1.6K Views
•
13:45 min
•
November 11th, 2022
DOI :
November 11th, 2022
•0:05
Introduction
0:46
Tissue Sample Preparation and Multiphoton Microscopy (MPM) Imaging
6:04
Mechanical Testing
7:55
Data Analysis
11:22
Results: Studying Heterogeneous Structural and Mechanical Atherosclerotic Plaque Properties
13:06
Conclusion
Transcript
Detta protokoll möjliggör lokala bedömningar av både kollagenarkitektur och mekaniska felegenskaper hos fibrös plackvävnad. Eftersom både strukturella och mekaniska bedömningar utfördes på samma vävnadsprov, möjliggör denna teknik att avslöja den funktionella länken mellan de strukturella och mekaniska bedömningarna av vävnaden. Kunskapen som erhållits med detta protokoll om fibrös plackvävnadsstruktur och sviktegenskaper är nyckeln till att förebygga och förutsäga kliniska dödliga händelser som utlöses av aterosklerotisk plackbrott.
För att börja, skär plack öppen längs artärens längdaxel med kirurgisk sax och pincett. Klipp ut rektangulära testprover från plackproverna, se till att proverna är så stora som möjligt samtidigt som du undviker vävnadsområden som innehåller tårar eller förkalkningar. Ta sedan ett placktestprov och fixera båda ändarna på silikonet genom att fästa nålar i vävnaden.
Sätt in nålarna i det område av provet som kommer att finnas i klämmorna på dragprovningsanordningen under den mekaniska provningen. Sätt på skyddsglasögon. Använd en sidoskärare för att förkorta nålarna så att de sticker ut mindre än några millimeter ovanför provytan för att förhindra att de skadar mikroskopmålet.
Fyll petriskålen med PBS tills provet är nedsänkt. Sätt sedan på mikroskopsystemet, vrid multifotonnyckeln och öppna mikroskopets operativsystem. Lägg petriskålen som innehåller testprovet under målet och sänk mikroskopmålet.
Aktivera direktsökningsläget. Flytta målsättningen till ett hörn av exemplet med hjälp av rattarna på smartpanelen och klicka på markeringspositionssymbolen på panelen Panelskanning. Om det utförs korrekt visas ett rutnät med alla valda paneler för avbildning i orange.
Klicka sedan på Start längst ned till höger på skärmen för att skapa en panelskanning av hela provytan för att få en översikt över exempelgeometrin. Efter panelsökningen observerar du X- och Y-koordinaterna i det övre vänstra hörnet av den övre vänstra panelen i panelen Panelskanning som visas automatiskt. Anteckna dessa koordinater i ett kalkylblad.
På panelen Panelskanning observerar du antalet paneler i X- och Y-riktningarna i rutan ScanField. Anteckna storleken på panelskanningen i kalkylbladet. Beräkna koordinaterna för de andra panelerna genom att lägga till eller subtrahera storleken på panelen.
Från panelskanningen väljer du de paneler som ska avbildas med en andra harmonisk generation eller SHG-avbildning. För markeringen, undvik brickor i klämmorna och lämna en kakel mellan varje vald kakel i både längsgående och omkretsriktning. Identifiera sedan platsen för panelerna som ska avbildas med hjälp av de beräknade koordinaterna i det här kalkylbladet.
Fyll i koordinaterna i de angivna rutorna och klicka på Enter så att målet flyttas till rätt panel. Aktivera direktsökningsläget. Öka multifotonen, eller MP, lasereffekten genom att använda skjutreglaget i den övre panelen och strålbaneinställningarna för att få högsta möjliga lasereffekt utan betydande blekning.
Justera sedan detektorförstärkningen för att få ljusa bilder utan mättade pixlar genom att använda ratten på smartpanelen eller genom att klicka på detektorns namn och strålvägsinställningarna och ytterligare kanaler. Typiska värden för detektorförstärkningen är mellan 500 och 800 volt. Använd Z-positionsratten på smartpanelen för att justera fokusplanet.
Gå sedan till toppen av provet och ställ in positionerna för toppen av Z-stacken genom att klicka på pilspetsen i Z-stackpanelen under fliken Förvärv från den tredje panelen. Fokusera sedan på provet tills SHG-signalen inte längre detekteras. Klicka igen på pilspetsen i Z-stackpanelen för att ställa in den här positionen.
När du är klar stänger du av direktsökningsläget. Under fliken Förvärv i den andra panelen behåller du skanningshastigheten på 400 hertz, ställer in linjegenomsnittet till två och upplösningen till 512 x 512 pixlar per bild med hjälp av listrutorna. Aktivera knappen Dubbelriktad X-skanning.
Klicka på z-stegstorlek i Z-stackpanelen och fyll i en z-stegstorlek på tre mikron i rutan. Klicka på Start längst ned till höger på skärmen för att skapa en Z-stack. När du är klar sparar du koordinaterna för panelen i filnamnet eller ger varje panel sitt nummer.
Efter avbildning utsätts provet för mekanisk testning. För att generera ett spackelmönster, håll airbrushen fylld med vävnadsfärg cirka 30 centimeter från testprovet och spraya den på lumenalytan. Därefter, för enaxlig dragprovning, placera provet i dragprovarens klämmor med provets omkretsriktning i linje med dragsträckningsriktningen och provets lumenalsida uppåt.
