholde homeostase og aktivt reagere på traumer og sygdomsprocesser. Kumulative beviser viser, at microglia er vigtige bidragydere til patogenesen af flere neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme 1,2. Selvom den nuværende viden om mikroglialbiologi overvejende er afledt af musemodeller, har nylige undersøgelser belyst vigtige forskelle mellem murine og human microglia, hvilket understreger behovet for at udvikle teknologier til at studere genetik og biologiske funktioner i human microglia 3,4. Isolering af microglia fra dissekeret primært væv kan alvorligt ændre microglia-egenskaber5, hvilket potentielt kan forvirre resultater erhvervet med sådanne celler. Det overordnede mål med denne metode er at differentiere humane iPSC'er til iMG'er og derved tilvejebringe et cellekultursystem til at studere human microglia under basale forhold. Desuden er en fagocytoseanalyse ved hjælp af et fuldt menneskeligt modelsystem inkluderet heri som et middel til at studere funktionaliteten af iMG'er, både som en kvalitetskontrolforanstaltning og til at vurdere iMG-dysfunktion i forbindelse med sygdom.
Flere protokoller til microglia-differentiering fra iPSC'er er for nylig dukket op i litteraturen 6,7,8,9,10. Potentielle ulemper ved nogle protokoller inkluderer længere eller lange perioder med differentiering, tilføjelse af flere vækstfaktorer og / eller komplekse eksperimentelle procedurer 6,9,10. Her demonstreres en "brugervenlig" differentieringsmetode, der rekapitulerer aspekter af microglia ontogeni gennem differentiering af iPSC'er til forløberceller kaldet primitive makrofagprækursorer (PMP'er)7,11. PMP'er genereres som beskrevet tidligere, med nogle optimeringer præsenteret heri12. PMP'erne efterligner MYB-uafhængige æggeblomme-sac-afledte makrofager, som giver anledning til microglia under embryonal udvikling ved at invadere hjernen før blod-hjerne-barrierelukning13. For terminalt at differentiere PMP'er til iMG'er brugte vi en hurtig og forenklet monokulturmetode baseret på protokoller af Haenseler et al. og Brownjohn et al., med nogle ændringer for at generere en effektiv microglia-differentieringsmetode, hvor iMG'er robust udtrykker microglia-berigede markører 7,8. Denne differentieringsmetode kan gengives i laboratorier med ekspertise inden for iPSC-kulturen og med forskningsmål, der sigter mod at studere mikrogliabiologi ved hjælp af et menneskeligt modelsystem.
iPSC-afledt microglia repræsenterer en biologisk relevant kilde til human microglia til in vitro-eksperimenter og er et vigtigt redskab til at undersøge mikrogliale kanoniske funktioner, herunder fagocytose. Microglia er de professionelle fagocytter i hjernen og CNS, hvor de rydder celleaffald, aggregerede proteiner og nedbrudt myelin14. Microglia fungerer også i synaptisk ombygning ved at opsluge synapser og i forsvaret mod eksterne infektioner gennem fagocytose af patogener15,16. I denne protokol vurderes fagocytose ved iMG'er ved anvendelse af humane synaptosomer som materiale til iMG-opslugtning. Til dette formål beskrives en beskrivelse til isolering af synaptosomer afledt af human i3LMN'er. Dei 3LMN-afledte humane synaptosomer er mærket med et pH-følsomt farvestof, der muliggør kvantificering af synaptosomer lokaliseret i sure rum under fagosombehandling og nedbrydning in vitro. Et fagocytoseassay ved hjælp af levende cellemikroskopi er vist til overvågning af den dynamiske proces med microglia-opslugning i realtid. Dette funktionelle assay etablerer et grundlag for at undersøge mulige defekter i mikroglial fagocytose i sundhed og sygdom ved hjælp af et komplet humant system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies for immunofluorescence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IBA1 rabbit antibody</td>
			<td>Wako Chemical USA</td>
			<td>NC9288364</td>
			<td>1:350 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P2RY12 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA014518</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TMEM119 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA051870</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Western blot analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A6344</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 mouse antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1596</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (100 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (75 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate (25 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainers</td>
			<td>&#160;Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter, Double End, Flat Blade &#38; Narrow Blade, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adherence round-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353847,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>&#160;Corning</td>
			<td>25058CI</td>
