1.6K Views
•
13:45 min
•
November 11th, 2022
DOI :
November 11th, 2022
•0:05
Introduction
0:46
Tissue Sample Preparation and Multiphoton Microscopy (MPM) Imaging
6:04
Mechanical Testing
7:55
Data Analysis
11:22
Results: Studying Heterogeneous Structural and Mechanical Atherosclerotic Plaque Properties
13:06
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल कोलेजन आर्किटेक्चर और रेशेदार पट्टिका ऊतक की यांत्रिक विफलता विशेषताओं दोनों के स्थानीय आकलन को सक्षम बनाता है। चूंकि संरचनात्मक और यांत्रिक दोनों आकलन एक ही ऊतक नमूने पर किए गए थे, इसलिए यह तकनीक ऊतक के संरचनात्मक और यांत्रिक आकलन के बीच कार्यात्मक लिंक को उजागर करने की अनुमति देती है। रेशेदार पट्टिका ऊतक संरचना और विफलता विशेषताओं पर इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त ज्ञान एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका टूटने से उत्पन्न नैदानिक घातक घटनाओं को रोकने और भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है।
शुरू करने के लिए, सर्जिकल कैंची और चिमटी का उपयोग करके धमनी के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ पट्टिका को काटें। पट्टिका नमूनों से आयताकार परीक्षण के नमूने काट लें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नमूने आँसू या कैल्सीफिकेशन वाले ऊतक क्षेत्रों से बचते हुए जितना संभव हो उतना बड़ा हैं। इसके बाद, एक पट्टिका परीक्षण नमूना लें और ऊतक में सुइयों को पिन करके सिलिकॉन के लिए इसके दोनों सिरों को ठीक करें।
नमूने के क्षेत्र में सुइयों को डालें जो यांत्रिक परीक्षण के दौरान तन्यता परीक्षण उपकरण के क्लैंप में होंगे। सुरक्षा चश्मा पहनें। सुइयों को छोटा करने के लिए एक साइड कटर का उपयोग करें ताकि वे माइक्रोस्कोप उद्देश्य को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए नमूना सतह से कुछ मिलीमीटर से कम चिपक जाएं।
पेट्री डिश को पीबीएस के साथ भरें जब तक कि नमूना जलमग्न न हो जाए। इसके बाद, माइक्रोस्कोप सिस्टम चालू करें, मल्टीफोटॉन कुंजी को चालू करें, और माइक्रोस्कोप के ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर को खोलें। परीक्षण नमूने वाले पेट्री डिश को उद्देश्य के नीचे रखें और माइक्रोस्कोप उद्देश्य को कम करें।
लाइव स्कैन मोड चालू करें। स्मार्ट पैनल पर नॉब्स का उपयोग करके उद्देश्य को नमूने के एक कोने में ले जाएं और टाइल स्कैन पैनल में मार्क स्थिति प्रतीक पर क्लिक करें। यदि सही तरीके से प्रदर्शन किया जाता है, तो इमेजिंग के लिए सभी चयनित टाइलों के साथ एक ग्रिड नारंगी रंग में दिखाई देगा।
इसके बाद, नमूना ज्यामिति का अवलोकन प्राप्त करने के लिए संपूर्ण नमूना सतह का टाइल स्कैन बनाने के लिए स्क्रीन के निचले दाएं कोने में प्रारंभ करें पर क्लिक करें। टाइल स्कैन के बाद, स्वचालित रूप से दिखाए गए टाइल स्कैन पैनल में ऊपरी बाएं टाइल के ऊपरी बाएं कोने के एक्स और वाई निर्देशांक का निरीक्षण करें। स्प्रेडशीट में इन निर्देशांकों को नोट करें।
