Name: human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

המחברים מודים למייקל וורד על אספקת קו ה- iPSC של WTC11 hNIL להתמיינות נוירונים מוטוריים ולמעבדות ג'קסון על אספקת קו ה- KOLF2.1J WT clone B03 iPSC המשמש להבחנה במיקרוגליה. אנו מודים גם לדורותי שפר על תמיכתה במהלך יישום הפרוטוקולים, אנתוני גיאמפטרוצי וג'ון לנדרס על עזרתם במערכת ההדמיה של תאים חיים, כמו גם להיידן גאד על תרומתו הטכנית במהלך התיקונים ולג'ונתן יונג על שיתוף הפעולה שלו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן דן ודיאן ריצ'יו למדעי המוח מבית הספר לרפואה UMASS Chan וקרן אנג'ל בע"מ.

הערה: כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה חייבים להיות סטריליים, וכל השלבים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית בתנאים סטריליים. כל קווי ה- iPSC, כמו גם מדיית התחזוקה וההבחנה, מתוארים בטבלת החומרים. שיטת ההבחנה במיקרוגליה המתוארת להלן מבוססת על פרוטוקולים 7,8,12<sup clas...

<ol>
	<li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development.">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).</li><li>Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuroinflammation+and+neurodegeneration:+from+understanding+to+therapy.">Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells.">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia.">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li><li>Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages.">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).</li><li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+and+its+regulation:+a+therapeutic+target+in+Parkinson's+disease.">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+central+nervous+system+development+and+plasticity.">Microglia function in central nervous system development and plasticity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).</li><li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections.">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).</li><li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons.">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).</li><li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening.">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).</li><li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors.">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li><li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization.">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li></ol>

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה יעילה להשגת תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPSC תוך ~6-8 שבועות בטוהר גבוה ובתפוקה מספקת לביצוע ניסויים אימונופלואורסצנטיים ומבחנים אחרים הדורשים מספר גבוה יותר של תאים. פרוטוקול זה הניב עד 1 × 106 iMGs בשבוע אחד, המאפשר מיצוי חלבונים ורנ"א וניתוחים ת?...