			<td>dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td>dissociation reagents used for microglia differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating reagents for cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#8482;</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred as to extracellular matrix coating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAdhere Laminin-521</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>77004</td>
			<td>Referred as to laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P3655</td>
			<td>Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mTeSR Plus Kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>100-0276</td>
			<td>To prepare iPSC media mixed the components to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of EB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>final concentration 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20A</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12001-988</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td>PeproTech or Biologend</td>
			<td>200-34 or 577904</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Complete induction media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>565790</td>
			<td>final concentration 0.2 &#956;M and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>final concentration 2 &#956;g/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Neuron media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3653401</td>
			<td>final concentration 1x for media and suplemment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC lines used in this study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLF2.1J: WT clone B03</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WTC11 hNIL</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptosome isolation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87793</td>
			<td>Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagocytosis assay dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Ready reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, succinimidyl ester</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36600</td>
			<td>Referred as to pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other cell-culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% Solution</td>
			<td>AMRESCO INC</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9285</td>
			<td>Reconstitute to 40 mM in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Referred as to DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td>Referred as to laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 live cell imaging reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>version 3.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Therm Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td></td>
			<td>refer as tube shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Mode Transsonic 310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes

Microglia er de hjemmehørende immunceller af myeloid oprindelse, der opretholder homeostase i hjernens mikromiljø og er blevet en nøglespiller i flere neurologiske sygdomme. At studere human microglia i sundhed og sygdom udgør en udfordring på grund af den ekstremt begrænsede forsyning af humane celler. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) afledt af menneskelige individer kan bruges til at omgå denne barriere. Her demonstreres det, hvordan man differentierer humane iPSC'er til microglia-lignende celler (iMG'er) til in vitro-eksperimenter . Disse iMG'er udviser de forventede og fysiologiske egenskaber ved microglia, herunder microglia-lignende morfologi, ekspression af korrekte markører og aktiv fagocytose. Derudover tilvejebringes dokumentation for isolering og mærkning af synaptosomsubstrater afledt af humane iPSC-afledte nedre motorneuroner (i3LMN'er). Et levende celle, langsgående billeddannelsesassay bruges til at overvåge opslugning af humane synaptosomer mærket med et pH-følsomt farvestof, hvilket muliggør undersøgelser af iMG's fagocytiske kapacitet. De protokoller, der er beskrevet heri, gælder bredt for forskellige områder, der undersøger human mikrogliabiologi og mikroglias bidrag til sygdom.

For at generere iMG'er ved hjælp af denne protokol er det vigtigt at starte med udifferentierede iPSC'er, der viser kompakt kolonimorfologi med veldefinerede kanter (figur 2A). Dissocierede iPSC'er, der opretholdes som beskrevet i EB-dannelsesafsnittet, vil danne sfæriske aggregater, kaldet EB'er, som vil vokse i størrelse indtil dag 4 af differentiering (figur 2B). Når EB'erne er indsamlet og belagt under de rette betingelser for PMP-generering, fastgøres ...

Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Denne protokol beskriver differentieringsprocessen for humaninducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) i mikroglialignende celler til in vitro-eksperimenter . Vi inkluderer også en detaljeret procedure til generering af humane synaptosomer fra iPSC-afledte lavere motorneuroner, der kan bruges som substrat til in vitro-fagocytoseassays ved hjælp af levende cellebilleddannelsessystemer.

Humane mikroglia-lignende celler: Differentiering fra inducerede pluripotente stamceller og in vitro levende celle fagocytose assay ved hjælp af humane synaptosomer

