Name: human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Forfatterne takker Michael Ward for å gi WTC11 hNIL iPSC-linjen for motorneurondifferensiering og Jackson Laboratories for å levere KOLF2.1J WT-klonen B03 iPSC-linjen som brukes til mikrogliadifferensiering. Vi takker også Dorothy Schafer for hennes støtte under implementeringen av protokollene, Anthony Giampetruzzi og John Landers for deres hjelp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd for hans tekniske bidrag under revisjoner og Jonathan Jung for hans samarbeid i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av Dan og Diane Riccio Fund for Neuroscience fra UMASS Chan Medical School og Angel Fund, Inc.

MERK: Alle reagensene som brukes i denne protokollen må være sterile, og alle trinnene må utføres i et biosikkerhetsskap under sterile forhold. Alle iPSC-linjene, samt vedlikeholds- og differensieringsmedier, er beskrevet i materialtabellen. Microglia-differensieringsmetoden illustrert nedenfor er basert på tidligere publiserte protokoller 7,8,12 med nye modifikasjoner beskrevet her.
<p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development.">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).</li><li>Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuroinflammation+and+neurodegeneration:+from+understanding+to+therapy.">Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells.">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia.">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li><li>Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages.">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).</li><li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+and+its+regulation:+a+therapeutic+target+in+Parkinson's+disease.">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+central+nervous+system+development+and+plasticity.">Microglia function in central nervous system development and plasticity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).</li><li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections.">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).</li><li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons.">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).</li><li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening.">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).</li><li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors.">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li><li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization.">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li></ol>

Differensieringsprotokollen beskrevet her gir en effektiv metode for å oppnå iPSC-avledede mikroglia-lignende celler i ~ 6-8 uker med høy renhet og i tilstrekkelig utbytte for å utføre immunfluorescenseksperimenter og andre analyser som krever et høyere antall celler. Denne protokollen har gitt opptil 1 × 106 iMGs på 1 uke, noe som muliggjør protein- og RNA-ekstraksjon og tilsvarende nedstrømsanalyser (f.eks. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massespektrometri). Når det er sagt, er en begrensning av de...

