En metode til at studere sammenhængen mellem lokal kollagenstruktur og mekaniske egenskaber af aterosklerotisk plaque-fibrøst væv

Denne protokol muliggør lokale vurderinger af både kollagenarkitektur og mekaniske fejlegenskaber ved fibrøst plakvæv. Da både strukturelle og mekaniske vurderinger blev udført på den samme vævsprøve, giver denne teknik mulighed for at optrævle den funktionelle forbindelse mellem de strukturelle og mekaniske vurderinger af vævet. Den viden, der opnås med denne protokol om fibrøs plakvævsstruktur og svigtkarakteristika, er nøglen til at forebygge og forudsige kliniske dødelige hændelser udløst af aterosklerotisk plaquebrud.

Til at begynde med skal du klippe pladen åben langs arteriens længdeakse ved hjælp af kirurgisk saks og pincet. Klip rektangulære testprøver ud af plakprøverne, og sørg for, at prøverne er så store som muligt, samtidig med at du undgår vævsområder, der indeholder tårer eller forkalkninger. Tag derefter en plaktestprøve og fastgør begge dens ender til silikonen ved at fastgøre nåle i vævet.

Indsæt nålene i det område af prøven, der vil være i klemmerne på trækprøvningsenheden under den mekaniske test. Tag sikkerhedsbriller på. Brug en sideskærer til at forkorte nålene, så de stikker ud mindre end et par millimeter over prøveoverfladen for at forhindre dem i at beskadige mikroskopmålet.

Fyld petriskålen med PBS, indtil prøven er nedsænket. Tænd derefter mikroskopsystemet, drej multifotontasten og åbn mikroskopets operativsystem. Sæt petriskålen med analyseprøven under målet, og sænk mikroskopmålet.

Tænd for live scan-tilstand. Flyt målsætningen til et hjørne af eksemplet ved hjælp af knapperne på smartpanelet, og klik på symbolet for markeringsposition i panelet Flisescanning. Hvis det udføres korrekt, vises et gitter med alle valgte fliser til billedbehandling i orange.

Klik derefter på Start i nederste højre hjørne af skærmen for at oprette en flisescanning af hele prøveoverfladen for at få et overblik over prøvegeometrien. Efter feltscanningen skal du observere X- og Y-koordinaterne i øverste venstre hjørne af den øverste venstre flise i panelet Flisescanning, der vises automatisk. Notér disse koordinater i et regneark.

I panelet Flisescanning skal du observere antallet af fliser i X- og Y-retningerne i feltet ScanField. Bemærk størrelsen på feltscanningen i regnearket. Beregn koordinaterne for de andre felter ved at lægge flisen sammen eller trække den fra.

Fra feltscanningen skal du vælge de fliser, der skal afbildes med en anden harmonisk generation eller SHG-billeddannelse. Ved valget skal du undgå fliser i klemmerne og efterlade en flise mellem hver valgt flise i både længde- og omkredsretningen. Identificer derefter placeringen af de felter, der skal afbildes, ved hjælp af de beregnede koordinater i dette regneark.

Udfyld koordinaterne i de angivne felter, og klik på Enter, så målsætningen flyttes til højre felt. Tænd for live scan-tilstand. Forøg multifoton- eller MP-lasereffekten ved hjælp af skyderen i det øverste panel og strålebaneindstillingerne for at få den højest mulige lasereffekt uden væsentlig blegning.

Juster derefter detektorforstærkningen for at få lyse billeder uden mættede pixels ved hjælp af knappen på smartpanelet eller ved at klikke på detektorens navn og strålebaneindstillingerne og yderligere kanaler. Typiske værdier for detektorforstærkningen er mellem 500 og 800 volt. Brug Z-positionsknappen på smartpanelet til at justere fokusplanet.

Flyt derefter til toppen af prøven, og indstil positionerne for toppen af Z-stakken ved at klikke på pilespidsen i Z-stack-panelet under fanen Anskaffelse fra det tredje panel. Fokuser derefter på prøven, indtil SHG-signalet ikke længere registreres. Klik igen på pilespidsen i Z-stack-panelet for at indstille denne position.

Når du er færdig, skal du slukke for live scanningstilstand. Under fanen Anskaffelse i det andet panel skal du holde scanningshastigheden på 400 hertz, indstille linjegennemsnittet til to og opløsningen til 512 x 512 pixels pr. billede ved hjælp af rullelisterne. Skift til tovejs X-scanningsknappen.

Klik på z-trinstørrelse i Z-stack-panelet, og udfyld en z-trinstørrelse på tre mikron i boksen. Klik på Start i nederste højre hjørne af skærmen for at oprette en Z-stak. Når du er færdig, skal du gemme koordinaterne for feltet i filnavnet eller give hvert felt dets nummer.

Efter billeddannelse udsættes prøven for mekanisk testning. For at generere et spacklemønster skal du holde airbrush fyldt med vævsfarve cirka 30 centimeter væk fra testprøven og sprøjte den på lumenaloverfladen. Derefter placeres prøven i træktesterens klemmer med prøvens omkredsretning på linje med trækprøvens strækningsretning og den lumenale side af prøven opad til endrivningsstrækningstestens strengetest.

Sørg for, at den oprindelige målerlængde er indstillet, så strimlens bredde-til-længde-forhold er mindre end en. Stram grebets skruer ved at anvende et drejningsmoment på 20 centinewtonmeter ved hjælp af en momentskruetrækker. Der tilsættes PBS i varmebadet, indtil prøven er nedsænket.

Riv vejecellen, og begynd at registrere de globale kraft- og forskydningsmålinger fra vejecellen og træktesterens aktuator. Ret prøven ud ved at anvende en forstrækning på 0,05 newton for at slippe af med slæk i prøven. Udfør 10 cyklusser med forkonditionering, op til 10 % belastning, baseret på aktuatorens måling af målerlængden efter påføring af forstrækning.

Start den uniaxiale trækprøvning, indtil prøven er fuldstændig svigtet, mens du optager en video af prøvedeformationen med højhastighedskameraet. Efter fejl skal du stoppe med at registrere de globale kraft- og forskydningsmålinger. Åbn Z-stakkene opnået under multifotonmikroskopi eller MPM med SHG i billede J, og opret maksimale intensitetsfremskrivninger eller MIP'er for hver Z-stak.

Analyser hver MIP med open source MATLAB-baseret fiberorienteringsanalyseværktøj for at måle orienteringsvinklen for de enkelte kollagenfibre, der findes i fliserne. Brug et andet MATLAB-baseret værktøj, FibLab, til at tilpasse en Gaussisk fordeling til vinkelfordelingshistogrammet. Fra det gaussiske distributionsplot ekstraheres de strukturelle parametre såsom den dominerende fibervinkel, som er fordelingsmåden, standardafvigelsen for fibervinkelfordelingen og den anisotrope fraktion.

Udfør visuel inspektion på kamerabillederne for at identificere det billede, hvor brudstart finder sted. Identificer brudstedet visuelt. Udfør den digitale billedkorrelation, DIC, analyse med MATLAB-baseret software ncorr ved hjælp af kamerabillederne, der er optaget under træktesten.

Vælg det sidste billede før den sidste strækning indtil fejl som referencebillede. For de aktuelle billeder skal du vælge ll images fra starten af den sidste strækning til det sidste billede før det billede, hvor bruddet startede. Vælg eksempeloverfladen som interesseområde eller investeringsafkast.

Ekskluder de områder, der er i nærheden af klemmerne. Udfør DIC ved at indstille parameterens delmængderadius til 30 pixels, delmængdeafstand til tre pixels, iterationsafskæring til 50, norm for forskelsvektorafskæring til 10 til effekten af fem, belastningsradius til fem og autoformeringstrin til fem. Fra DIC-analysen med ncorr opnås Green-LaGrange- eller Eulerian-stammefordelingen af ROI.

Brug disse belastningsfordelinger til at beregne den gennemsnitlige Green-LaGrange-stamme af hele plakprøveoverfladen ved den sidste ramme før brud. Beregn Green-LaGrange-stammen på brudstedet. Brug de naturlige landemærker i testprøven til at lave en overlejring af referencebilledet og flisescanningen for at identificere brudplaceringen på flisescanningen.

Identificer MPM-SHG-flisen, hvor bruddet skete. Hvis bruddet ikke er i et felt, der er scannet med MPM-SHG, skal du identificere det felt, der er tættest på brudplaceringen. Få de strukturelle parametre, der findes ved flisen, hvor bruddet opstod.

En frisk og intakt plakprøve med få eller ingen tårer og makrokalcifikationer vises her. Plaqueprøver kan hentes fra områder, der ikke omfatter disse tårer og forkalkninger. SHG-billedbehandling og billedefterbehandling leverer MIP'er fra hvert afbildet felt.

Yderligere efterbehandling ved fiberdetektion giver fiberorienteringshistogrammer, hvorfra kollagenstrukturelle parametre kan ekstraheres. Derudover opnås farvekort, der viser de lokale strukturelle kollagenparametre på tværs af hele plakprøven, til visuel analyse. Fra disse testprøver blev der observeret en stor intrasamplevariation i de strukturelle kollagenparametre.

Brudinitiering og formering i en plakvævsprøve under trækprøven demonstreres her. Digital billedkorrelationsanalyse giver lokale vævsdeformationskort, såsom Green-LaGrange-stammekortene. Fra disse stammekort blev der observeret en stor intrasample-variation i de lokale stammer.

Når brudstedet er identificeret på kameraoptagelserne, kan det kortlægges tilbage til referencekamerabilledet og mikroskopiflisescanningen. Dette giver MPM-SHG-flisen, hvor bruddet skete, og de strukturelle parametre, der findes på denne flise. At opnå fibrøse vævsprøver, der er fri for forkalkninger og er af en stor nok størrelse, der kan bruges til mekanisk testning, kan være en udfordrende opgave for stærkt forkalkede plaques.

Når en mekanisk eller strukturel funktion er identificeret som prædiktor for fibrøs plakvævssvigt, vil et in vivo-billeddannelsessystem, der måler denne funktion, muliggøre forudsigelse af risiko for plakbrud hos patienter.