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

iPS-afledt microglia repræsenterer en biologisk relevant kilde til human microglia til in vitro-eksperimenter og er et vigtigt redskab til at undersøge microglia-biologi inden for sundhed og sygdom. Vi præsenterer en simpel microglia-differentieringsprotokol, der kræver minimal brug af vækstfaktorer og opnår høj renhed og udbytte. Vi demonstrerer også en fuldt humaniseret fagocytoseanalyse.iPSC-afledte microglia-lignende celler er meget følsomme over for mediefordampning. Du bør undgå at bruge brøndene i hjørnet af cellekulturpladen og fylde alle tomme brønde med vand for at forbedre overlevelsen. Når inducerede pluripotente stamceller eller iPSC'er har nået 80% sammenløb, adskilles kolonierne ved at vaske med en milliliter DPBS og tilsætte en milliliter dissociationsreagens i to minutter ved 37 grader Celsius.Fjern kolonierne ved hjælp af en celleløfter ved at skrabe flere gange for at skabe en enkeltcellesuspension. Saml suspensionen, og overfør dem til et 15 ml konisk rør indeholdende ni milliliter DPBS. Derefter centrifugeres cellerne ved 500 gange g i et minut, supernatanten fjernes, og resuspenderer i en milliliter af Embryoid Body eller EB, medium.Tag 10 mikroliter celler, og fortynd en til to med trypanblå. Tæl cellerne på et hæmocytometer, og baseret på celletællingen fortyndes cellebestanden til en endelig fortynding på 10.000 celler pr. 100 mikroliter. Til plettering af celler tilsættes 100 mikroliter af de fortyndede celler pr. brønd til en rundbundet 96-brøndplade med lav vedhæftning.Centrifuger pladen ved 125 gange g i tre minutter, og inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i fire dage. På dag to udskiftes det gamle halv-EB-medium med et friskt medium ved hjælp af en flerkanalspipette. For at generere primitive makrofagprækursorer eller PMP'er skal du belægge brøndene på en seks-brøndplade ved at tilføje en milliliter iskold Matrigel-belægningsopløsning.Derefter inkuberes pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i to timer eller natten over. På dag fire af EB-differentiering overføres EB'erne til de Matrigel-belagte brønde ved hjælp af en en milliliter pipettespids. Pipetere op og ned for at løsne EB'erne fra brønden.Hold derefter pladen på skrå, så EB'erne kan slå sig ned ved kanten af brønden. Når alle EB'erne er faldet til ro, pipetteres forsigtigt og udskiftes det gamle medium, mens EB holdes i kanten af brønden med tre milliliter frisklavet PMP komplet medium. Fordel cellerne jævnt i brøndene ved manuelt at blande pladen fra side til side og tilbage til fronten.Inkuber derefter pladen i syv dage for at give EB'erne mulighed for at fastgøre til bunden af brønden. Efter syv dage inspiceres EB'erne under et lysfeltmikroskop ved fire gange forstørrelse for at sikre, at de er fastgjort til bunden af brøndene. Udfør en halv medium ændring, og på dag 21 udskift det komplette medium med tre milliliter PMP komplet medium.På dag 28 skal du kigge efter runde celler kaldet PMP'er i supernatanten. Derefter opsamles mediet indeholdende PMP'erne ved hjælp af en 10 milliliter pipette og automatisk pipetter uden at forstyrre EB'erne. Overfør PMP'erne i mediet til et 15 ml konisk rør.Centrifuge de opsamlede PMP'er ved 200 gange g i fire minutter og aspirer supernatanten, før de suspenderes igen i en til to milliliter microglia-lignende celler eller IMG basalmedium. Tæl derefter cellerne på hæmocytometeret som beskrevet tidligere. Centrifuge resten af cellerne, og fortynd PMP'erne til den ønskede koncentration.Derefter plade cellerne med en tæthed på 10 til de femte celler pr. Kvadratcentimeter på cellekulturbehandlede plader ved hjælp af frisklavet IMG komplet medium. For levende cellefagocytoseassay er pladen 20 til 30 gange 10 til den fjerde PMP'er i en 96-brøndplade og 100 mikroliter IMG komplet medium og følg differentieringsprocessen i 10 dage. På dagen for analysen fjernes 40 mikroliter medium pr. Brønd, og tilsæt 10 mikroliter af den nukleare farvningsopløsning.Inkuber pladen i to timer. Tø de mærkede synaptosomer på is, og forsigtigt sonikere ved hjælp af en vandsonikator i et minut. Igen skal du straks placere synaptosomerne på is.Fortynd de mærkede synaptosomer i IMG komplet medium ved en mikroliter synaptosomer pr. 50 mikroliter medium. Til negativ kontrol fremstilles 60 mikromolær cytochalasin D i IMG komplet medium for at hæmme actinpolymerisation og dermed fagocytose. Derefter tilsættes 10 mikroliter af denne opløsning til hver brønd for en endelig koncentration på 10 mikromolar, og inkuberes i 30 minutter.Fjern pladen fra inkubatoren, og inkuber ved 10 grader Celsius i 10 minutter. Vedligehold pladen på is, og tilsæt 50 mikroliter medium indeholdende synaptosomer. Centrifuger pladen ved 270 gange g i tre minutter ved 10 grader Celsius, og hold pladen på is, indtil billeddannelsen er optaget.Indsæt pladen i en levende cellebilledlæser, og vælg de brønde, der skal analyseres. Vælg derefter et 20X objektivobjektiv. Juster derefter fokus, Light Emitting Diode eller LED, intensitet, integrationstid og forstærkning af lysfelt- og blå kanaler.Synaptosomfluorescensen skal være ubetydelig på det oprindelige tidspunkt. Vælg antallet af individuelle fliser, der skal erhverves i en montage pr. Brønd. Anskaf 16 fliser i midten af brønden, billeddannelse ca. 5% af det samlede brøndareal.Indstil temperaturen til 37 grader Celsius og det ønskede tidsinterval for billeddannelse. Åbn derefter analysesoftwaren. Åbn derefter eksperimentet, der indeholder billederne, og klik på ikonet Datareduktion.I menuen skal du vælge Billedsyning under Billedbehandlingsbehandling for at oprette et komplet billede fra de fire gange fire individuelle fliser i montagen med de parametre, der er beskrevet i tekstmanuskriptet. Definer en intensitetstærskel ved hjælp af DAPI- og RFP-kanalerne for disse billeder. Åbn et billede, og klik på Analyser.Under Analyse skal du vælge Cellulær analyse, og vælg et syet billede enten i DAPI- eller RFP-kanalerne under Analyse. Gå derefter til fanen Primær maske og tæl, og opret en tærskelværdi og objektstørrelsesværdier, der korrekt vælger cellekernerne i DAPI-kanalen eller synaptosomsignalet i RFP-kanalen. Hvis du vil tælle antallet af kerner, skal du gå til menuen Datareduktion og vælge Mobilanalyse under Billedanalyse.Gå igen til fanen Primær maske og tæl, og vælg de DAPI-syede billeder under Kanal og brug de parametre, der er beskrevet i tekstmanuskriptet. Gå derefter til fanen Beregnede målepunkter, og vælg Celleantal. For at få området for synaptosomsignalet skal du gå til menuen Datareduktion og vælge Cellulær analyse under Analyse.Gå igen til fanen Primær maske og tæl, og vælg RFP-syede billeder under Kanal og brug de parametre, der er beskrevet i tekstmanuskriptet. Gå derefter til fanen Beregnede målepunkter, og vælg Objektsumområde. På fanen Datareduktion skal du klikke på OK for at tillade softwaren at analysere alle de erhvervede billeder.Når billederne er analyseret, skal du eksportere værdierne Objektsumområde og Celleantal for hvert tidspunkt. Divider derefter objektsumområdet med celletællingen for at beregne det normaliserede område pr. Tidspunkt. Hvis du sammenligner flere behandlinger eller genotyper, beregnes fagocytoseindekset ved hjælp af den givne ligning.Udifferentierede iPSC'er viser kompakt kolonimorfologi med veldefinerede kanter. Dissocierede iPSC'er dannede sfæriske aggregater kaldet EB'er og voksede i størrelse indtil dag fire af differentiering. Når EB'erne er belagt til PMP-generering, fastgøres de til de Matrigel-belagte plader, og et lag af celler spredes og omgiver de sfæriske aggregater.På dag 28 vises runde celler med et stort cytoplasma til kerneforhold i suspensionen. Det anbefales kraftigt at dyrke iPSC'er i Laminin 521-belagte plader i stedet for Matrigel på grund af det højere PMP-udbytte i Laminin 521-belagte plader. Efter eksponering af PMP'er for IMG-medium erhverver celler en mikroglia-lignende morfologi med en lille cytoplasma i nærvær af aflange processer.Endvidere blev microglia-identitet verificeret ved immunfluorescerende farvning. Typisk udtrykker mere end 95% af cellerne IB1, og ca. 90% af cellerne udtrykker P2RY12 og TMEM119. Western blot-analyse bekræftede, at iPSC afledte lavere motorneuroner til humane synaptosomers udtrykte synaptiske markører, synaptophysin og postsynaptisk densitetsprotein 95.I kontrol sammenlignet med det oprindelige tidspunkt var det røde fluorescerende signal robust efter 10 timer, da de fleste synaptosomer var blevet opslugt og var lokaliseret til sure intracellulære rum. I Cytochalasin D-behandlede IMG'er indikerede en stærk reduktion af det røde signal i nul og 10 timer, at det detekterede signal skyldes fagocytiske hændelser. Området med opslugte synaptosomer steg med tiden indtil 16 timer.Imidlertid steg området med rødt signal fra cytochalasin D-behandlede celler ikke med tiden. iPS-afledte Microglia-lignende celler kan bruges til forskellige applikationer, herunder fagocytose og inflammatorisk respons i studiet af neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv derivering af humane Neuronal progenitorer og neuroner fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen af ​​Telencephalic glutamaterge neuroner fra humane pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af neurale Crest stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret Dopaminerg Neuron Differentiering fra menneskelige pluripotente stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman In Vitro Live-imaging analyse af Astrocyte-medieret fagocytose bruger pH indikator-konjugeret Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omdannelse af humane induceret pluripotente stamceller (iPSCs) til funktionel spinal og kraniel motor neuroner brug PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Afledning, ekspansion, kryopræservering og karakterisering af hjernemikrobielle endotelceller fra menneskeskabte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering af humane neuroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller til modellering af neuron-oligodendrocytinteraktioner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...