Name: human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes
Uploaded: 2022-08-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Los autores agradecen a Michael Ward por proporcionar la línea WTC11 hNIL iPSC para la diferenciación de neuronas motoras y a Jackson Laboratories por suministrar la línea KOLF2.1J WT clon B03 iPSC utilizada para la diferenciación de microglía. También agradecemos a Dorothy Schafer por su apoyo durante la implementación de los protocolos, a Anthony Giampetruzzi y John Landers por su ayuda con el sistema de imágenes de células vivas, así como a Hayden Gadd por sus contribuciones técnicas durante las revisiones y a Jonathan Jung por su colaboración en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Dan y Diane Riccio para la Neurociencia de la Escuela de Medicina UMASS Chan y el Angel Fund, Inc.

NOTA: Todos los reactivos utilizados en este protocolo deben ser estériles, y todos los pasos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles. Todas las líneas iPSC, así como los medios de mantenimiento y diferenciación, se describen en la Tabla de materiales. El método de diferenciación de microglía ilustrado a continuación se basa en protocolos previamente publicados 7,8,12 con nuevas modificaciones descritas e...

<ol>
	<li>Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+glia+as+a+tool+for+neuropsychiatric+research+and+drug+development.">Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).</li><li>Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neuroinflammation+and+neurodegeneration:+from+understanding+to+therapy.">Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).</li><li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes.">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li><li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity.">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies.">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li><li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases.">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li><li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia.">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li><li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response.">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li><li>McQuade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells.">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li><li>Haenseler, W., Rajendran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+modeling+neurodegenerative+diseases+with+human+pluripotent+stem+cell-derived+microglia.">Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia.</a> Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).</li><li>Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient,+long+term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions.">Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PloS One. 8 (8), 71098 (2013).</li><li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+tissue-resident+macrophages.">Ontogeny of tissue-resident macrophages.</a> Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).</li><li>Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+and+its+regulation:+a+therapeutic+target+in+Parkinson's+disease.">Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).</li><li>Schafer, D. P., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+central+nervous+system+development+and+plasticity.">Microglia function in central nervous system development and plasticity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).</li><li>Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+increase+the+activity+of+microglia+as+efficient+protectors+of+the+brain+against+infections.">Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).</li><li>Fernandopulle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+differentiation+of+human+iPSCs+into+neurons.">Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons.</a> Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).</li><li>Gutbier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+human+IPSC-derived+macrophages+for+drug+screening.">Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).</li><li>Sellgren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors.">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li><li>Schmidt, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+PFN1+variants+exhibit+loss+and+gain+of+functions+in+the+context+of+formin-induced+actin+polymerization.">ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).</li><li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester.">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li></ol>

El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método eficiente para obtener células similares a la microglía derivadas de iPSC en ~ 6-8 semanas con alta pureza y en un rendimiento suficiente para realizar experimentos de inmunofluorescencia y otros ensayos que requieren un mayor número de células. Este protocolo ha producido hasta 1 × 106 iMGs en 1 semana, lo que permite la extracción de proteínas y ARN y los correspondientes análisis posteriores (por ejemplo, RNASeq, qRT-PCR, western ...

La microglía son las células inmunes residentes en el sistema nervioso central (SNC) y desempeñan un papel crucial en el desarrollo del SNC. La microglía también es importante en el cerebro adulto para mantener la homeostasis y responder activamente a los procesos de trauma y enfermedad. La evidencia acumulada muestra que la microglía es un contribuyente clave para la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico 1,2. Aunque el conocimiento actual sobre la biología microglial se ha derivado predominantemente de modelos de ratón, estudios recientes han dilucidado diferencias importantes entre la microglía murina y humana, subrayando la necesidad de desarrollar tecnologías para estudiar la genética y las funciones biológicas de la microglía humana 3,4. El aislamiento de la microglía del tejido primario disecado puede modificar gravemente las propiedades de la microglía5, lo que podría confundir los resultados adquiridos con tales células. El objetivo general de este método es diferenciar las iPSC humanas en iMG, proporcionando así un sistema de cultivo celular para estudiar la microglía humana en condiciones basales. Además, aquí se incluye un ensayo de fagocitosis utilizando un sistema modelo totalmente humano como un medio para estudiar la funcionalidad de los iMG, tanto como medida de control de calidad como para evaluar la disfunción de la MGI en el contexto de la enfermedad.
Múltiples protocolos para la diferenciación de microglia de iPSCs han surgido recientemente en la literatura 6,7,8,9,10. Las desventajas potenciales de algunos protocolos incluyen períodos prolongados o largos de diferenciación, la adición de múltiples factores de crecimiento y/o procedimientos experimentales complejos 6,9,10. Aquí, se demuestra un método de diferenciación "fácil de usar" que recapitula aspectos de la ontogenia de la microglía a través de la diferenciación de iPSCs en células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)7,11. Los PMP se generan como se describió anteriormente, con algunas optimizaciones presentadas aquí en12. Los PMP imitan a los macrófagos derivados del saco vitelino independientes de MYB, que dan lugar a la microglía durante el desarrollo embrionario al invadir el cerebro antes del cierre de la barrera hematoencefálica13. Para diferenciar terminalmente las PMP en MGI, utilizamos un método de monocultivo rápido y simplificado basado en los protocolos de Haenseler et al. y Brownjohn et al., con algunas modificaciones para generar un método eficiente de diferenciación de microglia en el que los iMG expresan robustamente marcadores enriquecidos con microglía 7,8. Este método de diferenciación se puede reproducir en laboratorios con experiencia en el cultivo de iPSCs y con objetivos de investigación destinados a estudiar la biología de la microglía utilizando un sistema modelo humano.
La microglía derivada de iPSC representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro y es una herramienta importante para investigar las funciones canónicas microgliales, incluida la fagocitosis. La microglía son los fagocitos profesionales del cerebro y el SNC, donde limpian los desechos celulares, agregan proteínas y degradan la mielina14. La microglía también funciona en la remodelación sináptica por envolver sinapsis y en la defensa contra infecciones externas a través de fagocitosis de patógenos15,16. En este protocolo, la fagocitosis por iMGs se evalúa utilizando sinaptosomas humanos como material para la absorción de iMG. Con este fin, se describe una descripción para aislar sinaptosomas derivados de LMNs humanos i3. Los sinaptosomas humanos derivados de i3LMN están marcados con un colorante sensible al pH que permite la cuantificación de sinaptosomas localizados dentro de compartimentos ácidos durante el procesamiento del fagosoma y la degradación in vitro. Se muestra un ensayo de fagocitosis utilizando microscopía de células vivas para monitorear el proceso dinámico de envolvimiento de microglia en tiempo real. Este ensayo funcional establece una base para investigar posibles defectos en la fagocitosis microglial en la salud y la enfermedad utilizando un sistema humano completo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies for immunofluorescence analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-IBA1 rabbit antibody</td>
			<td>Wako Chemical USA</td>
			<td>NC9288364</td>
			<td>1:350 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P2RY12 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA014518</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TMEM119 rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA051870</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies for Western blot analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-Tubulin rabbit antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody</td>
			<td>Abclonal</td>
			<td>A6344</td>
			<td>1:1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD95 mouse antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1596</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid (100 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (75 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate (25 mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell Strainers</td>
			<td>&#160;Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lifter, Double End, Flat Blade &#38; Narrow Blade, Sterile</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adherence round-bottom 96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353847,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>&#160;Corning</td>
			<td>25058CI</td>
			<td>dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12-605-010</td>
			<td>dissociation reagents used for microglia differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating reagents for cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel GFR Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#8482;</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred as to extracellular matrix coating reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAdhere Laminin-521</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>77004</td>
			<td>Referred as to laminin 521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P3655</td>
			<td>Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;mTeSR Plus Kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>100-0276</td>
			<td>To prepare iPSC media mixed the components to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of EB media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PHC9534</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>final concentration 20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20A</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12001-988</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of PMP complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMP base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of iMG complete media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>final concentration 55 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-34</td>
			<td>PeproTech or Biologend</td>
			<td>200-34 or 577904</td>
			<td>final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMG base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>final concentration 5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-21</td>
			<td>final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Complete induction media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compound E</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>565790</td>
			<td>final concentration 0.2 &#956;M and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>final concentration 2 &#956;g/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction base media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y27632</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BD 562822</td>
			<td>final concentration 10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Components of Neuron media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Plus Neuronal Culture System</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3653401</td>
			<td>final concentration 1x for media and suplemment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA), 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC lines used in this study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOLF2.1J: WT clone B03</td>
			<td>The Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WTC11 hNIL</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synaptosome isolation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87793</td>
			<td>Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagocytosis assay dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Live Ready reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo Red, succinimidyl ester</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;P36600</td>
			<td>Referred as to pH-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other cell-culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue, 0.4% Solution</td>
			<td>AMRESCO INC</td>
			<td>K940-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22144-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9285</td>
			<td>Reconstitute to 40 mM in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Referred as to DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>23017015</td>
			<td>Referred as to laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 live cell imaging reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>version 3.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Therm Heat-Shake</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td></td>
			<td>refer as tube shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water sonicator</td>
			<td>Elma</td>
			<td>Mode Transsonic 310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human microglia-like cells: differentiation from induced pluripotent stem cells and in vitro live-cell phagocytosis assay using human synaptosomes

La microglía son las células inmunes residentes de origen mieloide que mantienen la homeostasis en el microambiente cerebral y se han convertido en un jugador clave en múltiples enfermedades neurológicas. El estudio de la microglía humana en la salud y la enfermedad representa un desafío debido al suministro extremadamente limitado de células humanas. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de individuos humanos pueden usarse para eludir esta barrera. Aquí, se demuestra cómo diferenciar las iPSC humanas en células similares a la microglía (iMG) para la experimentación in vitro . Estos iMG exhiben las propiedades esperadas y fisiológicas de la microglía, incluida la morfología similar a la microglía, la expresión de marcadores adecuados y la fagocitosis activa. Además, se proporciona documentación para aislar y etiquetar sustratos sinaptosómicos derivados de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC humanas (i3LMN). Se utiliza un ensayo de imagen longitudinal de células vivas para monitorear la absorción de sinaptosomas humanos marcados con un tinte sensible al pH, lo que permite investigaciones de la capacidad fagocítica de iMG. Los protocolos descritos en este documento son ampliamente aplicables a diferentes campos que investigan la biología de la microglía humana y la contribución de la microglía a la enfermedad.

Para generar iMGs utilizando este protocolo, es importante comenzar con iPSCs indiferenciadas que muestren morfología de colonia compacta con bordes bien definidos (Figura 2A). Las iPSC disociadas mantenidas como se describe en la sección de formación de EB formarán agregados esféricos, denominados EB, que crecerán en tamaño hasta el día 4 de diferenciación (Figura 2B). Una vez que los EB se recogen y chapan en las condiciones apropiadas para la generac...

Watch this Scientific Journal Video about Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes at JoVE.com

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

La microglía derivada de iPS representa una fuente biológicamente relevante de microglía humana para la experimentación in vitro, y es una herramienta importante para investigar la biología de la microglía en la salud y la enfermedad. Presentamos un protocolo simple de diferenciación de microglia que requiere un uso mínimo de factores de crecimiento y logra una alta pureza y rendimiento. Además, demostramos un ensayo de fagocitosis completamente humanizado.Las células similares a la microglía derivadas de iPSC son muy sensibles a la evaporación de los medios. Debe evitar usar los pozos en la esquina de la placa de cultivo celular y llenar todos los pozos vacíos con agua para mejorar la supervivencia. Una vez que las células madre pluripotentes inducidas, o iPSC, hayan alcanzado el 80% de confluencia, disocie las colonias lavando con un mililitro de DPBS y agregando un mililitro de un reactivo de disociación durante dos minutos a 37 grados centígrados.Desaloje las colonias usando un elevador de células raspando varias veces para crear una suspensión de una sola célula. Recoja la suspensión y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de DPBS. Luego centrifugar las células a 500 veces g durante un minuto, quitar el sobrenadante, y resuspender en un mililitro del cuerpo embrioide, o EB, medio.Tome 10 microlitros de células y diluya una o dos con azul de tripano. Cuente las células en un hemocitómetro y, según el recuento de células, diluya el stock celular hasta una dilución final de 10, 000 células por 100 microlitros. Para las células de recubrimiento, agregue 100 microlitros de las células diluidas por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo de baja adherencia.Centrifugar la placa a 125 veces g durante tres minutos, e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro días. El segundo día, utilizando una pipeta multicanal, sustituya el antiguo medio semiEB por un medio nuevo. Para generar precursores primitivos de macrófagos, o PMP, cubra los pocillos de una placa de seis pocillos agregando un mililitro de solución de recubrimiento Matrigel helada.Luego incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos horas, o durante la noche. En el cuarto día de diferenciación de EB, utilizando una punta de pipeta de un mililitro, transfiera los EB a los pocillos recubiertos de Matrigel. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para desalojar los EB del pozo.Luego mantenga la placa inclinada para permitir que los EB se asienten en el borde del pozo. Una vez que todos los EB se hayan asentado, pipetear suavemente y reemplazar el medio viejo, manteniendo el EB en el borde del pozo con tres mililitros de medio completo PMP recién preparado. Distribuya uniformemente las celdas en los pocillos arrastrando manualmente la placa de lado a lado y de atrás hacia adelante.Luego incube la placa durante siete días para permitir que los EB se adhieran al fondo del pozo. Después de siete días, inspeccione los EB bajo un microscopio de campo de luz con un aumento cuatro veces mayor para asegurarse de que estén conectados al fondo de los pozos. Realice un cambio de medio medio, y el día 21, reemplace el medio completo con tres mililitros de medio completo PMP.El día 28, busque células redondas denominadas PMP en el sobrenadante. A continuación, recoja el medio que contiene los PMP utilizando una pipeta de 10 mililitros y un pipeteo automático sin perturbar los EB. Transfiera los PMP en el medio a un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar los PMP recolectados a 200 veces g durante cuatro minutos y aspirar el sobrenadante antes de volver a suspenderlos en uno o dos mililitros de células similares a la microglía, o medio basal IMG. Luego cuente las células en el hemocitómetro como se describió anteriormente. Centrifugar el resto de las células y diluir las PMP a la concentración deseada.Luego coloque las células en placa a una densidad de 10 a la quinta células por centímetro cuadrado en placas tratadas con cultivo celular utilizando un medio completo IMG recién preparado. Para el ensayo de fagocitosis de células vivas, placa de 20 a 30 veces 10 a la cuarta PMP en una placa de 96 pocillos y 100 microlitros de IMG completa el medio y siga el proceso de diferenciación durante 10 días. El día del ensayo, retire 40 microlitros de medio por pocillo y agregue 10 microlitros de la solución de tinción nuclear.Incubar el plato durante dos horas. Descongele los sinaptosomas etiquetados en hielo y sonicar suavemente con un sonicador de agua durante un minuto. Una vez más, coloque inmediatamente los sinaptosomas en hielo.Diluir los sinaptosomas marcados en medio completo IMG a un microlitro de sinaptosomas por 50 microlitros de medio. Para el control negativo, prepare 60 micromolares de citocalasina D en medio completo IMG para inhibir la polimerización de actina y, por lo tanto, la fagocitosis. Luego agregue 10 microlitros de esta solución a cada pocillo para una concentración final de 10 micromolares e incube durante 30 minutos.Retire la placa de la incubadora e incube a 10 grados centígrados durante 10 minutos. Mantenga la placa en hielo y agregue 50 microlitros de medio que contenga sinaptosomas. Centrifugar la placa a 270 veces g durante tres minutos a 10 grados centígrados, y mantener la placa en hielo hasta la adquisición de imágenes.Inserte la placa en un lector de imágenes de células vivas y seleccione los pocillos que se analizarán. A continuación, seleccione un objetivo 20X. A continuación, ajuste el enfoque, el diodo emisor de luz o LED, la intensidad, el tiempo de integración y la ganancia de los canales azul y de campo brillante.La fluorescencia del sinaptosoma debe ser insignificante en el punto de tiempo inicial. Seleccione el número de fichas individuales que se adquirirán en un montaje por pozo. Adquiera 16 baldosas en el centro del pozo, obteniendo imágenes de aproximadamente el 5% del área total del pozo.Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados y el intervalo de tiempo deseado para la obtención de imágenes. A continuación, abra el software de análisis. Luego abra el experimento que contiene las imágenes y haga clic en el icono Reducción de datos.En el menú, seleccione Costura de imágenes en Procesamiento de imágenes para crear una imagen completa a partir de los mosaicos individuales de cuatro por cuatro en el montaje con los parámetros descritos en el manuscrito de texto. Defina un umbral de intensidad utilizando los canales DAPI y RFP para estas imágenes. Abra una imagen y haga clic en Analizar.En Análisis, seleccione Análisis celular y, en Canal de detección, elija una imagen cosida en los canales DAPI o RFP. A continuación, vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y establezca un valor de umbral y valores de tamaño de objeto que seleccionen correctamente los núcleos celulares en el canal DAPI o la señal sinaptosómica en el canal RFP. Para contar el número de núcleos, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis de imágenes, seleccione Análisis celular.Nuevamente, vaya a la pestaña Máscara primaria y conteo, y en Canal, seleccione las imágenes cosidas DAPI y use los parámetros descritos en el manuscrito de texto. A continuación, vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Recuento de celdas. Luego, para obtener el área de la señal del sinaptosoma, vaya al menú Reducción de datos y, en Análisis, seleccione Análisis celular.Nuevamente, vaya a la pestaña Máscara y recuento primarios y, en Canal, seleccione imágenes cosidas RFP y use los parámetros detallados en el manuscrito de texto. A continuación, vaya a la pestaña Métricas calculadas y seleccione Área de suma de objetos. En la pestaña Reducción de datos, haga clic en Aceptar para permitir que el software analice todas las imágenes adquiridas.Una vez analizadas las imágenes, exporte los valores Área de suma de objetos y Recuento de celdas para cada punto de tiempo. A continuación, divida el área de suma de objetos por el recuento de celdas para calcular el área normalizada por punto de tiempo. Si compara múltiples tratamientos o genotipos, calcule el índice de fagocitosis utilizando la ecuación dada.Las iPSCs indiferenciadas muestran una morfología de colonia compacta con bordes bien definidos. Las iPSC disociadas formaron agregados esféricos denominados EB, y crecen en tamaño hasta el cuarto día de diferenciación. Cuando los EB están chapados para la generación de PMP, se adhieren a las placas recubiertas de Matrigel, y una capa de células se extiende y rodea los agregados esféricos.En el día 28, las células redondas con una gran proporción de citoplasma a núcleo aparecen en la suspensión. Se recomienda encarecidamente cultivar iPSCs en placas recubiertas de Laminin 521 en lugar de Matrigel, debido al mayor rendimiento de PMP en placas recubiertas de Laminin 521. Después de la exposición de PMP al medio IMG, las células adquieren una morfología similar a la microglía con un pequeño citoplasma en presencia de procesos alargados.Además, la identidad de la microglía se verificó mediante tinción inmunofluorescente. Típicamente, más del 95% de las células expresan IB1 y aproximadamente el 90% de las células expresan P2RY12 y TMEM119. El análisis de Western blot confirmó que iPSC derivaba neuronas motoras inferiores para los marcadores sinápticos expresados por los sinaptosomas humanos, la sinaptofisina y la proteína de densidad postsináptica 95.En control en comparación con el punto de tiempo inicial, a las 10 horas, la señal fluorescente roja era robusta, ya que la mayoría de los sinaptosomas habían sido engullidos, y estaban localizados en compartimentos intracelulares ácidos. En los IMG tratados con citocalasina D, una fuerte reducción de la señal roja durante cero y 10 horas indicó que la señal detectada resulta de eventos fagocíticos. El área de sinaptosomas engullidos aumentó con el tiempo hasta las 16 horas.Sin embargo, el área de señal roja de las células tratadas con citocalasina D no aumentó con el tiempo. Las células similares a la microglía derivadas de iPS se pueden usar para diversas aplicaciones, incluida la fagocitosis y la respuesta inflamatoria en el estudio de enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Investigación

Neurociencias

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Generación de neuronas humanas y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes para modelar las interacciones neuronal-oligodendrocitos

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...