Microglia er de bosatte immuncellene i sentralnervesystemet (CNS) og spiller en avgjørende rolle i utviklingen av CNS. Microglia er også viktig i den voksne hjernen for å opprettholde homeostase og aktivt reagere på traumer og sykdomsprosesser. Kumulative bevis viser at mikroglia er viktige bidragsytere til patogenesen av flere nevrodevelopmental og neurodegenerative sykdommer 1,2. Selv om dagens kunnskap om mikrogliabiologi hovedsakelig er avledet fra musemodeller, har nyere studier belyst viktige forskjeller mellom murine og human microglia, og understreker behovet for å utvikle teknologier for å studere genetikk og biologiske funksjoner hos humane microglia 3,4. Isolering av mikroglia fra dissekert primærvev kan alvorlig modifisere mikrogliaegenskaper5, potensielt forvirrende resultater oppnådd med slike celler. Det overordnede målet med denne metoden er å differensiere humane iPSCer i iMGs, og dermed gi et cellekultursystem for å studere human mikroglia under basale forhold. Videre er en fagocytoseanalyse ved hjelp av et fullt menneskelig modellsystem inkludert her som et middel til å studere funksjonaliteten til iMGs, både som et kvalitetskontrollmål og for å vurdere iMG-dysfunksjon i sammenheng med sykdom.
Flere protokoller for mikrogliadifferensiering fra iPSCs har nylig dukket opp i litteraturen 6,7,8,9,10. Potensielle ulemper ved noen protokoller inkluderer lengre eller lange perioder med differensiering, tillegg av flere vekstfaktorer og / eller komplekse eksperimentelle prosedyrer 6,9,10. Her demonstreres en "brukervennlig" differensieringsmetode som rekapitulerer aspekter av mikroglia-ontogeni gjennom differensiering av iPSC-er til forløperceller kalt primitive makrofagforløpere (PMP)7,11. PMP-er genereres som beskrevet tidligere, med noen optimaliseringer presentert her i12. PMP-ene etterligner MYB-uavhengige eggeplomme-sac-avledede makrofager, som gir opphav til mikroglia under embryonal utvikling ved å invadere hjernen før blod-hjernebarrierelukking13. For å terminalt differensiere PMP-er i iMG-er brukte vi en rask og forenklet monokulturmetode basert på protokoller av Haenseler og medarbeidere og Brownjohn et al., med noen modifikasjoner for å generere en effektiv mikrogliadifferensieringsmetode der iMG-er robust uttrykker mikrogliaberikede markører 7,8. Denne differensieringsmetoden kan reproduseres i laboratorier med kompetanse i kulturen til iPSCs og med forskningsmål som tar sikte på å studere mikrogliabiologi ved hjelp av et menneskelig modellsystem.
iPSC-avledet mikroglia representerer en biologisk relevant kilde til humane mikroglia for in vitro eksperimentering og er et viktig verktøy for å undersøke mikroglial kanoniske funksjoner, inkludert fagocytose. Microglia er de profesjonelle fagocytter i hjernen og CNS, hvor de rydder celleavfall, aggregerte proteiner og nedbrutt myelin14. Microglia fungerer også i synaptisk ombygging ved å oppsluke synapser og i forsvaret mot eksterne infeksjoner gjennom fagocytose av patogener15,16. I denne protokollen vurderes fagocytose ved iMGs ved bruk av humane synaptosomer som materiale for iMG-oppslukning. Til dette formål beskrives en beskrivelse for å isolere synaptosomer avledet fra humane i3LMNer. De i3LMN-avledede humane synaptosomene er merket med et pH-følsomt fargestoff som muliggjør kvantifisering av synaptosomer lokalisert i sure rom under fagosombehandling og nedbrytning in vitro. En fagocytoseanalyse ved bruk av levende cellemikroskopi er vist for å overvåke den dynamiske prosessen med mikroglia-oppslukning i sanntid. Denne funksjonelle analysen etablerer et grunnlag for å undersøke mulige defekter i mikroglial fagocytose i helse og sykdom ved hjelp av et komplett humant system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies for immunofluorescence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IBA1 rabbit antibody</td>
			<td>Wako Chemical USA</td>
			<td>NC9288364</td>
			<td>1:350 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P2RY12 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA014518</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TMEM119 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA051870</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Western blot analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A6344</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 mouse antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1596</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (100 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (75 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate (25 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainers</td>
			<td>&#160;Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter, Double End, Flat Blade &#38; Narrow Blade, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adherence round-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353847,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>&#160;Corning</td>
			<td>25058CI</td>
			<td>dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td>dissociation reagents used for microglia differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating reagents for cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#8482;</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred as to extracellular matrix coating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAdhere Laminin-521</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>77004</td>
			<td>Referred as to laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P3655</td>
			<td>Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mTeSR Plus Kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>100-0276</td>
			<td>To prepare iPSC media mixed the components to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of EB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>final concentration 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20A</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12001-988</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td>PeproTech or Biologend</td>
			<td>200-34 or 577904</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Complete induction media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>565790</td>
			<td>final concentration 0.2 &#956;M and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>final concentration 2 &#956;g/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Neuron media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3653401</td>
			<td>final concentration 1x for media and suplemment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC lines used in this study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLF2.1J: WT clone B03</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WTC11 hNIL</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptosome isolation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87793</td>
			<td>Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagocytosis assay dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Ready reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, succinimidyl ester</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36600</td>
			<td>Referred as to pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other cell-culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% Solution</td>
			<td>AMRESCO INC</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9285</td>
			<td>Reconstitute to 40 mM in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Referred as to DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td>Referred as to laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 live cell imaging reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>version 3.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Therm Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td></td>
			<td>refer as tube shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Mode Transsonic 310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes

Microglia er de bosatte immuncellene av myelogen opprinnelse som opprettholder homeostase i hjernens mikromiljø og har blitt en nøkkelspiller i flere nevrologiske sykdommer. Å studere humane mikroglia i helse og sykdom representerer en utfordring på grunn av den ekstremt begrensede tilførselen av humane celler. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) avledet fra menneskelige individer kan brukes til å omgå denne barrieren. Her er det demonstrert hvordan man skiller humane iPSCer til mikroglia-lignende celler (iMGs) for in vitro eksperimentering. Disse iMGene viser de forventede og fysiologiske egenskapene til microglia, inkludert mikroglia-lignende morfologi, uttrykk for riktige markører og aktiv fagocytose. I tillegg er dokumentasjon for isolering og merking av synaptosomsubstrater avledet fra humane iPSC-avledede lavere motorneuroner (i3LMN) gitt. En live-celle, langsgående bildeanalyse brukes til å overvåke oppslukning av humane synaptosomer merket med et pH-følsomt fargestoff, noe som muliggjør undersøkelser av iMGs fagocytiske kapasitet. Protokollene beskrevet her er bredt anvendelige for ulike felt som undersøker human microglia biologi og bidraget av microglia til sykdom.

For å generere iMG-er ved hjelp av denne protokollen, er det viktig å starte med udifferensierte iPSC-er som viser kompaktkolonimorfologi med veldefinerte kanter (figur 2A). Dissosierte iPSCer opprettholdt som beskrevet i EB-formasjonsdelen vil danne sfæriske aggregater, kalt EBs, som vil vokse i størrelse til dag 4 av differensiering (figur 2B). Når EB-ene er samlet og belagt under passende forhold for PMP-generering, festes de til de matrikelbelagte plate...

Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Denne protokollen beskriver differensieringsprosessen av humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs) til mikroglia-lignende celler for in vitro eksperimentering. Vi inkluderer også en detaljert prosedyre for å generere humane synaptosomer fra iPSC-avledede lavere motorneuroner som kan brukes som substrat for in vitro fagocytoseanalyser ved bruk av levende celleavbildningssystemer.

Human Microglia-lignende celler: Differensiering fra induserte pluripotente stamceller og in vitro levende cellefagocytoseanalyse ved bruk av humane synaptosomer