Se till att den ursprungliga mätarlängden är inställd så att remsans bredd-till-längd-förhållande är mindre än ett. Dra åt skruvarna på greppen genom att applicera ett vridmoment på 20 centinewton meter med en momentskruvmejsel. Tillsätt PBS i värmebadet tills provet är nedsänkt.
Riv lastcellen och börja registrera de globala kraft- och förskjutningsmätningarna från lastcellen och dragprovarens ställdon. Räta ut provet genom att applicera en försträckning på 0,05 newton för att bli av med slacken i provet. Utför 10 cykler av förkonditionering, upp till 10% töjning, baserat på manöverdonets mätning av mätlängd efter applicering av försträckning.
Starta den enaxliga dragprovningen tills provet är fullständigt fel medan du spelar in en video av provdeformationen med höghastighetskameran. Efter misslyckande stoppar du registreringen av de globala kraft- och förskjutningsmätningarna. Öppna Z-stackarna erhållna under multifotonmikroskopi, eller MPM, med SHG i bild J och skapa projektioner med maximal intensitet, eller MIP, för varje Z-stack.
Analysera varje MIP med det öppna källkodsbaserade MATLAB-baserade fiberorienteringsanalysverktyget för att mäta orienteringsvinkeln för de enskilda kollagenfibrerna som finns i plattorna. Använd ett annat MATLAB-baserat verktyg, FibLab, för att anpassa en gaussisk fördelning till vinkelfördelningshistogrammet. Från den gaussiska fördelningsplotten extraherar du de strukturella parametrarna såsom den dominerande fibervinkeln, vilket är fördelningssättet, standardavvikelsen för fibervinkelfördelningen och den anisotropa fraktionen.
Utför visuell inspektion på kamerabilderna för att identifiera ramen där brottinitiering inträffar. Identifiera bristningsplatsen visuellt. Utför den digitala bildkorrelationen, DIC, analys med MATLAB-baserad programvara ncorr med hjälp av kamerabilder som spelats in under dragprovet.
Markera den sista bildrutan före den sista sträckningen tills fel uppstår som referensbild. För de aktuella bilderna väljer du ll-bilder från början av den sista sträckningen till den sista bildrutan före den bildruta där brottets initiering inträffade. Välj exempelytan som intresseområde eller ROI.
Uteslut de områden som ligger nära klämmorna. Utför DIC genom att ange parameterns delmängdsradie till 30 pixlar, delmängdsavstånd till tre pixlar, iterationsgräns till 50, norm för differensvektorns cutoff till 10 till effekten av fem, töjningsradie till fem och autopropagationssteg till fem. Från DIC-analysen med ncorr, erhålla Green-LaGrange eller Eulerian stamfördelningar av ROI.
Använd dessa töjningsfördelningar för att beräkna den genomsnittliga Green-LaGrange-stammen för hela plackprovytan vid den sista ramen före brott. Beräkna Green-LaGrange-stammen vid bristningsplatsen. Använd de naturliga landmärkena i testexemplet och gör ett överlägg av referensbilden och panelskanningen för att identifiera bristningsplatsen på panelskanningen.
Identifiera MPM-SHG-panelen där brottet inträffade. Om brottet inte finns i en panel som skannats med MPM-SHG, identifiera panelen närmast brottets plats. Hämta de strukturella parametrarna som finns på plattan där brottet inträffade.
Ett färskt och intakt plackprov med små eller inga tårar och makroförkalkningar visas här. Plackprover kan hämtas från områden som inte inkluderar dessa tårar och förkalkningar. SHG-avbildning och efterbehandling av bilder tillhandahåller MIP från varje avbildad panel.
Ytterligare efterbehandling genom fiberdetektering ger fiberorienteringshistogram från vilka kollagenstrukturella parametrar kan extraheras. Dessutom erhålls färgkartor som visar de lokala strukturella kollagenparametrarna över hela plackprovet för visuell analys. Från dessa testprover observerades en stor intraprovvariation i de strukturella kollagenparametrarna.
Brottets initiering och utbredning i ett plackvävnadsprov under dragprovet visas här. Digital bildkorrelationsanalys ger lokala vävnadsdeformationskartor, såsom Green-LaGrange-stamkartorna. Från dessa stamkartor observerades en stor intraprovvariation i de lokala stammarna.
När brottplatsen har identifierats på kamerainspelningarna kan den mappas tillbaka till referenskamerabilden och mikroskopiplattan. Detta ger MPM-SHG-plattan där brottet inträffade och de strukturella parametrarna som finns på den här plattan. Att få fibrösa vävnadsprover som är fria från förkalkningar och är av tillräckligt stor storlek som kan användas för mekanisk testning kan vara en utmanande uppgift för kraftigt förkalkade plack.
När en mekanisk eller strukturell egenskap har identifierats som prediktor för fibrös plackvävnadssvikt, kommer ett in vivo-bildsystem som mäter denna funktion att göra det möjligt att förutsäga risken för plackbrott hos patienter.
Vi har utvecklat en pipeline för mekanoavbildning för att studera heterogena strukturella och mekaniska aterosklerotiska plackegenskaper. Denna pipeline möjliggör korrelation mellan den lokala dominerande vinkeln och dispersionen av kollagenfiberorientering, bristningsbeteendet och belastningsfingeravtrycken i den fibrösa plackvävnaden.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved