1.6K Views
•
13:45 min
•
November 11th, 2022
DOI :
November 11th, 2022
•0:05
Introduction
0:46
Tissue Sample Preparation and Multiphoton Microscopy (MPM) Imaging
6:04
Mechanical Testing
7:55
Data Analysis
11:22
Results: Studying Heterogeneous Structural and Mechanical Atherosclerotic Plaque Properties
13:06
Conclusion
Transcript
Denne protokollen muliggjør lokale vurderinger av både kollagenarkitektur og mekaniske sviktegenskaper for fibrøst plakkvev. Siden både strukturelle og mekaniske vurderinger ble utført på samme vevsprøve, gjør denne teknikken det mulig å avdekke den funksjonelle koblingen mellom strukturelle og mekaniske vurderinger av vevet. Kunnskapen som er oppnådd med denne protokollen om fibrøs plakkvevstruktur og sviktegenskaper er nøkkelen til å forebygge og forutsi kliniske fatale hendelser utløst av aterosklerotisk plakkruptur.
For å begynne, kutt plakkene åpne langs arteriens lengdeakse ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett. Klipp ut rektangulære testprøver fra plakkprøvene, slik at prøvene er så store som mulig, samtidig som du unngår vevsområder som inneholder rifter eller forkalkninger. Deretter tar du en plakkprøve og fester begge endene til silikonet ved å feste nåler i vevet.
Sett nålene i området av prøven som skal være i klemmene på strekkprøvingsenheten under den mekaniske testingen. Ta på vernebriller. Bruk en sidekutter for å forkorte nålene slik at de stikker ut mindre enn noen få millimeter over prøveoverflaten for å forhindre at de skader mikroskopmålet.
Fyll petriskålen med PBS til prøven er nedsenket. Deretter slår du på mikroskopsystemet, vri multifotontasten og åpner mikroskopets operativsystem. Sett petriskålen som inneholder testprøven under målet og senk mikroskopmålet.
Slå på live scan-modus. Flytt målsettingen til et hjørne av prøven ved hjelp av knottene på smartpanelet, og klikk markeringsposisjonssymbolet i Flisskanning-panelet. Hvis det utføres riktig, vises et rutenett med alle valgte fliser for avbildning i oransje.
Deretter klikker du Start nederst til høyre på skjermen for å opprette en flisskanning av hele prøveoverflaten for å få en oversikt over prøvegeometrien. Etter flisskanningen observerer du X- og Y-koordinatene for øvre venstre hjørne av øvre venstre flis i Tile Scan-panelet som vises automatisk. Legg merke til disse koordinatene i et regneark.
I Tile Scan-panelet observerer du antall fliser i X- og Y-retningene i boksen ScanField. Legg merke til størrelsen på flisskanningen i regnearket. Beregn koordinatene til de andre flisene ved å legge til eller trekke fra størrelsen på flisen.
Fra flisskanningen velger du flisene som skal avbildes med en andre harmonisk generasjon, eller SHG-bildebehandling. For valget, unngå fliser i klemmene og la en flis mellom hver valgte flis i både langsgående og omkretsretning. Deretter identifiserer du plasseringen av flisene som skal avbildes, ved hjelp av de beregnede koordinatene i dette regnearket.
Fyll ut koordinatene i de angitte boksene, og klikk Enter slik at målsettingen flyttes til høyre flis. Slå på live scan-modus. Øk multifotonet, eller MP, laserkraften ved å bruke glidebryteren i det øvre panelet og strålebaneinnstillingene for å få høyest mulig lasereffekt uten betydelig bleking.
Deretter justerer du detektorforsterkningen for å få lyse bilder uten mettede piksler ved å bruke knappen på smartpanelet eller ved å klikke på navnet på detektoren og strålebaneinnstillingene og tilleggskanaler. Typiske verdier for detektorforsterkningen er mellom 500 og 800 volt. Bruk Z-posisjonsknappen på smartpanelet til å justere fokusplanet.
Deretter flytter du til toppen av prøven og angir posisjonene til toppen av Z-stakken ved å klikke på pilhodet i Z-stack-panelet under fanen Oppkjøp fra det tredje panelet. Deretter fokuserer du på prøven til SHG-signalet ikke lenger oppdages. Igjen, klikk på pilspissen i Z-stack-panelet for å angi denne posisjonen.
Når du er ferdig, slår du av live scan-modus. Under Oppkjøp-fanen i det andre panelet, hold skannehastigheten på 400 hertz, sett linjegjennomsnittet til to og oppløsningen til 512 x 512 piksler per bilde ved å bruke rullegardinlistene. Slå på den toveis X-skanneknappen.
Klikk på z-trinnstørrelse i Z-stack-panelet og fyll en z-trinnstørrelse på tre mikron i boksen. Klikk Start nederst til høyre på skjermen for å opprette en Z-stack. Når du er ferdig, lagrer du koordinatene til flisen i filnavnet eller gir hver flis nummeret sitt.
Etter avbildning blir prøven utsatt for mekanisk testing. For å generere et spackle mønster, hold airbrush fylt med vevfargestoff ca 30 centimeter unna testprøven og spray den på lumenal overflaten. Deretter, for uniaxial strekkprøving, plasser prøven i strekktesterens klemmer med prøvens omkretsretning justert med strekkretningen og lumenalsiden av prøven vendt oppover.
Forsikre deg om at den opprinnelige målerlengden er satt slik at stripens bredde-til-lengde-forhold er mindre enn én. Stram skruene på grepene ved å påføre et dreiemoment på 20 centinewton meter ved hjelp av en momentskrutrekker. Tilsett PBS i varmebadet til prøven er nedsenket.
Riv lastcellen og begynn å registrere de globale kraft- og forskyvningsmålingene fra lastcellen og aktuatoren til strekktesteren. Rett prøven ved å bruke en pre-strekk på 0,05 newton for å bli kvitt slakk i prøven. Utfør 10 sykluser med forkondisjonering, opptil 10 % belastning, basert på måling av målerlengde av aktuatoren etter påføring av pre-stretch.
Start uniaxial strekkprøving til prøven mislykkes fullstendig mens du tar opp en video av prøvedeformasjonen med høyhastighetskameraet. Etter feil, stopp registreringen av de globale kraft- og forskyvningsmålingene. Åpne Z-stakkene oppnådd under multifotonmikroskopi, eller MPM, med SHG i bilde J og opprett maksimale intensitetsprojeksjoner, eller MIPer, av hver Z-stakk.
Analyser hver MIP med det åpen kildekode MATLAB-baserte fiberorienteringsanalyseverktøyet for å måle orienteringsvinkelen til de individuelle kollagenfibrene som er tilstede i flisene. Bruk et annet MATLAB-basert verktøy, FibLab, for å tilpasse en gaussisk fordeling til vinkelfordelingshistogrammet. Fra den gaussiske fordelingsplottet trekker du ut strukturparametrene som den dominerende fibervinkelen, som er fordelingsmåten, standardavviket til fibervinkelfordelingen og den anisotrope fraksjonen.
Utfør visuell inspeksjon på kamerabildene for å identifisere rammen der bruddinitiering oppstår. Identifiser bruddstedet visuelt. Utfør den digitale bildekorrelasjonen, DIC, analyse med MATLAB-basert programvare ncorr ved hjelp av kamerabildene som er tatt opp under strekkprøven.
Merk den siste rammen før den siste strekkingen til feil som referansebilde. For de gjeldende bildene velger du ll-bilder fra starten av den siste strekkingen til den siste rammen før rammen der bruddet startet. Velg prøveoverflaten som interesseområde, eller avkastning.
Ekskluder områdene som er nær klemmene. Utfør DIC ved å sette parameterens delmengderadius til 30 piksler, delmengdeavstand til tre piksler, iterasjonsavskjæring til 50, norm for differansevektoravskjæringen til 10 i kraften til fem, belastningsradius til fem og autopropageringstrinn til fem. Fra DIC-analysen med ncorr, oppnå Green-LaGrange eller Eulerian stammefordelinger av avkastningen.
Bruk disse tøyningsfordelingene til å beregne den gjennomsnittlige Green-LaGrange-belastningen av hele plakkprøveoverflaten ved det siste bildet før brudd. Beregn Green-LaGrange-belastningen på bruddstedet. Bruk de naturlige landemerkene i testeksemplet, og lag et overlegg av referansebildet og flisskanningen for å identifisere bruddplasseringen på flisskanningen.
Identifiser MPM-SHG-flisen der bruddet skjedde. Hvis bruddet ikke er i en flis som er skannet med MPM-SHG, identifiserer du flisen nærmest bruddplasseringen. Få de strukturelle parametrene som ble funnet ved flisen der bruddet skjedde.
En fersk og intakt plakkprøve med liten eller ingen rifter og makroforkalkninger er vist her. Plakkprøver kan hentes fra områder som ikke inkluderer disse riftene og forkalkningene. SHG-avbildning og bildeetterbehandling gir MIP-er fra hver bildeflis.
Videre etterbehandling ved fiberdeteksjon gir fiberorienteringshistogrammer hvorfra kollagenstrukturelle parametere kan ekstraheres. I tillegg oppnås fargekart som viser de lokale strukturelle kollagenparametrene over hele plakkprøven for visuell analyse. Fra disse testprøvene ble det observert en stor intrasamplevariasjon i de strukturelle kollagenparametrene.
Rupturinitiering og forplantning i en plakkvevsprøve under strekkprøven er demonstrert her. Digital bildekorrelasjonsanalyse gir lokale vevsdeformasjonskart, for eksempel Green-LaGrange-stammekartene. Fra disse stammekartene ble det observert en stor intrautvalgsvariasjon i de lokale stammene.
Når bruddstedet er identifisert på kameraopptakene, kan det tilordnes tilbake til referansekamerabildet og mikroskopiflisskanningen. Dette gir MPM-SHG-flisen der bruddet skjedde, og de strukturelle parametrene som finnes på denne flisen. Innhenting av fibrøse vevsprøver som er fri for forkalkninger og er av stor nok størrelse brukbar for mekanisk testing kan være en utfordrende oppgave for tungt forkalkede plakk.
Når en mekanisk eller strukturell egenskap er identifisert som prediktor for fibrøs plakkvevssvikt, vil et in vivo bildebehandlingssystem som måler denne funksjonen tillate forutsigelse av plakkbruddrisiko hos pasienter.
Vi har utviklet en mekano-avbildningsrørledning for å studere de heterogene strukturelle og mekaniske aterosklerotiske plakkegenskapene. Denne rørledningen muliggjør korrelasjon av den lokale dominerende vinkelen og spredningen av kollagenfiberorientering, bruddoppførselen og belastningsfingeravtrykkene til det fibrøse plakkvevet.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved