Name: human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Die Autoren danken Michael Ward für die Bereitstellung der WTC11 hNIL iPSC-Linie für die Motoneuronendifferenzierung und den Jackson Laboratories für die Lieferung der KOLF2.1J WT-Klon-B03-iPSC-Linie für die Mikroglia-Differenzierung. Wir danken auch Dorothy Schafer für ihre Unterstützung bei der Implementierung der Protokolle, Anthony Giampetruzzi und John Landers für ihre Hilfe beim Lebendzellbildgebungssystem sowie Hayden Gadd für seine technischen Beiträge während der Überarbeitung und Jonathan Jung für seine Mitarbeit an dieser Studie. Diese Arbeit wurde vom Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience der UMASS Chan Medical School und dem Angel Fund, Inc. unterstützt.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien müssen steril sein, und alle Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle iPSC-Linien sowie Wartungs- und Differenzierungsmedien sind im Materialverzeichnis beschrieben. Die unten dargestellte Mikroglia-Differenzierungsmethode basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen 7,8,12 mit den hieri...

<ol>
	<li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development.">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).</li><li>Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuroinflammation+and+neurodegeneration:+from+understanding+to+therapy.">Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells.">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia.">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li><li>Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages.">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).</li><li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+and+its+regulation:+a+therapeutic+target+in+Parkinson's+disease.">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+central+nervous+system+development+and+plasticity.">Microglia function in central nervous system development and plasticity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).</li><li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections.">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).</li><li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons.">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).</li><li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening.">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).</li><li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors.">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li><li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization.">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li></ol>

Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine effiziente Methode, um iPSC-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen in ~6-8 Wochen mit hoher Reinheit und in ausreichender Ausbeute zu erhalten, um Immunfluoreszenzexperimente und andere Assays durchzuführen, die eine höhere Anzahl von Zellen erfordern. Dieses Protokoll hat bis zu 1 × 106 iMGs in 1 Woche ergeben, was eine Protein- und RNA-Extraktion und entsprechende Downstream-Analysen (z.B. RNASeq, qRT-PCR, Western Blot, Massenspektrometrie) ermö...

Mikroglia sind die residenten Immunzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Mikroglia sind auch im erwachsenen Gehirn wichtig, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und aktiv auf Traumata und Krankheitsprozesse zu reagieren. Kumulative Evidenz zeigt, dass Mikroglia einen Schlüsselbeitrag zur Pathogenese multipler neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen leisten 1,2. Obwohl das aktuelle Wissen über die Mikrogliabiologie überwiegend aus Mausmodellen abgeleitet wurde, haben neuere Studien wichtige Unterschiede zwischen murinen und menschlichen Mikroglia aufgeklärt, was die Notwendigkeit der Entwicklung von Technologien zur Untersuchung der Genetik und der biologischen Funktionen menschlicher Mikroglia unterstreicht 3,4. Die Isolierung von Mikroglia aus seziertem Primärgewebe kann die Eigenschaften der Mikroglia stark verändern5, was möglicherweise die mit solchen Zellen erzielten Ergebnisse verwirrt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, humane iPS-Zellen in iMGs zu differenzieren und dadurch ein Zellkultursystem zur Untersuchung menschlicher Mikroglia unter basalen Bedingungen bereitzustellen. Darüber hinaus ist hierin ein Phagozytose-Assay unter Verwendung eines vollständig menschlichen Modellsystems enthalten, um die Funktionalität von iMGs sowohl als Qualitätskontrollmaßnahme als auch zur Beurteilung der iMG-Dysfunktion im Kontext der Krankheit zu untersuchen.
Mehrere Protokolle zur Mikroglia-Differenzierung von iPS-Zellen sind kürzlich in der Literatur 6,7,8,9,10 aufgetaucht. Mögliche Nachteile einiger Protokolle sind verlängerte oder lange Differenzierungsperioden, die Zugabe mehrerer Wachstumsfaktoren und/oder komplexe experimentelle Verfahren 6,9,10. Hier wird eine "benutzerfreundliche" Differenzierungsmethode demonstriert, die Aspekte der Mikroglia-Ontogenese durch Differenzierung von iPS-Zellen in Vorläuferzellen, die als primitive Makrophagen-Vorläufer (PMPs) bezeichnet werden, rekapituliert7,11. PMPs werden wie zuvor beschrieben generiert, wobei einige Optimierungen hierin12 vorgestellt werden. Die PMPs ahmen MYB-unabhängige Dottersack-abgeleitete Makrophagen nach, die während der Embryonalentwicklung Mikroglia erzeugen, indem sie vor dem Schließen der Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eindringen13. Um PMPs in iMGs zu differenzieren, verwendeten wir eine schnelle und vereinfachte Monokulturmethode, die auf Protokollen von Haenseler et al. und Brownjohn et al. basiert, mit einigen Modifikationen, um eine effiziente Mikroglia-Differenzierungsmethode zu erzeugen, in der iMGs Mikroglia-angereicherte Marker robust exprimieren 7,8. Diese Differenzierungsmethode kann in Laboratorien mit Expertise in der Kultur von iPSCs und mit Forschungszielen reproduziert werden, die darauf abzielen, die Mikrogliabiologie anhand eines humanen Modellsystems zu untersuchen.
iPSC-abgeleitete Mikroglia stellen eine biologisch relevante Quelle menschlicher Mikroglia für In-vitro-Experimente dar und sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung mikroglialer kanonischer Funktionen, einschließlich Phagozytose. Mikroglia sind die professionellen Phagozyten des Gehirns und des ZNS, wo sie Zelltrümmer, aggregierte Proteine und abgebautes Myelin14 entfernen. Mikroglia funktionieren auch beim synaptischen Umbau durch Verschlingen von Synapsen und bei der Abwehr äußerer Infektionen durch Phagozytose von Krankheitserregern15,16. In diesem Protokoll wird die Phagozytose durch iMGs unter Verwendung menschlicher Synaptosomen als Material für das iMG-Engulfment bewertet. Zu diesem Zweck wird eine Beschreibung zur Isolierung von Synaptosomen beschrieben, die von humaneni3LMNs abgeleitet sind. Die i3-LMN-abgeleiteten menschlichen Synaptosomen sind mit einem pH-sensitiven Farbstoff markiert, der die Quantifizierung von Synaptosomen ermöglicht, die während der Phagosomenverarbeitung und des Abbaus in vitro in sauren Kompartimenten lokalisiert sind. Ein Phagozytose-Assay mit Lebendzellmikroskopie wird gezeigt, um den dynamischen Prozess der Mikroglia-Verschlängung in Echtzeit zu überwachen. Dieser funktionelle Assay schafft eine Grundlage, um mögliche Defekte der Mikroglia-Phagozytose in Gesundheit und Krankheit mit einem vollständigen menschlichen System zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies for immunofluorescence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IBA1 rabbit antibody</td>
			<td>Wako Chemical USA</td>
			<td>NC9288364</td>
			<td>1:350 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P2RY12 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA014518</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TMEM119 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA051870</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Western blot analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A6344</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 mouse antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1596</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (100 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (75 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate (25 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainers</td>
			<td>&#160;Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter, Double End, Flat Blade &#38; Narrow Blade, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adherence round-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353847,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>&#160;Corning</td>
			<td>25058CI</td>
			<td>dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td>dissociation reagents used for microglia differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating reagents for cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#8482;</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred as to extracellular matrix coating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAdhere Laminin-521</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>77004</td>
			<td>Referred as to laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P3655</td>
			<td>Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mTeSR Plus Kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>100-0276</td>
			<td>To prepare iPSC media mixed the components to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of EB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>final concentration 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20A</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12001-988</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td>PeproTech or Biologend</td>
			<td>200-34 or 577904</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Complete induction media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>565790</td>
			<td>final concentration 0.2 &#956;M and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>final concentration 2 &#956;g/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Neuron media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3653401</td>
			<td>final concentration 1x for media and suplemment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC lines used in this study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLF2.1J: WT clone B03</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WTC11 hNIL</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptosome isolation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87793</td>
			<td>Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagocytosis assay dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Ready reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, succinimidyl ester</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36600</td>
			<td>Referred as to pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other cell-culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% Solution</td>
			<td>AMRESCO INC</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9285</td>
			<td>Reconstitute to 40 mM in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Referred as to DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td>Referred as to laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 live cell imaging reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>version 3.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Therm Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td></td>
			<td>refer as tube shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Mode Transsonic 310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes

Mikroglia sind die ansässigen Immunzellen myeloischen Ursprungs, die die Homöostase in der Mikroumgebung des Gehirns aufrechterhalten und zu einem Schlüsselakteur bei mehreren neurologischen Erkrankungen geworden sind. Die Untersuchung menschlicher Mikroglia in Gesundheit und Krankheit stellt aufgrund der extrem begrenzten Versorgung mit menschlichen Zellen eine Herausforderung dar. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die von menschlichen Individuen stammen, können verwendet werden, um diese Barriere zu umgehen. Hier wird gezeigt, wie menschliche iPS-Zellen in Mikroglia-ähnliche Zellen (iMGs) für In-vitro-Experimente differenziert werden können. Diese iMGs zeigen die erwarteten und physiologischen Eigenschaften von Mikroglia, einschließlich Mikroglia-ähnlicher Morphologie, Expression geeigneter Marker und aktiver Phagozytose. Zusätzlich wird eine Dokumentation zur Isolierung und Markierung von Synaptosomensubstraten bereitgestellt, die von humanen iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen (i3LMNs) stammen. Ein Lebendzell-Longitudinal-Imaging-Assay wird verwendet, um das Verschlingen menschlicher Synaptosomen zu überwachen, die mit einem pH-empfindlichen Farbstoff markiert sind, was Untersuchungen der phagozytischen Kapazität von iMG ermöglicht. Die hierin beschriebenen Protokolle sind allgemein auf verschiedene Bereiche anwendbar, die die Biologie der menschlichen Mikroglia und den Beitrag von Mikroglia zur Krankheit untersuchen.

Um iMGs mit diesem Protokoll zu generieren, ist es wichtig, mit undifferenzierten iPSCs zu beginnen, die eine kompakte Koloniemorphologie mit gut definierten Kanten aufweisen (Abbildung 2A). Dissoziierte iPSCs, die wie im Abschnitt EB-Bildung beschrieben beibehalten werden, bilden sphärische Aggregate, die als EBs bezeichnet werden und bis zum Tag 4 der Differenzierung an Größe zunehmen (Abbildung 2B). Sobald die EBs gesammelt und unter den geeigneten Bedingu...

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Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Dieses Protokoll beschreibt den Differenzierungsprozess von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in Mikroglia-ähnliche Zellen für In-vitro-Experimente. Wir enthalten auch ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung menschlicher Synaptosomen aus iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen, die als Substrat für In-vitro-Phagozytose-Assays mit Lebendzellbildgebungssystemen verwendet werden können.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

iPS-abgeleitete Mikroglia stellen eine biologisch relevante Quelle menschlicher Mikroglia für In-vitro-Experimente dar und sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der Mikrogliabiologie in Gesundheit und Krankheit. Wir präsentieren ein einfaches Mikroglia-Differenzierungsprotokoll, das nur minimale Verwendung von Wachstumsfaktoren erfordert und eine hohe Reinheit und Ausbeute erreicht. Außerdem zeigen wir einen vollständig humanisierten Phagozytose-Assay.iPSC-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen sind sehr empfindlich gegenüber Medienverdampfung. Sie sollten es vermeiden, die Vertiefungen in der Ecke der Zellkulturplatte zu verwenden, und alle leeren Brunnen mit Wasser füllen, um das Überleben zu verbessern. Sobald induzierte pluripotente Stammzellen oder iPSCs eine Konsistenz von 80% erreicht haben, dissoziieren Sie die Kolonien, indem Sie mit einem Milliliter DPBS waschen und einen Milliliter eines Dissoziationsreagenzes für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius hinzufügen.Entfernen Sie die Kolonien mit einem Zelllifter, indem Sie mehrmals kratzen, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Sammeln Sie die Suspension und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen mit neun Milliliter DPBS. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal g für eine Minute, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in einem Milliliter des embryoiden Körpers oder EB-Mediums.Nehmen Sie 10 Mikroliter Zellen und verdünnen Sie ein bis zwei mit Trypanblau. Zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer und verdünnen Sie basierend auf der Zellzahl den Zellbestand auf eine endgültige Verdünnung von 10.000 Zellen pro 100 Mikroliter. Für die Beschichtung von Zellen fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Zellen pro Vertiefung in eine runde 96-Well-Platte mit geringer Haftung hinzu.Zentrifugieren Sie die Platte bei 125 mal g für drei Minuten und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier Tage. Ersetzen Sie am zweiten Tag mit einer Mehrkanalpipette das alte Halb-EB-Medium durch ein frisches Medium. Um primitive Makrophagen-Vorläufer oder PMPs zu erzeugen, beschichten Sie die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte durch Zugabe eines Milliliters eiskalter Matrigel-Beschichtungslösung.Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Stunden oder über Nacht. Am vierten Tag der EB-Differenzierung werden die EBs mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze in die matrigelbeschichteten Vertiefungen überführt. Pipettieren Sie auf und ab, um die EBs aus dem Bohrloch zu entfernen.Halten Sie dann die Platte geneigt, damit sich die EBs am Rand des Brunnens absetzen können. Sobald sich alle EBs beruhigt haben, pipetten und ersetzen Sie vorsichtig das alte Medium, während Sie das EB mit drei Milliliter frisch zubereitetem PMP-Komplettmedium am Rand des Bohrlochs halten. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen, indem Sie die Platte manuell von Seite zu Seite und von hinten nach vorne mischen.Dann inkubieren Sie die Platte für sieben Tage, damit sich die EBs am Boden des Bohrlochs befestigen können. Nach sieben Tagen untersuchen Sie die EBs unter einem Lichtfeldmikroskop mit vierfacher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie am Boden der Vertiefungen befestigt sind. Führen Sie einen halben Mediumwechsel durch und ersetzen Sie an Tag 21 das komplette Medium durch drei Milliliter PMP-Medium.Suchen Sie an Tag 28 nach runden Zellen, die als PMPs im Überstand bezeichnet werden. Sammeln Sie dann das Medium, das die PMPs enthält, mit einer 10-Milliliter-Pipette und einem automatischen Pipetter, ohne die EBs zu stören. Die PMPs im Medium in ein 15-Milliliter-konisches Rohr überführen.Zentrifugieren Sie die gesammelten PMPs bei 200 mal g für vier Minuten und saugen Sie den Überstand ab, bevor Sie sie in ein bis zwei Milliliter mikrogliaähnlicher Zellen oder IMG-Basalmedium wieder suspendieren. Zählen Sie dann die Zellen auf dem Hämozytometer wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie den Rest der Zellen und verdünnen Sie die PMPs auf die gewünschte Konzentration.Anschließend werden die Zellen mit einer Dichte von 10 bis fünf Zellen pro Quadratzentimeter auf zellkulturbehandelten Platten mit frisch aufbereitetem IMG-Komplettmedium beschichtet. Für den Lebendzell-Phagozytose-Assay werden 20 bis 30 mal 10 bis vierte PMPs in eine 96-Well-Platte und 100 Mikroliter IMG-Komplettmedium gegeben und der Differenzierungsprozess für 10 Tage verfolgt. Am Tag des Assays 40 Mikroliter Medium pro Vertiefung entfernen und 10 Mikroliter der Kernfärbelösung hinzufügen.Inkubieren Sie die Platte für zwei Stunden. Die markierten Synaptosomen auf Eis auftauen und eine Minute lang vorsichtig mit einem Wasserbeschaller beschallen. Legen Sie die Synaptosomen sofort auf Eis.Verdünnen Sie die markierten Synaptosomen in IMG Complete Medium bei einem Mikroliter Synaptosomen pro 50 Mikroliter Medium. Zur Negativkontrolle werden 60 mikromolare Cytochalasin D in IMG-Komplettmedium hergestellt, um die Aktinpolymerisation und damit die Phagozytose zu hemmen. Dann fügen Sie 10 Mikroliter dieser Lösung zu jeder Vertiefung für eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten.Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und inkubieren Sie bei 10 Grad Celsius für 10 Minuten. Halten Sie die Platte auf Eis und fügen Sie 50 Mikroliter Medium hinzu, das Synaptosomen enthält. Zentrifugieren Sie die Platte bei 270 mal g für drei Minuten bei 10 Grad Celsius und halten Sie die Platte bis zur Bildaufnahme auf Eis.Führen Sie die Platte in ein Live-Cell-Imaging-Lesegerät ein und wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus. Wählen Sie dann ein 20-faches Objektiv aus. Passen Sie als Nächstes den Fokus, die Leuchtdiode oder LED, die Intensität, die Integrationszeit und die Verstärkung der Hellfeld- und Blaukanäle an.Die Synaptosomenfluoreszenz sollte zum Anfangszeitpunkt vernachlässigbar sein. Wählen Sie die Anzahl der einzelnen Kacheln aus, die in einer Montage pro Vertiefung erworben werden sollen. Erfassen Sie 16 Kacheln in der Mitte des Bohrlochs, die etwa 5 % der gesamten Bohrlochfläche abbilden.Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und das gewünschte Zeitintervall für die Bildgebung ein. Öffnen Sie als Nächstes die Analysesoftware. Öffnen Sie dann das Experiment, das die Bilder enthält, und klicken Sie auf das Symbol Datenreduktion.Wählen Sie im Menü unter Bildbearbeitung die Option Imaging Stitching aus, um ein vollständiges Bild aus den vier mal vier einzelnen Kacheln in der Montage mit den im Textmanuskript beschriebenen Parametern zu erstellen. Definieren Sie einen Intensitätsschwellenwert mithilfe der DAPI- und RFP-Kanäle für diese Bilder. Öffnen Sie ein Bild und klicken Sie auf Analysieren.Wählen Sie unter Analyse die Option Mobilfunkanalyse aus, und wählen Sie unter Erkennungskanal ein zusammengefügtes Bild entweder im DAPI- oder RFP-Kanal aus. Wechseln Sie als Nächstes zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl, und legen Sie einen Schwellenwert und Objektgrößenwerte fest, die die Zellkerne im DAPI-Kanal oder das Synaptosomensignal im RFP-Kanal richtig auswählen. Um die Anzahl der Kerne zu zählen, wechseln Sie zum Menü Datenreduktion, und wählen Sie unter Bildanalyse die Option Zellanalyse aus.Wechseln Sie erneut zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl, wählen Sie unter Kanal die DAPI-zusammengefügten Bilder aus, und verwenden Sie die im Textmanuskript beschriebenen Parameter. Wechseln Sie anschließend zur Registerkarte Berechnete Metriken und wählen Sie Zellenanzahl aus. Um dann den Bereich des Synaptosomensignals zu erhalten, wechseln Sie zum Menü Datenreduktion, und wählen Sie unter Analyse die Option Zelluläre Analyse aus.Wechseln Sie erneut zur Registerkarte Primäre Maske und Anzahl, wählen Sie unter Kanal die Option RFP-gestickte Bilder aus, und verwenden Sie die im Textmanuskript aufgeführten Parameter. Wechseln Sie anschließend zur Registerkarte Berechnete Metriken und wählen Sie Objektsummenbereich. Klicken Sie auf der Registerkarte Datenreduktion auf OK, damit die Software alle erfassten Bilder analysieren kann.Sobald die Bilder analysiert wurden, exportieren Sie die Werte für Objektsummenbereich und Zellenanzahl für jeden Zeitpunkt. Teilen Sie dann die Objektsummenfläche durch die Zellanzahl, um die normalisierte Fläche pro Zeitpunkt zu berechnen. Wenn Sie mehrere Behandlungen oder Genotypen vergleichen, berechnen Sie den Phagozytoseindex mit der angegebenen Gleichung.Undifferenzierte iPSCs zeigen eine kompakte Koloniemorphologie mit wohldefinierten Kanten. Dissoziierte iPSCs bildeten sphärische Aggregate, die als EBs bezeichnet werden, und wachsen bis zum vierten Tag der Differenzierung. Wenn die EBs für die PMP-Erzeugung plattiert werden, heften sie sich an die matrigelbeschichteten Platten, und eine Zellschicht breitet sich aus und umgibt die kugelförmigen Aggregate.Am Tag 28 erscheinen runde Zellen mit einem großen Zytoplasma-Zellkern-Verhältnis in der Suspension. Es wird dringend empfohlen, iPSCs in Laminin 521-beschichteten Platten anstelle von Matrigel zu kultivieren, da die PMP-Ausbeute in Laminin 521-beschichteten Platten höher ist. Nach der Exposition von PMPs gegenüber dem IMG-Medium erwerben die Zellen eine mikrogliaähnliche Morphologie mit einem kleinen Zytoplasma in Gegenwart von länglichen Prozessen.Darüber hinaus wurde die Mikroglia-Identität durch Immunfluoreszenzfärbung überprüft. Typischerweise exprimieren mehr als 95% der Zellen IB1 und etwa 90% der Zellen exprimieren P2RY12 und TMEM119. Die Western-Blot-Analyse bestätigte, dass iPSC niedrigere Motoneuronen für humane Synaptosomen-exprimierte synaptische Marker, Synaptophysin und postsynaptisches Dichteprotein 95, ableitete.Im Vergleich zum ursprünglichen Zeitpunkt war das rot fluoreszierende Signal nach 10 Stunden robust, da die meisten Synaptosomen verschluckt worden waren und in sauren intrazellulären Kompartimenten lokalisiert waren. In Cytochalasin D-behandelten IMGs zeigte eine starke Reduktion des roten Signals für null und 10 Stunden, dass das detektierte Signal aus phagozytischen Ereignissen resultiert. Die Fläche der verschlungenen Synaptosomen nahm mit der Zeit bis zu 16 Stunden zu.Die Fläche des roten Signals von Cytochalasin D-behandelten Zellen nahm jedoch mit der Zeit nicht zu. iPS-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, einschließlich Phagozytose und Entzündungsreaktion bei der Untersuchung von neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Forschung

Neurowissenschaften

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...