מיקרוגליה הם תאי מערכת החיסון המתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. מיקרוגליה חשובה גם במוח הבוגר לשמירה על הומאוסטזיס ולתגובה פעילה לתהליכי טראומה ומחלות. ראיות מצטברות מראות כי מיקרוגליה הם תורמים מרכזיים לפתוגנזה של מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות מרובות 1,2. אף על פי שהידע הנוכחי על ביולוגיה של מיקרוגליה נגזר בעיקר ממודלים של עכברים, מחקרים אחרונים הבהירו הבדלים חשובים בין מורין למיקרוגליה אנושית, והדגישו את הצורך בפיתוח טכנולוגיות לחקר הגנטיקה והתפקודים הביולוגיים של המיקרוגליה האנושית 3,4. בידוד של מיקרוגליה מרקמה ראשונית מנותקת יכול לשנות באופן חמור את תכונות המיקרוגליה5, מה שעלול לבלבל תוצאות שנרכשו עם תאים כאלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים ל-iMGs, ובכך לספק מערכת תרבית תאים לחקר מיקרוגליה אנושית בתנאים בסיסיים. יתר על כן, בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מערכת מודל אנושית מלאה נכללת כאן כאמצעי לחקור את הפונקציונליות של iMGs, הן כמדד בקרת איכות והן כדי להעריך תפקוד לקוי של iMG בהקשר של מחלה.
פרוטוקולים מרובים להתמיינות מיקרוגליה מ- iPSCs הופיעו לאחרונה בספרות 6,7,8,9,10. חסרונות פוטנציאליים של פרוטוקולים מסוימים כוללים תקופות ממושכות או ארוכות של הבחנה, תוספת של גורמי גדילה מרובים ו / או הליכים ניסיוניים מורכבים 6,9,10. כאן מודגמת שיטת התמיינות "ידידותית למשתמש", המשחזרת היבטים של מיקרוגליה אונטוגנית באמצעות התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים מקדימים המכונים מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)7,11. PMPs נוצרים כפי שתואר קודם לכן, עם כמה אופטימיזציות המוצגות כאן12. ה-PMPs מחקים מקרופאגים שמקורם בחלמון שאינו תלוי בחלמון, אשר מולידים מיקרוגליה במהלך ההתפתחות העוברית על ידי פלישה למוח לפני סגירת מחסום הדם-מוח13. כדי להבדיל באופן סופי בין PMPs ל-iMGs, השתמשנו בשיטת מונוקולטורה מהירה ופשוטה המבוססת על פרוטוקולים של Haenseler et al. ו-Brownjohn et al., עם כמה שינויים כדי ליצור שיטת בידול יעילה של מיקרוגליה, שבה iMGs מבטאים בחוזקה סמנים מועשרים במיקרוגליה 7,8. ניתן לשכפל שיטת בידול זו במעבדות עם מומחיות בתרבית של iPSCs ועם מטרות מחקר שמטרתן לחקור את הביולוגיה של מיקרוגליה באמצעות מערכת מודל אנושית.
מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC מהווה מקור רלוונטי ביולוגית של מיקרוגליה אנושית לניסויים במבחנה, והם כלי חשוב לחקר תפקודים קנוניים של מיקרוגליה, כולל פאגוציטוזה. מיקרוגליה הם הפאגוציטים המקצועיים של המוח ושל מערכת העצבים המרכזית, שם הם מנקים פסולת תאים, חלבונים מצטברים ומיאלין14 פגום. מיקרוגליה מתפקדת גם בשיפוץ סינפטי על ידי בליעת סינפסות ובהגנה מפני זיהומים חיצוניים באמצעות פאגוציטוזה של פתוגנים15,16. בפרוטוקול זה, פאגוציטוזה על ידי iMGs מוערכת באמצעות סינפטוזומים אנושיים כחומר לבליעת iMG. לשם כך מתואר תיאור לבידוד סינפטוזומים הנגזרים מ-i3LMNs אנושיים. הסינפטוזומים האנושיים שמקורם ב-i3LMN מסומנים בצבע רגיש ל-pH המאפשר כימות של סינפטוזומים הממוקמים בתוך מדורים חומציים במהלך עיבוד פגוזומים והשפלה במבחנה. בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים מוצגת לניטור התהליך הדינמי של בליעת מיקרוגליה בזמן אמת. בדיקה תפקודית זו קובעת בסיס לחקור פגמים אפשריים בפאגוציטוזה מיקרוגליאלית בבריאות ובמחלות באמצעות מערכת אנושית שלמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies for immunofluorescence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IBA1 rabbit antibody</td>
			<td>Wako Chemical USA</td>
			<td>NC9288364</td>
			<td>1:350 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P2RY12 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA014518</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TMEM119 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA051870</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Western blot analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A6344</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 mouse antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1596</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (100 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (75 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate (25 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainers</td>
			<td>&#160;Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter, Double End, Flat Blade &#38; Narrow Blade, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adherence round-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353847,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>&#160;Corning</td>
			<td>25058CI</td>
			<td>dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td>dissociation reagents used for microglia differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating reagents for cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#8482;</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred as to extracellular matrix coating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAdhere Laminin-521</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>77004</td>
			<td>Referred as to laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P3655</td>
			<td>Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mTeSR Plus Kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>100-0276</td>
			<td>To prepare iPSC media mixed the components to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of EB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>final concentration 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20A</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12001-988</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td>PeproTech or Biologend</td>
			<td>200-34 or 577904</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Complete induction media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>565790</td>
			<td>final concentration 0.2 &#956;M and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>final concentration 2 &#956;g/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Neuron media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3653401</td>
			<td>final concentration 1x for media and suplemment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC lines used in this study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLF2.1J: WT clone B03</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WTC11 hNIL</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptosome isolation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87793</td>
			<td>Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagocytosis assay dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Ready reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, succinimidyl ester</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36600</td>
			<td>Referred as to pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other cell-culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% Solution</td>
			<td>AMRESCO INC</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9285</td>
			<td>Reconstitute to 40 mM in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Referred as to DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td>Referred as to laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 live cell imaging reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>version 3.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Therm Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td></td>
			<td>refer as tube shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Mode Transsonic 310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes

מיקרוגליה הם תאי החיסון המקומיים ממוצא מיאלואידי המקיימים הומאוסטזיס במיקרו-סביבה של המוח והפכו לשחקן מפתח במחלות נוירולוגיות מרובות. חקר המיקרוגליה האנושית בבריאות ובמחלות מהווה אתגר בשל האספקה המוגבלת ביותר של תאים אנושיים. ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם באנשים אנושיים כדי לעקוף מחסום זה. כאן, הוא מדגים כיצד להתמיין תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים אנושיים לתאים דמויי מיקרוגליה (iMGs) לצורך ניסויים במבחנה . iMGs אלה מציגים את התכונות הצפויות והפיזיולוגיות של מיקרוגליה, כולל מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה, ביטוי של סמנים תקינים ופאגוציטוזה פעילה. בנוסף, מסופק תיעוד לבידוד ותיוג של מצעי סינפטוזום שמקורם בנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב-iPSC אנושי (i3LMNs). בדיקת הדמיה אורכית של תאים חיים משמשת לניטור בליעה של סינפטוזומים אנושיים המסומנים בצבע רגיש ל-pH, ומאפשרת לחקור את היכולת הפאגוציטית של iMG. הפרוטוקולים המתוארים כאן ישימים באופן נרחב לתחומים שונים החוקרים את הביולוגיה של המיקרוגליה האנושית ואת תרומתה של המיקרוגליה למחלות.

כדי ליצור iMGs באמצעות פרוטוקול זה, חשוב להתחיל עם iPSCs לא מובחנים שמראים מורפולוגיה של מושבה קומפקטית עם קצוות מוגדרים היטב (איור 2A). iPSCs מנותקים המוחזקים כמתואר בסעיף היווצרות EB ייצרו אגרגטים כדוריים, המכונים EBs, אשר יגדלו בגודלם עד ליום 4 של ההתמיינות (איור 2B). ...

Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) לתאים דמויי מיקרוגליה לצורך ניסויים במבחנה . אנו כוללים גם הליך מפורט ליצירת סינפטוזומים אנושיים מנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC שיכולים לשמש כמצע למבחני פאגוציטוזה במבחנה באמצעות מערכות הדמיה של תאים חיים.

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

מיקרוגליה שמקורה ב-iPS מהווה מקור רלוונטי ביולוגית של מיקרוגליה אנושית לניסויים במבחנה, ומהווה כלי חשוב לחקר הביולוגיה של המיקרוגליה בבריאות ובמחלות. אנו מציגים פרוטוקול בידול מיקרוגליה פשוט הדורש שימוש מינימלי בגורמי גדילה ומשיג טוהר ותפוקה גבוהים. כמו כן, אנו מדגימים בדיקת פאגוציטוזה אנושית לחלוטין.תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPSC רגישים מאוד לאידוי מדיה. כדאי להימנע משימוש בבארות שבפינת צלחת תרבית התאים, ולמלא את כל הבארות הריקות במים כדי לשפר את ההישרדות. לאחר המושרה תאי גזע פלוריפוטנטיים, או iPSCs, הגיעו למפגש של 80%, מנתקים את המושבות על ידי שטיפה עם מיליליטר אחד של DPBS, והוספת מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס.נתקו את המושבות באמצעות מרים תאים על ידי גירוד מספר פעמים כדי ליצור תרחיף של תא בודד. לאסוף את ההשעיה, ולהעביר אותם צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של DPBS. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים ב 500 פעמים גרם במשך דקה אחת, להסיר את supernatant, ו ressuse במיליליטר אחד של גוף העובר, או EB, בינוני.קח 10 microliters של תאים, לדלל אחד עד שניים עם כחול טריפאן. לספור את התאים על hemocytometer, ובהתבסס על ספירת התאים, לדלל את מלאי התא לדילול סופי של 10, 000 תאים לכל 100 microliters. עבור ציפוי תאים, הוסף 100 מיקרוליטרים של התאים המדוללים לכל באר לצלחת 96 באר עגולה עם דבקות נמוכה.צנטריפוגה את הצלחת ב 125 פעמים גרם במשך שלוש דקות, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים. ביום השני, באמצעות פיפטה רב ערוצית, החלף את מדיום חצי EB הישן במדיום טרי. כדי ליצור מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים, או PMPs, מצפים את הבארות של צלחת בת שש בארות על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת ציפוי מטריגל קרה כקרח.לאחר מכן לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעתיים, או לילה. ביום הרביעי של התמיינות EB, באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד, מעבירים את ה- EBs לבארות המצופות במטריגל. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק את ה- EBs מהבאר.לאחר מכן החזיקו את הצלחת מוטה כדי לאפשר ל-EBs להתיישב בקצה הבאר. לאחר שכל ה- EBs התיישבו, פיפטה עדינה והחלף את המדיום הישן, תוך שמירה על ה- EB בקצה הבאר עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם של PMP מוכן טרי. פזרו באופן שווה את התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית.לאחר מכן דגירה של הצלחת במשך שבעה ימים כדי לאפשר ל- EBs להתחבר לתחתית הבאר. לאחר שבעה ימים, בדקו את ה-EBs תחת מיקרוסקופ שדה אור בהגדלה של פי ארבעה כדי לוודא שהם מחוברים לתחתית הבארות. בצע שינוי חצי בינוני, וביום 21, החלף את המדיום השלם בשלושה מיליליטר של מדיום שלם PMP.ביום ה-28, חפשו תאים עגולים המכונים PMPs בסופר-נטנט. לאחר מכן אסוף את המדיום המכיל את ה- PMPs באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר ופיפטר אוטומטי מבלי להפריע ל- EBs. מעבירים את ה- PMPs בתווך לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.צנטריפוגה של PMPs שנאספו ב 200 פעמים g במשך ארבע דקות ולשאוף את supernatant לפני השעיה מחדש אותם אחד עד שני מיליליטר של תאים דמויי מיקרוגליה, או מדיום בסיסי IMG. לאחר מכן לספור את התאים על hemocytometer כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה של שאר התאים, ולדלל את PMPs לריכוז הרצוי.לאחר מכן צלחת את התאים בצפיפות של 10 עד 5 תאים לסנטימטר מרובע על צלחות שטופלו בתרבית תאים באמצעות מדיום IMG שלם שהוכן זה עתה. עבור בדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים, צלחת 20 עד 30 פעמים 10 עד PMPs הרביעי לתוך צלחת 96 באר ו 100 microliters של IMG להשלים בינוני ולעקוב אחר תהליך ההתמיינות במשך 10 ימים. ביום הבדיקה, להסיר 40 microliters של בינוני לכל באר, ולהוסיף 10 microliters של פתרון צביעה גרעינית.לדגור את הצלחת במשך שעתיים. הפשירו את הסינפטוזומים המסומנים על הקרח, וסוניקו בעדינות באמצעות סוניק מים למשך דקה אחת. שוב, מיד להניח את הסינפטוזומים על קרח.לדלל את הסינפטוזומים המסומנים במדיום שלם IMG במיקרוליטר אחד של סינפטוזומים לכל 50 מיקרוליטרים של בינוני. לשליטה שלילית, הכינו 60 מיקרומולר ציטוכלסין D במדיום שלם IMG כדי לעכב פילמור אקטין, ובכך פאגוציטוזה. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של פתרון זה לכל באר עבור ריכוז סופי של 10 micromolar, ולדגור במשך 30 דקות.מוציאים את הצלחת מהאינקובטור, ודוגרים ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמרו על הצלחת על קרח, והוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום המכיל סינפטוזומים. צנטריפוגה של הצלחת 270 פעמים גרם במשך שלוש דקות ב 10 מעלות צלזיוס, ולשמור את הצלחת על קרח עד רכישת הדמיה.הכנס את הלוח לקורא הדמיית תאים חי, ובחר את הבארות לניתוח. לאחר מכן בחרו עדשת מטרה של 20X. לאחר מכן, כוונן את המיקוד, הדיודה פולטת האור או ה-LED, העוצמה, זמן האינטגרציה והרווח של ערוצי השדה הבהיר והכחול.הפלואורסצנציה הסינפטוזומית צריכה להיות זניחה בנקודת הזמן הראשונית. בחר את מספר האריחים הבודדים שיש לרכוש במונטאז' לכל באר. רכשו 16 אריחים במרכז הבאר, תוך הדמיה של כ-5% משטח הבאר הכולל.הגדר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס, ואת מרווח הזמן הרצוי להדמיה. לאחר מכן, פתח את תוכנת הניתוח. לאחר מכן פתח את הניסוי המכיל את התמונות ולחץ על סמל הפחתת הנתונים.בתפריט, בחר תפירת הדמיה תחת עיבוד הדמיה כדי ליצור תמונה מלאה מתוך ארבעת האריחים הנפרדים במונטאז' עם הפרמטרים המתוארים בכתב היד של הטקסט. הגדר סף עוצמה באמצעות ערוצי DAPI ו- RFP עבור תמונות אלה. פתח תמונה ולחץ על נתח.תחת ניתוח, בחר ניתוח סלולארי, ותחת ערוץ זיהוי, בחר תמונה תפורה בערוצי DAPI או RFP. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה מסיכה ראשית וספירה, וקבע ערך סף וערכי גודל אובייקט שבוחרים כראוי את גרעיני התא בערוץ DAPI, או את אות הסינפטוזום בערוץ RFP. כדי לספור את מספר הגרעינים, עבור אל תפריט הפחתת נתונים, ותחת ניתוח תמונה, בחר ניתוח סלולארי.שוב, עבור אל הכרטיסיה מסיכה ראשית וספירה, ותחת ערוץ, בחר את התמונות התפורות של DAPI והשתמש בפרמטרים המתוארים בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה מדדים מחושבים ובחר ספירת תאים. לאחר מכן כדי לקבל את האזור של אות הסינפטוזום, עבור אל תפריט הפחתת נתונים, ותחת ניתוח, בחר ניתוח סלולרי.שוב, עבור אל הכרטיסייה מסיכה ראשית וספירה, ותחת ערוץ, בחר תמונות תפורות RFP והשתמש בפרמטרים המפורטים בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסייה מדדים מחושבים ובחר שטח סכום אובייקט. בכרטיסייה הפחתת נתונים, לחץ על אישור כדי לאפשר לתוכנה לנתח את כל התמונות שנרכשו.לאחר ניתוח התמונות, יצאו את הערכים 'אזור סכום עצם' ו'ספירת תאים' לכל נקודת זמן. לאחר מכן חלק את האזור 'סכום אובייקט' בספירת התאים כדי לחשב את האזור המנורמל לכל נקודת זמן. אם משווים מספר טיפולים, או גנוטיפים, חשבו את מדד הפאגוציטוזה באמצעות המשוואה הנתונה.iPSCs לא מובחנים מראים מורפולוגיה קומפקטית של מושבות עם קצוות מוגדרים היטב. תאי גזע פלוריפוטנטיים מנותקים יצרו אגרגטים כדוריים המכונים EBs, וגדלים עד ליום הרביעי של ההבחנה. כאשר ה-EBs מצופים ליצירת PMP, הם מתחברים ללוחות המצופים במטריגל, ושכבת תאים מתפשטת ומקיפה את האגרגטים הכדוריים.ביום 28, תאים עגולים עם יחס ציטופלסמה גדול לגרעין מופיעים בהשעיה. מומלץ מאוד לתרבת iPSCs בלוחות מצופים למינין 521 במקום Matrigel, בגלל תפוקת PMP גבוהה יותר בלוחות מצופים למינין 521. לאחר החשיפה של PMPs למדיום IMG, תאים לרכוש מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה עם ציטופלסמה קטנה בנוכחות תהליכים מוארכים.יתר על כן, זהות המיקרוגליה אומתה על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית. בדרך כלל, יותר מ-95% מהתאים מבטאים IB1 וכ-90% מהתאים מבטאים P2RY12 ו-TMEM119. ניתוח כתמים מערבי אישר כי iPSC יצר נוירונים מוטוריים נמוכים יותר עבור סמנים סינפטיים המבוטאים על ידי סינפטוזומים אנושיים, סינפטופיזין וחלבון צפיפות פוסט-סינפטית 95.בבקרה בהשוואה לנקודת הזמן הראשונית, ב-10 שעות, האות הפלואורסצנטי האדום היה חזק, שכן רוב הסינפטוזומים נבלעו, והיו ממוקמים בתאים תוך-תאיים חומציים. ב- IMGs שטופלו ב- Cytochalasin D, הפחתה חזקה של האות האדום למשך אפס ו -10 שעות הצביעה על כך שהאות שזוהה נובע מאירועים פאגוציטיים. שטח הסינפטוזומים הנבלעים גדל עם הזמן עד 16 שעות.עם זאת, אזור האות האדום מתאים שטופלו ב- Cytochalasin D לא גדל עם הזמן. תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPS יכולים לשמש ליישומים שונים, כולל פאגוציטוזה ותגובה דלקתית בחקר מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

יצירת נוירונים אנושיים ואוליגודנדרוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים למידול אינטראקציות נוירון-אוליגודנדרוציטים

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...