टाइल स्कैन पैनल में, स्कैनफील्ड नामक बॉक्स में एक्स और वाई दिशाओं में टाइल्स की संख्या का निरीक्षण करें। स्प्रेडशीट में टाइल स्कैन का आकार नोट करें। टाइल के आकार को जोड़कर या घटाकर अन्य टाइलों के निर्देशांक की गणना करें।
टाइल स्कैन से, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी, या एसएचजी इमेजिंग के साथ चित्रित की जाने वाली टाइलों का चयन करें। चयन के लिए, क्लैंप में टाइल्स से बचें और अनुदैर्ध्य और परिधीय दिशा दोनों में प्रत्येक चयनित टाइल के बीच एक टाइल छोड़ दें। इसके बाद, इस स्प्रेडशीट में गणना किए गए निर्देशांक का उपयोग करके चित्रित की जाने वाली टाइलों के स्थान की पहचान करें।
निर्दिष्ट बक्से में निर्देशांक भरें और Enter पर क्लिक करें ताकि उद्देश्य दाईं टाइल पर चला जाए। लाइव स्कैन मोड चालू करें। महत्वपूर्ण विरंजन के बिना उच्चतम संभव लेजर शक्ति प्राप्त करने के लिए ऊपरी पैनल और बीम पथ सेटिंग्स में स्लाइडर का उपयोग करके मल्टीफोटॉन, या एमपी, लेजर पावर बढ़ाएं।
फिर, स्मार्ट पैनल पर नॉब का उपयोग करके या डिटेक्टर के नाम और बीम पथ सेटिंग्स और अतिरिक्त चैनलों पर क्लिक करके संतृप्त पिक्सेल के बिना उज्ज्वल छवियों को प्राप्त करने के लिए डिटेक्टर लाभ को समायोजित करें। डिटेक्टर लाभ के लिए विशिष्ट मान 500 और 800 वोल्ट के बीच हैं। फ़ोकस विमान को समायोजित करने के लिए स्मार्ट पैनल पर जेड-स्थिति नॉब का उपयोग करें।
फिर, नमूने के शीर्ष पर जाएं और तीसरे पैनल से अधिग्रहण टैब के तहत जेड-स्टैक पैनल में एरोहेड पर क्लिक करके जेड-स्टैक के शीर्ष की स्थिति सेट करें। फिर, नमूने पर ध्यान केंद्रित करें जब तक कि एसएचजी सिग्नल का पता नहीं लगाया जाता है। फिर, इस स्थिति को सेट करने के लिए जेड-स्टैक पैनल में तीर पर क्लिक करें।
समाप्त होने पर, लाइव स्कैन मोड बंद करें। दूसरे पैनल में अधिग्रहण टैब के तहत, ड्रॉपडाउन सूचियों का उपयोग करके स्कैन की गति 400 हर्ट्ज पर रखें, लाइन औसत को दो पर सेट करें, और रिज़ॉल्यूशन को 512 से 512 पिक्सेल प्रति छवि पर सेट करें। द्विदिश एक्स स्कैनिंग बटन पर टॉगल करें।
जेड-स्टैक पैनल में जेड-स्टेप आकार पर क्लिक करें और बॉक्स में तीन माइक्रोन का जेड-स्टेप आकार भरें। Z-stack बनाने के लिए स्क्रीन के निचले दाएं कोने में प्रारंभ क्लिक करें. समाप्त होने पर, फ़ाइल नाम में टाइल के निर्देशांक सहेजें या प्रत्येक टाइल को उसकी संख्या दें।
इमेजिंग के बाद, नमूना यांत्रिक परीक्षण के संपर्क में है। एक स्पेकल पैटर्न उत्पन्न करने के लिए, परीक्षण नमूने से लगभग 30 सेंटीमीटर दूर ऊतक डाई से भरे एयरब्रश को पकड़ें और इसे लुमेनल सतह पर स्प्रे करें। इसके बाद, एकअक्षीय तन्यता परीक्षण के लिए, नमूने को तन्यता परीक्षक के क्लैंप में तन्यता खिंचाव दिशा और नमूने के लुमेनल पक्ष के साथ संरेखित तन्यता परीक्षक के क्लैंप में रखें।
सुनिश्चित करें कि प्रारंभिक गेज लंबाई सेट की गई है ताकि पट्टी की चौड़ाई-से-लंबाई अनुपात एक से कम हो। टॉर्क स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके 20 सेंटीनेवाटन मीटर का टॉर्क लगाकर ग्रिप्स के शिकंजे को कसें। नमूना जलमग्न होने तक हीटिंग स्नान में पीबीएस जोड़ें।
लोड सेल को फाड़ें और लोड सेल और तन्यता परीक्षक के एक्ट्यूएटर से वैश्विक बल और विस्थापन माप रिकॉर्ड करना शुरू करें। नमूने में शिथिलता से छुटकारा पाने के लिए 0.05 न्यूटन के पूर्व-खिंचाव को लागू करके नमूने को सीधा करें। प्री-स्ट्रेच के आवेदन के बाद एक्ट्यूएटर द्वारा गेज लंबाई माप के आधार पर, 10% तनाव तक प्री-कंडीशनिंग के 10 चक्र करें।
उच्च गति कैमरे के साथ नमूना विरूपण का वीडियो रिकॉर्ड करते समय नमूने की पूर्ण विफलता तक एकअक्षीय तन्यता परीक्षण शुरू करें। विफलता के बाद, वैश्विक बल और विस्थापन माप को रिकॉर्ड करना बंद कर दें। छवि जे में एसएचजी के साथ मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी, या एमपीएम के दौरान प्राप्त जेड-स्टैक्स खोलें और प्रत्येक जेड-स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमान, या एमआईपी बनाएं।
टाइल्स में मौजूद व्यक्तिगत कोलेजन फाइबर के अभिविन्यास कोण को मापने के लिए ओपन सोर्स मैटलैब-आधारित फाइबर ओरिएंटेशन विश्लेषण उपकरण के साथ प्रत्येक एमआईपी का विश्लेषण करें। गॉसियन वितरण को कोण वितरण हिस्टोग्राम में फिट करने के लिए एक और MATLAB-आधारित उपकरण, FibLab का उपयोग करें। गॉसियन वितरण प्लॉट से, संरचनात्मक मापदंडों जैसे कि प्रमुख फाइबर कोण, जो वितरण का तरीका है, फाइबर कोण वितरण का मानक विचलन और अनिसोट्रोपिक अंश निकालें।
उस फ्रेम की पहचान करने के लिए कैमरा छवियों पर दृश्य निरीक्षण करें जिसमें टूटना दीक्षा होती है। टूटने के स्थान की नेत्रहीन पहचान करें। तन्यता परीक्षण के दौरान रिकॉर्ड की गई कैमरा छवियों का उपयोग करके MATLAB-आधारित सॉफ़्टवेयर ncorr के साथ डिजिटल छवि सहसंबंध, DIC, विश्लेषण करें।
संदर्भ छवि के रूप में विफलता तक अंतिम स्ट्रेचिंग से पहले अंतिम फ्रेम का चयन करें। वर्तमान छवियों के लिए, अंतिम स्ट्रेचिंग की शुरुआत से लेकर फ्रेम से पहले अंतिम फ्रेम तक की छवियों का चयन करें जिसमें टूटना दीक्षा हुई थी। नमूना सतह को रुचि के क्षेत्र, या ROI के रूप में चुनें।
उन क्षेत्रों को बाहर करें जो क्लैंप के पास हैं। पैरामीटर के उप-समूह त्रिज्या को 30 पिक्सेल, उप-समूह अंतराल को तीन पिक्सेल, पुनरावृत्ति कटऑफ को 50 तक, अंतर वेक्टर कटऑफ के मानदंड को पांच की शक्ति तक, तनाव त्रिज्या को पांच तक और ऑटोप्रोपेगेशन चरण को पांच पर सेट करके डीआईसी निष्पादित करें। एनकोर्न के साथ डीआईसी विश्लेषण से, आरओआई के ग्रीन-लाग्रेंज या यूलेरियन स्ट्रेन वितरण प्राप्त करें।
टूटने से पहले अंतिम फ्रेम पर पूरे पट्टिका नमूना सतह के औसत ग्रीन-लाग्रेंज तनाव की गणना करने के लिए इन तनाव वितरणों का उपयोग करें। टूटने वाले स्थान पर ग्रीन-लाग्रेंज तनाव की गणना करें। परीक्षण नमूने में प्राकृतिक स्थलों का उपयोग करके, टाइल स्कैन पर टूटने के स्थान की पहचान करने के लिए संदर्भ छवि और टाइल स्कैन का एक ओवरले बनाएं।
एमपीएम-एसएचजी टाइल की पहचान करें जहां टूटना हुआ था। यदि टूटना एमपीएम-एसएचजी के साथ स्कैन की गई टाइल में नहीं है, तो टूटने वाले स्थान के निकटतम टाइल की पहचान करें। टाइल पर पाए गए संरचनात्मक मापदंडों को प्राप्त करें जहां टूटना हुआ था।
एक ताजा और बरकरार पट्टिका का नमूना जिसमें बहुत कम आँसू और मैक्रोकैल्सीफिकेशन नहीं हैं, यहां दिखाया गया है। पट्टिका के नमूने उन क्षेत्रों से पुनर्प्राप्त किए जा सकते हैं जिनमें ये आँसू और कैल्सीफिकेशन शामिल नहीं हैं। एसएचजी इमेजिंग और इमेज पोस्ट-प्रोसेसिंग प्रत्येक इमेज्ड टाइल से एमआईपी प्रदान करते हैं।
फाइबर डिटेक्शन द्वारा आगे पोस्ट-प्रोसेसिंग फाइबर ओरिएंटेशन हिस्टोग्राम पैदा करता है जिसमें से कोलेजन संरचनात्मक मापदंडों को निकाला जा सकता है। इसके अलावा, पूरे पट्टिका नमूने में स्थानीय संरचनात्मक कोलेजन मापदंडों को दिखाने वाले रंग मानचित्र दृश्य विश्लेषण के लिए प्राप्त किए जाते हैं। इन परीक्षण नमूनों से, संरचनात्मक कोलेजन मापदंडों में एक बड़ा इंट्रासैंपल भिन्नता देखी गई थी।
तन्यता परीक्षण के दौरान एक पट्टिका ऊतक नमूने में टूटना दीक्षा और प्रसार यहां प्रदर्शित किया गया है। डिजिटल छवि सहसंबंध विश्लेषण स्थानीय ऊतक विरूपण मानचित्र प्रदान करता है, जैसे कि ग्रीन-लाग्रेंज तनाव मानचित्र। इन स्ट्रेन मैप्स से, स्थानीय उपभेदों में एक बड़ा इंट्रासैंपल भिन्नता देखी गई थी।
एक बार कैमरा रिकॉर्डिंग पर टूटने के स्थान की पहचान हो जाने के बाद, इसे संदर्भ कैमरा छवि और माइक्रोस्कोपी टाइल स्कैन में वापस मैप किया जा सकता है। यह एमपीएम-एसएचजी टाइल प्रदान करता है जहां टूटना हुआ और इस टाइल में पाए गए संरचनात्मक पैरामीटर। रेशेदार ऊतक के नमूने प्राप्त करना जो कैल्सीफिकेशन से मुक्त हैं और यांत्रिक परीक्षण के लिए काम करने योग्य बड़े आकार के हैं, भारी कैल्सीफाइड सजीले टुकड़े के लिए एक चुनौतीपूर्ण कार्य हो सकता है।
एक बार जब एक यांत्रिक या संरचनात्मक विशेषता को रेशेदार पट्टिका ऊतक विफलता के भविष्यवक्ता के रूप में पहचाना जाता है, तो इस सुविधा को मापने वाली एक इनविवो इमेजिंग प्रणाली रोगियों में पट्टिका टूटने के जोखिम की भविष्यवाणी करने की अनुमति देगी।
हमने विषम संरचनात्मक और यांत्रिक एथेरोस्क्लेरोटिक पट्टिका गुणों का अध्ययन करने के लिए एक मेकानो-इमेजिंग पाइपलाइन विकसित की है। यह पाइपलाइन कोलेजन फाइबर अभिविन्यास के स्थानीय प्रमुख कोण और फैलाव, टूटने के व्यवहार और रेशेदार पट्टिका ऊतक के तनाव फिंगरप्रिंट के सहसंबंध को सक्षम करती है।
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved