Name: human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

著者らは、運動ニューロン分化用のWTC11 hNIL iPS細胞株を提供してくれたMichael Wardと、ミクログリア分化に使用されるKOLF2.1J WTクローンB03 iPS細胞株を提供してくれたジャクソン研究所に感謝している。また、プロトコルの実施中の支援を提供してくれたドロシー・シェイファー氏、生細胞イメージングシステムを支援してくれたアンソニー・ジャンペトルッツィ氏とジョン・ランダース氏、改訂中の技術的貢献をしてくれたヘイデン・ガッド氏、この研究での協力についてジョナサン・ユング氏にも感謝します。この研究は、UMASSチャン医科大学の神経科学のためのダンとダイアンリッチョ基金とエンジェル基金、Inc.によってサポートされました。

注:このプロトコルで使用されるすべての試薬は無菌である必要があり、すべてのステップは無菌条件下でバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。すべてのiPS細胞株、ならびに維持および分化培地は、材料表に記載されています。以下に図示されるミクログリア鑑別方法は、本明細書に記載される新たな改変を伴う以前に公表されたプロトコル7</s...

<ol>
	<li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development.">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).</li><li>Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuroinflammation+and+neurodegeneration:+from+understanding+to+therapy.">Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells.">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia.">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li><li>Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages.">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).</li><li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+and+its+regulation:+a+therapeutic+target+in+Parkinson's+disease.">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+central+nervous+system+development+and+plasticity.">Microglia function in central nervous system development and plasticity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).</li><li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections.">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).</li><li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons.">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).</li><li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening.">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).</li><li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors.">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li><li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization.">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li></ol>

ここで説明する分化プロトコルは、iPS細胞由来のミクログリア様細胞を6~8週間で高純度で、より多くの細胞を必要とする免疫蛍光実験やその他のアッセイを行うのに十分な収率で得る効率的な方法を提供します。このプロトコルでは、1週間で最大1×106 iMGが得られ、タンパク質とRNAの抽出、および対応するダウンストリーム分析(RNASeq、qRT-PCR、ウェスタンブロット、質量分析など)が可...

ミクログリアは中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞であり、CNSの発症に重要な役割を果たしています。ミクログリアは、成人の脳において恒常性を維持し、外傷や疾患のプロセスに積極的に反応するためにも重要です。累積的な証拠は、ミクログリアが複数の神経発達および神経変性疾患の病因の主要な原因であることを示しています1,2。ミクログリア生物学に関する現在の知見は主にマウスモデルから得られてきましたが、最近の研究ではマウスとヒトミクログリアの重要な違いが解明されており、ヒトミクログリアの遺伝学と生物学的機能を研究する技術を開発する必要性が強調されています3,4。解剖された初代組織からのミクログリアの単離は、ミクログリアの特性を著しく変化させる可能性があり5、そのような細胞で得られた結果を交絡させる可能性があります。この方法の全体的な目標は、ヒトiPS細胞をiMGに分化させることであり、それによって基礎条件下でヒトミクログリアを研究するための細胞培養システムを提供することです。さらに、完全ヒトモデル系を用いた食作用アッセイは、品質管理尺度として、および疾患の状況におけるiMG機能障害を評価する手段として、iMGの機能性を研究する手段として本明細書に含まれる。
iPS細胞からのミクログリア分化のための複数のプロトコルが、最近、文献6、7、8、9、10に出現した。いくつかのプロトコルの潜在的な欠点には、長期間または長期間の分化、複数の成長因子の追加、および/または複雑な実験手順が含まれる6、9、10。ここでは、iPS細胞をプリミティブマクロファージ前駆体(PMP)と呼ばれる前駆細胞に分化させることで、ミクログリア個体発生の側面を再現する「ユーザーフレンドリーな」分化方法が実証されています7,11。PMPは、前述のように生成され、いくつかの最適化が本明細書12に提示される。PMPは、MYB非依存性の卵黄嚢由来のマクロファージを模倣しており、血液脳関門閉鎖の前に脳に侵入することにより、胚発生中にミクログリアを引き起こします13。PMPをiMGに最終的に分化させるために、HaenselerらとBrownjohnらのプロトコルに基づく高速で簡略化された単一培養法を使用し、iMGがミクログリア富化マーカーを堅牢に発現する効率的なミクログリア分化法を生成するためにいくつかの変更を加えました7,8。この分化法は、iPS細胞の培養に関する専門知識を持ち、ヒトモデルシステムを用いたミクログリア生物学の研究を目的とした研究目標を持つ研究室で再現することができます。
iPS細胞由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に関連する供給源であり、食作用を含むミクログリアの標準機能を調査するための重要なツールです。ミクログリアは、脳とCNSの専門的な食細胞であり、細胞の破片、凝集したタンパク質、および分解されたミエリンを取り除きます14。ミクログリアはまた、シナプスを飲み込むことによるシナプスリモデリングや、病原体の食作用による外部感染に対する防御にも機能します15,16。このプロトコルでは、iMGによる食作用は、iMG巻き込みの材料としてヒトシナプトソームを使用して評価されます。この目的のために、ヒトi3LMNsに由来するシナプトソームを単離するための記載が記載されている。i3LMN由来のヒトシナプトソームは、pH感受性色素で標識されており、in vitroでのファゴソーム処理および分解中に酸性コンパートメント内に局在するシナプトソームの定量を可能にします。ミクログリア巻き込みの動的プロセスをリアルタイムでモニタリングするために、生細胞顕微鏡を用いた食作用アッセイが示されています。この機能アッセイは、完全なヒトシステムを使用して、健康と病気におけるミクログリア食作用の可能性のある欠陥を調査するための基礎を確立します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies for immunofluorescence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IBA1 rabbit antibody</td>
			<td>Wako Chemical USA</td>
			<td>NC9288364</td>
			<td>1:350 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P2RY12 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA014518</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TMEM119 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA051870</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Western blot analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A6344</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 mouse antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1596</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (100 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (75 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate (25 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainers</td>
			<td>&#160;Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter, Double End, Flat Blade &#38; Narrow Blade, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adherence round-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353847,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>&#160;Corning</td>
			<td>25058CI</td>
			<td>dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td>dissociation reagents used for microglia differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating reagents for cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#8482;</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred as to extracellular matrix coating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAdhere Laminin-521</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>77004</td>
			<td>Referred as to laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P3655</td>
			<td>Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mTeSR Plus Kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>100-0276</td>
			<td>To prepare iPSC media mixed the components to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of EB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>final concentration 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20A</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12001-988</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td>PeproTech or Biologend</td>
			<td>200-34 or 577904</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Complete induction media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>565790</td>
			<td>final concentration 0.2 &#956;M and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>final concentration 2 &#956;g/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Neuron media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3653401</td>
			<td>final concentration 1x for media and suplemment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC lines used in this study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLF2.1J: WT clone B03</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WTC11 hNIL</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptosome isolation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87793</td>
			<td>Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagocytosis assay dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Ready reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, succinimidyl ester</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36600</td>
			<td>Referred as to pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other cell-culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% Solution</td>
			<td>AMRESCO INC</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9285</td>
			<td>Reconstitute to 40 mM in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Referred as to DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td>Referred as to laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 live cell imaging reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>version 3.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Therm Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td></td>
			<td>refer as tube shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Mode Transsonic 310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes

ミクログリアは、脳微小環境の恒常性を維持する骨髄系起源の常在免疫細胞であり、複数の神経疾患の主要なプレーヤーとなっています。健康と病気におけるヒトミクログリアの研究は、ヒト細胞の供給が非常に限られているため、課題を表しています。ヒト個体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)は、この障壁を回避するために使用することができる。ここでは、ヒトiPS細胞をミクログリア様細胞(iMG)に分化させて in vitro 実験を行う方法を実証します。これらのiMGは、ミクログリア様形態、適切なマーカーの発現、活発な食作用など、ミクログリアの期待される生理学的特性を示します。さらに、ヒトiPS細胞由来の下位運動ニューロン(i3LMN)に由来するシナプトソーム基質を単離および標識するための文書が提供されています。生細胞の縦断的イメージングアッセイを使用して、pH感受性色素で標識されたヒトシナプトソームの飲み込みを監視し、iMGの貪食能力を調べることができます。本明細書に記載のプロトコルは、ヒトミクログリア生物学および疾患へのミクログリアの寄与を調査している異なる分野に広く適用可能である。

このプロトコルを使用してiMGを生成するには、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示す未分化iPS細胞から始めることが重要です(図2A)。EB形成のセクションで説明したように維持された解離したiPS細胞は、EBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化の4日目までサイズが大きくなります(図2B)。EBが収集され、PMP生成に適した条件でメッキ?...

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Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の in vitro 実験のためのミクログリア様細胞への分化プロセスについて説明しています。また、生細胞イメージングシステムを使用した in vitro 食作用アッセイの基質として使用できるiPS細胞由来の低運動ニューロンからヒトシナプトソームを生成するための詳細な手順も含まれています。

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

iPS由来のミクログリアは、in vitro実験のためのヒトミクログリアの生物学的に重要な供給源であり、健康と疾患におけるミクログリア生物学を研究するための重要なツールです。成長因子の使用を最小限に抑え、高い純度と収量を達成する簡単なミクログリア分化プロトコルを紹介します。また、完全にヒト化された食作用アッセイを実証します。iPS細胞由来のミクログリア様細胞は、培地の蒸発に非常に敏感です。細胞培養プレートの隅にあるウェルの使用は避け、生存率を向上させるためにすべての空のウェルを水で満たす必要があります。人工多能性幹細胞(iPSC)が80%コンフルエントになったら、1ミリリットルのDPBSで洗浄し、1ミリリットルの解離試薬を摂氏37度で2分間添加してコロニーを解離させます。細胞リフターを使用してコロニーを複数回こすり落とし、単一の細胞懸濁液を作成します。懸濁液を収集し、9ミリリットルのDPBSを含む15ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞を500倍gで1分間遠心分離し、上清を除去し、1ミリリットルの胚様体(EB)培地に再懸濁します。10マイクロリットルの細胞を取り、トリパンブルーで1〜2個に希釈します。血球計算盤で細胞を数え、細胞数に基づいて、細胞ストックを100マイクロリットルあたり10, 000細胞の最終希釈まで希釈します。プレーティングセルの場合は、ウェルあたり100マイクロリットルの希釈セルを低接着性の丸底96ウェルプレートに追加します。プレートを125倍gで3分間遠心分離し、摂氏37度と5%二酸化炭素で4日間インキュベートします。2日目に、マルチチャンネルピペットを使用して、古いハーフEB培地を新しい培地と交換します。プリミティブマクロファージ前駆体(PMP)を生成するには、1ミリリットルの氷冷マトリゲルコーティング溶液を加えて、6ウェルプレートのウェルをコーティングします。次に、プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で2時間、または一晩インキュベートします。EB分化の4日目に、1ミリリットルのピペットチップを使用して、EBをマトリゲルコーティングされたウェルに移します。ピペットを上下に動かして、EBを井戸から取り除きます。次に、プレートを傾けたままにして、EBがウェルの端に落ち着くようにします。すべてのEBが落ち着いたら、3ミリリットルの新しく調製したPMP完全培地でEBをウェルの端に保ちながら、静かにピペットで古い培地を交換します。プレートを手動で左右に、そして前後にシャッフルして、ウェル内の細胞を均等に分配します。次に、プレートを7日間インキュベートして、EBがウェルの底に付着できるようにします。7日後、EBをライトフィールド顕微鏡で4倍の倍率で検査し、ウェルの底に付着していることを確認します。ハーフ培地交換を行い、21日目に完全培地を3ミリリットルのPMP完全培地と交換する。28日目に、上清中のPMPと呼ばれる丸い細胞を探します。次に、EBを乱すことなく、10ミリリットルのピペットと自動ピペッターを使用してPMPを含む培地を収集します。培地中のPMPを15ミリリットルの円錐管に移します。採取したPMPを200倍gで4分間遠心分離し、上清を吸引してから、1〜2ミリリットルのミクログリア様細胞またはIMG基礎培地に再懸濁します。次に、前述のように血球計算盤で細胞を数えます。残りの細胞を遠心分離し、PMPを所望の濃度に希釈します。次いで、新たに調製したIMG完全培地を用いて細胞培養処理プレート上に1平方センチメートル当たり10〜5細胞の濃度で細胞を播種する。生細胞食作用アッセイでは、10〜4番目のPMPを20〜30倍の96ウェルプレートと100マイクロリットルのIMG完全培地にプレートし、分化プロセスを10日間追跡します。アッセイ当日、1ウェルあたり40マイクロリットルの培地を除去し、10マイクロリットルの核染色溶液を加える。プレートを2時間インキュベートします。標識されたシナプトソームを氷上で解凍し、1分間水超音波処理器を使用して穏やかに超音波処理します。繰り返しますが、すぐにシナプトソームを氷の上に置きます。標識シナプトソームをIMG完全培地で希釈し、培地50マイクロリットルあたりシナプトソーム1マイクロリットルで希釈する。陰性対照のために、アクチン重合、ひいては食作用を阻害するためにIMG完全培地中に60マイクロモルのサイトカラシンDを調製する。次に、この溶液を10マイクロモルの最終濃度で各ウェルに10マイクロリットル加え、30分間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出し、摂氏10度で10分間インキュベートします。プレートを氷上に保ち、シナプトソームを含む培地を50マイクロリットル加えます。プレートを摂氏10度で270倍gで3分間遠心分離し、画像取得までプレートを氷上に維持します。プレートをライブセルイメージングリーダーに挿入し、分析するウェルを選択します。次に、20倍の対物レンズを選択します。次に、明視野チャンネルと青色チャンネルのフォーカス、発光ダイオード(LED)、強度、積分時間、ゲインを調整します。シナプトソーム蛍光は、最初の時点では無視できるはずです。ウェルごとにモンタージュで取得する個々のタイルの数を選択します。井戸の中央にある16枚のタイルを取得し、井戸の総面積の約5%を画像化します。温度を摂氏37度に設定し、イメージングに必要な時間間隔を設定します。次に、分析ソフトウェアを開きます。次に、画像を含む実験を開き、[データ削減] アイコンをクリックします。メニューで、「画像処理」の下の「イメージングスティッチング」を選択し、モンタージュ内の 4 x 4 の個々のタイルから、テキスト原稿に記述されているパラメーターを使用して完全な画像を作成します。これらの画像の DAPI チャネルと RFP チャネルを使用して、強度のしきい値を定義します。画像を開き、[分析] をクリックします。[分析] で [セルラー分析] を選択し、[検出チャネル] で DAPI チャネルまたは RFP チャネルのいずれかでステッチされた画像を選択します。次に、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、DAPIチャネルの細胞核、またはRFPチャネルのシナプトソーム信号を適切に選択するしきい値とオブジェクトサイズの値を確立します。核の数をカウントするには、[データ削減]メニューに移動し、[画像分析]で[細胞分析]を選択します。もう一度、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でDAPIステッチ画像を選択し、テキスト原稿に記載されているパラメーターを使用します。次に、[計算指標] タブに移動し、[セル数] を選択します。次に、シナプトソームシグナルの領域を取得するには、[データ削減]メニューに移動し、[分析]で[細胞分析]を選択します。もう一度、[プライマリマスクとカウント]タブに移動し、[チャネル]でRFPステッチ画像を選択し、テキスト原稿に詳述されているパラメーターを使用します。次に、[計算指標] タブに移動し、[オブジェクトの合計領域] を選択します。[データ削減]タブで、[OK]をクリックして、ソフトウェアが取得したすべての画像を分析できるようにします。画像が分析されたら、各時点の[オブジェクトの合計面積]と[セル数]の値をエクスポートします。次に、オブジェクトの合計面積をセル数で除算して、時間ポイントごとの正規化面積を計算します。複数の治療法または遺伝子型を比較する場合は、指定された式を使用して食作用指数を計算します。未分化iPS細胞は、明確なエッジを持つコンパクトなコロニー形態を示します。解離したiPS細胞はEBと呼ばれる球状の凝集体を形成し、分化4日目までサイズが大きくなりました。EBがPMP生成のためにメッキされると、それらはマトリゲルコーティングされたプレートに付着し、細胞の層が広がり、球状の凝集体を囲みます。28日目に、大きな細胞質対核比を有する丸い細胞が懸濁液中に現れる。iPS細胞は、ラミニン521コーティングプレートの方がPMP収率が高いため、マトリゲルではなくラミニン521コーティングプレートで培養することを強くお勧めします。PMPをIMG培地に曝露した後、細胞は細長い突起の存在下で小さな細胞質を有するミクログリア様形態を獲得する。また、ミクログリアの同一性は免疫蛍光染色により検証した。典型的には、細胞の95%以上がIB1を発現し、約90%の細胞がP2RY12およびTMEM119を発現する。ウェスタンブロット解析により、iPSCはヒトシナプトソーム発現シナプスマーカー、シナプトフィジンおよびシナプス後密度タンパク質95の下位運動ニューロンに由来することを確認しました。対照では、最初の時点と比較して、10時間までに、ほとんどのシナプトソームが飲み込まれ、酸性の細胞内コンパートメントに局在していたため、赤色蛍光シグナルは堅牢でした。サイトカラシンD処理IMGでは、赤色シグナルが0時間および10時間にわたって大幅に減少した場合、検出されたシグナルは貪食イベントに起因することが示されました。取り込まれたシナプトソームの面積は、16時間までの時間とともに増加しました。しかし、サイトカラシンD処理細胞からの赤色シグナルの面積は時間とともに増加しなかった。iPS由来のミクログリア様細胞は、貪食作用や炎症反応など、神経発達疾患や神経変性疾患の研究など、さまざまな用途に利用できます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

貪食能アッセイのアストロ サイトを介した新規体外ライブ イメージングを使用して pH インジケーター共役シナプトソーム

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...