이 프로토콜은 콜라겐 구조와 섬유질 플라크 조직의 기계적 고장 특성 모두에 대한 국소 평가를 가능하게 합니다. 구조적 평가와 기계적 평가가 모두 동일한 조직 샘플에 대해 수행되었기 때문에 이 기술을 통해 조직의 구조적 평가와 기계적 평가 사이의 기능적 연관성을 밝힐 수 있습니다. 섬유성 플라크 조직 구조 및 실패 특성에 대한 이 프로토콜로 얻은 지식은 죽상경화성 플라크 파열에 의해 유발되는 임상적 치명적인 사건을 예방하고 예측하는 데 중요합니다.
시작하려면 수술 용 가위와 핀셋을 사용하여 동맥의 세로축을 따라 플라크를 자릅니다. 플라크 표본에서 직사각형 테스트 샘플을 잘라내어 샘플이 가능한 한 커지도록 하면서 눈물이나 석회화가 포함된 조직 영역을 피합니다. 다음으로, 플라크 테스트 샘플을 채취하여 조직에 바늘을 고정하여 양쪽 끝을 실리콘에 고정합니다.
기계적 시험 중 인장 시험 장치의 클램프에 들어갈 샘플 영역에 바늘을 삽입합니다. 보안경을 착용하십시오. 측면 커터를 사용하여 바늘이 현미경 대물렌즈가 손상되지 않도록 샘플 표면에서 몇 밀리미터 미만으로 튀어나오도록 바늘을 줄입니다.
샘플이 잠길 때까지 페트리 접시에 PBS를 채웁니다. 그런 다음 현미경 시스템을 켜고 다광자 키를 돌린 다음 현미경의 작동 소프트웨어를 엽니다. 테스트 샘플이 들어 있는 페트리 접시를 대물렌즈 아래에 놓고 현미경 대물렌즈를 내립니다.
라이브 스캔 모드를 켭니다. 스마트 패널의 노브를 사용하여 대물렌즈를 샘플의 모서리로 이동하고 타일 스캔 패널에서 마크 위치 기호를 클릭합니다. 올바르게 수행되면 이미징을 위해 선택한 모든 타일이 있는 그리드가 주황색으로 나타납니다.
그런 다음 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 전체 샘플 표면의 타일 스캔을 생성하여 샘플 형상의 개요를 얻습니다. 타일 스캔 후 자동으로 표시되는 타일 스캔 패널에서 왼쪽 상단 타일의 왼쪽 위 모서리에 있는 X 및 Y 좌표를 관찰합니다. 스프레드시트에 이러한 좌표를 기록해 둡니다.
타일 스캔 패널에서 ScanField라는 상자에서 X 및 Y 방향의 타일 수를 확인합니다. 스프레드시트에서 타일 스캔의 크기를 확인합니다. 타일의 크기를 더하거나 빼서 다른 타일의 좌표를 계산합니다.
타일 스캔에서 2차 고조파 생성 또는 SHG 이미징으로 이미징할 타일을 선택합니다. 선택을 위해 클램프의 타일을 피하고 선택한 각 타일 사이에 세로 방향과 원주 방향 모두에 하나의 타일을 남겨 둡니다. 다음으로, 이 스프레드시트에서 계산된 좌표를 사용하여 이미지화할 타일의 위치를 식별합니다.
지정된 상자에 좌표를 입력하고 Enter 키를 클릭하여 목표가 오른쪽 타일로 이동하도록 합니다. 라이브 스캔 모드를 켭니다. 상단 패널의 슬라이더와 빔 경로 설정을 사용하여 다광자 또는 MP 레이저 출력을 높이면 심각한 표백 없이 가능한 최고의 레이저 출력을 얻을 수 있습니다.
그런 다음 스마트 패널의 노브를 사용하거나 감지기 이름과 빔 경로 설정 및 추가 채널을 클릭하여 포화 픽셀이 없는 밝은 이미지를 얻을 수 있도록 감지기 게인을 조정합니다. 검출기 이득의 일반적인 값은 500볼트에서 800볼트 사이입니다. 스마트 패널의 Z 위치 노브를 사용하여 초점 평면을 조정합니다.
그런 다음 샘플의 맨 위로 이동하고 세 번째 패널의 획득 탭 아래에 있는 Z 스택 패널의 화살촉을 클릭하여 Z 스택 상단의 위치를 설정합니다. 그런 다음 SHG 신호가 더 이상 감지되지 않을 때까지 샘플에 초점을 맞춥니다. 다시 Z 스택 패널에서 화살촉을 클릭하여 이 위치를 설정합니다.
완료되면 라이브 스캔 모드를 끕니다. 두 번째 패널의 획득 탭에서 드롭다운 목록을 사용하여 스캔 속도를 400Hz로 유지하고, 라인 평균을 2로 설정하고, 해상도를 이미지당 512 x 512픽셀로 설정합니다. 양방향 X 스캔 버튼을 켭니다.
Z-스택 패널에서 z-스텝 크기를 클릭하고 상자에 3미크론의 z-스텝 크기를 입력합니다. 화면 오른쪽 하단 모서리에 있는 시작을 클릭하여 Z 스택을 생성합니다. 완료되면 타일의 좌표를 파일 이름에 저장하거나 각 타일에 번호를 지정합니다.
이미징 후 샘플은 기계적 테스트에 노출됩니다. 스패클 패턴을 생성하려면 티슈 염료로 채워진 에어브러시를 테스트 샘플에서 약 30cm 떨어진 곳에 잡고 내강 표면에 뿌립니다. 다음으로, 단축 인장 시험의 경우, 샘플의 원주 방향이 인장 스트레칭 방향과 정렬되고 샘플의 내강 쪽이 위쪽을 향하도록 샘플을 인장 시험기의 클램프에 놓습니다.
스트립의 너비 대 길이 비율이 1보다 작도록 초기 표점 거리가 설정되어 있는지 확인합니다. 토크 드라이버를 사용하여 20 센티미터 뉴턴 미터의 토크를 적용하여 그립의 나사를 조입니다. 샘플이 잠길 때까지 가열 수조에 PBS를 추가합니다.
로드셀을 찢고 로드셀과 인장 시험기의 액추에이터에서 전체 힘 및 변위 측정값을 기록하기 시작합니다. 샘플의 느슨함을 제거하기 위해 0.05뉴턴의 사전 스트레치를 적용하여 샘플을 곧게 펴십시오. 사전 스트레칭을 적용한 후 액추에이터가 측정한 게이지 거리를 기준으로 최대 10% 변형률까지 10주기의 사전 컨디셔닝을 수행합니다.
고속 카메라로 샘플 변형 비디오를 녹화하는 동안 샘플이 완전히 파손될 때까지 단축 인장 시험을 시작합니다. 실패 후 전체 힘 및 변위 측정 기록을 중지합니다. 이미지 J에서 SHG를 사용하여 다광자 현미경(MPM) 중에 얻은 Z-스택을 열고 각 Z-스택의 최대 강도 투영(MIP)을 생성합니다.
오픈 소스 MATLAB 기반 섬유 배향 분석 툴로 각 MIP를 분석하여 타일에 존재하는 개별 콜라겐 섬유의 배향 각도를 측정합니다. 또 다른 MATLAB 기반 툴인 FibLab을 사용하여 가우스 분포를 각도 분포 히스토그램에 피팅합니다. 가우스 분포도에서 분포의 모드인 우세한 섬유 각도, 섬유 각도 분포의 표준 편차, 이방성 분율과 같은 구조적 파라미터를 추출합니다.
파열이 시작되는 프레임을 식별하기 위해 카메라 이미지에 대한 육안 검사를 수행합니다. 파열 위치를 육안으로 식별합니다. 인장 시험 중에 기록된 카메라 이미지를 사용하여 MATLAB 기반 소프트웨어 ncorr로 디지털 이미지 상관관계(DIC) 분석을 수행합니다.
실패할 때까지 최종 스트레칭 전의 마지막 프레임을 참조 이미지로 선택합니다. 현재 이미지의 경우 최종 스트레칭 시작부터 파열 시작이 발생한 프레임 전의 마지막 프레임까지 ll images를 선택합니다. 샘플 표면을 관심 영역 또는 ROI로 선택합니다.
클램프 근처에 있는 영역을 제외합니다. 파라미터의 부분 집합 반지름을 30픽셀로, 부분 집합 간격을 3픽셀로, 반복 컷오프를 50으로, 차이 벡터 컷오프의 노름을 10의 5승으로, 변형 반경을 5로, 자동 전파 단계를 5로 설정하여 DIC를 수행합니다. ncorr을 사용한 DIC 분석에서 ROI의 Green-LaGrange 또는 Eulerian 변형률 분포를 얻습니다.
이러한 변형률 분포를 사용하여 파열 전 마지막 프레임에서 전체 플라크 샘플 표면의 평균 Green-LaGrange 변형률을 계산합니다. 파열 위치에서 Green-LaGrange 변형률을 계산합니다. 테스트 샘플의 자연 랜드마크를 사용하여 참조 이미지와 타일 스캔의 오버레이를 만들어 타일 스캔의 파열 위치를 식별합니다.
파열이 발생한 MPM-SHG 타일을 식별합니다. MPM-SHG로 스캔한 타일에 파열이 없는 경우 파열 위치에 가장 가까운 타일을 식별합니다. 파열이 발생한 타일에서 발견된 구조적 매개변수를 구합니다.
눈물과 거대 석회화가 거의 또는 전혀 없는 신선하고 온전한 플라크 샘플이 여기에 표시됩니다. 플라크 샘플은 이러한 눈물과 석회화를 포함하지 않는 영역에서 회수할 수 있습니다. SHG 이미징 및 이미지 후처리는 이미지화된 각 타일에서 MIP를 제공합니다.
섬유 검출에 의한 추가 후처리는 콜라겐 구조 파라미터를 추출할 수 있는 섬유 배향 히스토그램을 생성합니다. 또한, 전체 플라크 샘플에 걸쳐 국소 구조적 콜라겐 파라미터를 보여주는 컬러 맵이 시각적 분석을 위해 얻어진다. 이러한 테스트 샘플로부터, 구조적 콜라겐 파라미터의 큰 샘플 내 변동이 관찰되었다.
인장 시험 중 플라크 조직 샘플의 파열 개시 및 전파가 여기에서 입증됩니다. 디지털 이미지 상관 분석은 Green-LaGrange 변형 맵과 같은 국소 조직 변형 맵을 제공합니다. 이러한 균주 맵에서 국소 균주의 큰 샘플 내 변동이 관찰되었습니다.
카메라 녹화에서 파열 위치가 식별되면 참조 카메라 이미지 및 현미경 타일 스캔에 다시 매핑할 수 있습니다. 이것은 파열이 발생한 MPM-SHG 타일과 이 타일에서 발견된 구조 매개변수를 제공합니다. 석회화가 없고 기계적 테스트를 수행할 수 있을 만큼 충분히 큰 섬유 조직 샘플을 얻는 것은 심하게 석회화된 플라크에 대해 어려운 작업일 수 있습니다.
기계적 또는 구조적 특징이 섬유성 플라크 조직 부전의 예측 인자로 확인되면 이 특징을 측정하는 생체 내 이미징 시스템을 통해 환자의 플라크 파열 위험을 예측할 수 있습니다.