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

iPS-avledet mikroglia representerer en biologisk relevant kilde til humane mikroglia for in vitro eksperimentering, og er et viktig verktøy for å undersøke mikrogliabiologi i helse og sykdom. Vi presenterer en enkel microglia-differensieringsprotokoll som krever minimal bruk av vekstfaktorer og oppnår høy renhet og utbytte. Vi demonstrerer også en fullt humanisert fagocytoseanalyse.iPSC-avledede mikroglia-lignende celler er svært følsomme for mediefordampning. Du bør unngå å bruke brønnene i hjørnet av cellekulturplaten, og fylle alle tomme brønner med vann for å forbedre overlevelsen. Når induserte pluripotente stamceller, eller iPSCs, har nådd 80% sammenløp, dissocierer koloniene ved å vaske med en milliliter DPBS, og tilsett en milliliter dissosiasjonsreagens i to minutter ved 37 grader Celsius.Fjern koloniene ved hjelp av en celleløfter ved å skrape flere ganger for å lage en enkeltcellesuspensjon. Samle suspensjonen, og overfør dem til et 15 milliliter konisk rør som inneholder ni milliliter DPBS. Sentrifuger deretter cellene ved 500 ganger g i ett minutt, fjerner supernatanten og resuspenderer i en milliliter av embryoidlegemet, eller EB, medium.Ta 10 mikroliter celler, og fortynn en til to med trypanblå. Tell cellene på et hemocytometer, og basert på celletallet, fortynn cellestammen til en endelig fortynning av 10.000 celler per 100 mikroliter. For plating celler, tilsett 100 mikroliter av de fortynnede cellene per brønn i en lav etterlevelse rundbunn 96-brønns plate.Sentrifuge platen ved 125 ganger g i tre minutter, og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i fire dager. På dag to, ved hjelp av en flerkanals pipette, erstatt det gamle halv-EB-mediet med et nytt medium. For å generere primitive makrofagforløpere, eller PMP-er, belegg brønnene til en seks-brønns plate ved å legge til en milliliter iskald Matrigel beleggløsning.Inkuber deretter platen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i to timer, eller over natten. På dag fire av EB-differensieringen, ved hjelp av en milliliter pipettespiss, overfør EB-ene til de matrigelbelagte brønnene. Pipette opp og ned for å løsne EBene fra brønnen.Hold deretter platen vippet slik at EB-ene kan slå seg ned ved kanten av brønnen. Når alle EBene har lagt seg, pipetter forsiktig og erstatter det gamle mediet, mens du holder EB på kanten av brønnen med tre milliliter nylaget PMP komplett medium. Fordel cellene jevnt i brønnene ved å stokke platen manuelt fra side til side og bakover til front.Inkuber deretter platen i syv dager for å la EB-ene feste seg til bunnen av brønnen. Etter syv dager, inspiser EB-ene under et lysfeltmikroskop ved fire ganger forstørrelse for å sikre at de er festet til bunnen av brønnene. Utfør en halv middels endring, og på dag 21, erstatt hele mediet med tre milliliter PMP komplett medium.På dag 28, se etter runde celler referert til som PMP i supernatanten. Samle deretter mediet som inneholder PMP-ene ved hjelp av en 10 milliliter pipette og automatisk pipetter uten å forstyrre EB-ene. Overfør PMP-ene i mediet til et 15 milliliter konisk rør.Sentrifuger de oppsamlede PMP-ene ved 200 ganger g i fire minutter og aspirerer supernatanten før de suspenderes på nytt i en til to milliliter mikroglialignende celler, eller IMG basalmedium. Tell deretter cellene på hemocytometeret som beskrevet tidligere. Sentrifuger resten av cellene, og fortynn PMP-ene til ønsket konsentrasjon.Deretter plate cellene i en tetthet på 10 til de femte cellene per kvadratcentimeter på cellekulturbehandlede plater ved bruk av ferskt tilberedt IMG komplett medium. For levende cellefagocytoseanalyse, plate 20 til 30 ganger 10 til fjerde PMP i en 96-brønnsplate og 100 mikroliter IMG komplett medium og følg differensieringsprosessen i 10 dager. På analysedagen, fjern 40 mikroliter medium per brønn, og tilsett 10 mikroliter av atomfargingsløsningen.Inkuber platen i to timer. Tine de merkede synaptosomene på is, og sonikere forsiktig ved hjelp av en vannsoniker i ett minutt. Igjen, legg umiddelbart synaptosomene på is.Fortynn de merkede synaptosomene i IMG komplett medium ved en mikroliter synaptosomer per 50 mikroliter medium. For negativ kontroll, lag 60 mikromolar cytochalasin D i IMG komplett medium for å hemme aktinpolymerisasjon, og dermed fagocytose. Tilsett deretter 10 mikroliter av denne løsningen til hver brønn for en endelig konsentrasjon på 10 mikromolar, og inkuber i 30 minutter.Fjern platen fra inkubatoren, og inkuber ved 10 grader Celsius i 10 minutter. Oppretthold platen på is, og tilsett 50 mikroliter medium som inneholder synaptosomer. Sentrifuger platen ved 270 ganger g i tre minutter ved 10 grader Celsius, og hold platen på is til bildeopptak.Sett platen inn i en levende celleavbildningsleser, og velg brønnene som skal analyseres. Velg deretter en 20X objektivlinse. Deretter justerer du fokus, lysemitterende diode eller LED, intensitet, integrasjonstid og forsterkning av lysfelt og blå kanaler.Synaptosomfluorescensen skal være ubetydelig ved det opprinnelige tidspunktet. Velg antall individuelle fliser som skal anskaffes i en montasje per brønn. Anskaffe 16 fliser i midten av brønnen, og avbilde ca. 5 % av det totale brønnarealet.Still temperaturen til 37 grader Celsius, og ønsket tidsintervall for avbildning. Deretter åpner du analyseprogramvaren. Åpne deretter eksperimentet som inneholder bildene, og klikk på Datareduksjon-ikonet.I menyen velger du Imaging Stitching under Imaging Processing for å lage et komplett bilde fra de fire av fire individuelle flisene i montasjen med parametrene beskrevet i tekstmanuskriptet. Definer en intensitetsterskel ved hjelp av DAPI- og RFP-kanalene for disse bildene. Åpne et bilde, og klikk på Analyser.Under Analyse velger du Mobilanalyse, og under Gjenkjenningskanal velger du et sydd bilde i DAPI- eller RFP-kanalene. Gå deretter til kategorien Primærmaske og antall, og opprett en terskelverdi og objektstørrelsesverdier som riktig velger cellekjernene i DAPI-kanalen, eller synaptosomsignalet i RFP-kanalen. Hvis du vil telle antall kjerner, går du til Datareduksjon-menyen og velger Mobilanalyse under Bildeanalyse.Igjen, gå til kategorien Primærmaske og antall, og velg DAPI-sydde bilder under Kanal, og bruk parametrene som er beskrevet i tekstmanuskriptet. Gå deretter til fanen Beregnede beregninger, og velg Celleantall. For å få området til synaptosomsignalet, gå til Datareduksjon-menyen, og velg Mobilanalyse under Analyse.Igjen, gå til kategorien Primærmaske og antall, og velg RFP-sydde bilder under Kanal, og bruk parametrene som er beskrevet i tekstmanuskriptet. Gå deretter til fanen Beregnede beregninger, og velg Objektsumområde. I kategorien Datareduksjon klikker du på OK for å la programvaren analysere alle de anskaffede bildene.Når bildene er analysert, eksporterer du objektsumområdet og celletellingsverdiene for hvert tidspunkt. Del deretter objektsumområdet med celletallet for å beregne det normaliserte området per tidspunkt. Hvis du sammenligner flere behandlinger, eller genotyper, beregner du fagocytoseindeksen ved hjelp av den gitte ligningen.Udifferensierte iPSC-er viser kompakt kolonimorfologi med veldefinerte kanter. Dissosierte iPSCer dannet sfæriske aggregater kalt EBs, og vokser i størrelse til dag fire av differensiering. Når EB-ene er belagt for PMP-generering, festes de til de matrikelbelagte platene, og et lag med celler sprer seg og omgir de sfæriske aggregatene.På dag 28 vises runde celler med et stort cytoplasma til kjerneforhold i suspensjonen. Det anbefales sterkt å dyrke iPSCs i Laminin 521-belagte plater i stedet for Matrigel, på grunn av det høyere PMP-utbyttet i Laminin 521-belagte plater. Etter eksponering av PMP til IMG-medium, får celler en mikroglia-lignende morfologi med en liten cytoplasma i nærvær av langstrakte prosesser.Videre ble mikroglia-identitet verifisert ved immunfluorescerende farging. Vanligvis uttrykker mer enn 95% av cellene IB1 og omtrent 90% av cellene uttrykker P2RY12 og TMEM119. Western blot-analyse bekreftet at iPSC avledet lavere motorneuroner for humane synaptosomer'uttrykte synaptiske markører, synaptofysin og postsynaptisk tetthetsprotein 95.I kontroll sammenlignet med det opprinnelige tidspunktet, med 10 timer, var det røde fluorescerende signalet robust, da de fleste synaptosomene hadde blitt oppslukt, og var lokalisert til sure intracellulære rom. I Cytochalasin D-behandlede IMG-er indikerte en sterk reduksjon av det røde signalet i null og 10 timer at det oppdagede signalet skyldes fagocytiske hendelser. Arealet av oppslukte synaptosomer økte med tiden til 16 timer.Området med rødt signal fra Cytochalasin D-behandlede celler økte imidlertid ikke med tiden. iPS-avledede Microglia-lignende celler kan brukes til forskjellige applikasjoner, inkludert fagocytose og inflammatorisk respons i studiet av nevrodevelopmental og neurodegenerative sykdommer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human nevrale stamceller og nevroner fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Spesifikasjonen av Telencephalic glutamatergic Neurons fra menneskelige pluripotente stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-free Utledning av Neural Crest stamceller fra menneskelige pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regissert dopaminerge Neuron Differensiering fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman I Vitro Live bildebehandling analysen av astrocytter-mediert fagocytose bruker pH indikator-konjugerte Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Konvertering av Human indusert pluripotent Stem Cells (iPSCs) i funksjonell spinal og skallen motor neurons bruke PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal Differensiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Avledning, utvidelse, kryopreservasjon og karakterisering av mikrovaskulære endotelceller fra humane induserte pluripotente stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generering av humane nevroner og oligodendrocytter fra pluripotente stamceller for modellering av neuron-oligodendrococyttinteraksjoner

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...