Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

We bedanken Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) en het Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) aan de Nanyang Technological University (NTU) voor het ondersteunen van nanostructuurfabricage en SEM-beeldvorming, het Protein Production Platform (PPP) aan de School of Biological Sciences NTU voor eiwitzuivering en de School of Chemical and Biomedical Engineering NTU voor de confocale microscoop. Dit werk wordt gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs van Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 en MOE-T2EP30220-0009), het Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS), ondersteund door MOE-financiering in het kader van het Research Centres of Excellence-programma (W. Zhao), de Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), de NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU voor de onderzoeksbeurs (X. Miao) en China Scholarship Council voor de onderzoeksbeurs (J. Wu).

1. Reiniging van nanochips
<ol><li>Plaats de nanochip in een bekerglas van 10 ml met de patroonzijde naar boven gericht. OPMERKING: Deze kwarts nanochip is vervaardigd via elektronenbundellithografie zoals beschreven vóór21. De geometrie en rangschikking van de nanostructuur op de chip kan op maat worden ontworpen. De maten van de gradiënt nanobars die hier worden gebruikt, zijn 2000 nm lang, 600 nm hoog en 100 tot 1000 nm breed (100 nm stappenset).</li>
	<li>Voeg...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Het hier beschreven nanobar-SLB-systeem biedt een unieke combinatie van de voordelen in verschillende bestaande in vitro assays. Het onthult efficiënt de preferentiële binding van eiwitten aan sterk gebogen membranen als de liposoom floatatie- of sedimentatietest, maar vereist veel minder monsters en biedt nauwkeuriger gedefinieerde kromming op individuele nanobaren 8,29. Het biedt ook een breed scala aan nauwkeurig gecontroleerde krommingen voor gelij...

Membraankromming is een kritische fysieke parameter van een cel die voorkomt in een verscheidenheid aan cellulaire processen zoals morfogenese, celdeling en celmigratie1. Het wordt nu algemeen erkend dat membraankromming verder gaat dan een eenvoudig resultaat van cellulaire gebeurtenissen; in plaats daarvan is het naar voren gekomen als een effectieve regulator van eiwitinteracties en intracellulaire signalering. Verschillende eiwitten die betrokken zijn bij clathrin-gemedieerde endocytose bleken bijvoorbeeld bij voorkeur te binden aan het gebogen membraan, wat resulteerde in de vorming van een hotspot voor endocytose2. Er zijn veel verschillende oorzaken van membraanvervorming, zoals membraantrekking door de cytoskeletale krachten, de aanwezigheid van lipide-asymmetrie met hoofdgroepen van verschillende grootte, het bestaan van transmembraaneiwitten met conische vorm, de accumulatie van membraanvormende eiwitten zoals BAR-domeineiwitten (genoemd naar Bin-, amfifysine- en Rvs-eiwitten) en het inbrengen van amfipathische helicesdomein in het membraan1 . Interessant is dat deze eiwitten en lipiden niet alleen het membraan vervormen, maar ook de membraankromming kunnen voelen en preferentiële accumulatie vertonen1. Daarom is het cruciaal om te bestuderen of en hoe membranen met verschillende krommingen de distributie en dynamiek van eiwitten en lipiden die eraan vastzitten en de mogelijke effecten op de gerelateerde intracellulaire processen veranderen.
Er zijn veel technieken ontwikkeld om de interactie tussen gebogen membraan en eiwitten in zowel levende cel- als in vitrosystemen te analyseren. Het levende celsysteem biedt een echte celomgeving met een rijke lipidendiversiteit en dynamische eiwitsignaleringsregulatie 2,3,4,5,6,7. Een dergelijk geavanceerd systeem is echter moeilijk te bestuderen vanwege de onzekerheden en fluctuaties in de intracellulaire omgeving. Vandaar dat de in vitro assays met behulp van een kunstmatig membraan dat bestaat uit bekende lipidesoorten en gezuiverde eiwitten krachtige reconstitutiesystemen zijn geworden om de relatie tussen eiwitten en gebogen membranen te karakteriseren. Traditioneel worden liposomen van verschillende diameters gegenereerd door extrusie om krommingsgevoelige eiwitten te detecteren via een co-sedimentatietest met centrifugale kracht of een co-flotatietest met een dichtheidsgradiënt om eiwitaggregatie te voorkomen 8,9. De kromming van de geëxtrudeerde liposomen wordt echter beperkt door de beschikbare poriegrootte van het membraanfilter dat in de extruderwordt gebruikt 10. Het is bewezen dat single liposome curvature (SLiC) assay deze beperking overwint, waarbij liposomen met verschillende diameters fluorescentie-gelabeld en geïmmobiliseerd op het oppervlak worden geïmmobiliseerd, zodat de kromming kan worden gemarkeerd door de fluorescerende intensiteit11. Er is echter een sterke variabiliteit in lipidesamenstelling waargenomen bij kleine blaasjes, wat de nauwkeurigheid van de krommingsmeting beïnvloedt12. Tether-pulling experimenten bieden een nauwkeurigere meting van de kromming op de transiënte tether getrokken uit gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) met behulp van een optisch pincet, waarbij de kromming goed kan worden geregeld door degegenereerde membraanspanning 13,14. Deze methode is geschikt om positieve of negatieve krommingsgevoelige eiwitten te bestuderen, maar wordt beperkt door de doorvoer van buisgeneratie10. Ondersteunde membraanbuizen (SMrT) assay biedt gelijktijdige generatie van meerdere membraanbuizen die door microfluïdische stromen uit hetzelfde lipidereservoir worden geëxtrudeerd. Niettemin varieert de membraankromming intrinsiek langs de nanobuis, wat de nauwkeurigheid van op fluorescentie-intensiteit gebaseerde krommingsmeting15,16 in gevaar brengt. Ter vergelijking: het gebruik van kleine unilamellaire blaasjes (SUV's, diameter <100 nm17) om een ondersteunde lipide bilayer (SLB) te vormen op oppervlakken met ontworpen topografieën genereerde een enkel dubbellaags membraan met krommingen vooraf bepaald door nanofabricage of nanomaterialen met hoge nauwkeurigheid 18,19,20.
Hier presenteren we een protocol voor de vorming van de SLB op gefabriceerde nanochipoppervlakken met nanobar arrays en hoe het kan worden gebruikt om de krommingsgevoeligheid van eiwitten in vitro te onderzoeken. Zoals te zien is in figuur 1, zijn er zes essentiële componenten van de test: A) Reiniging en assemblage van de chip met een microfluïdische kamer; B) Bereiding van SUV's met een gedefinieerde lipidesamenstelling; C) Vorming van de SLB op een nanochip en binding met krommingsgevoelige eiwitten; D) Beeldvorming en karakterisering van de SLB en krommingsgevoelige eiwitten onder fluorescentiemicroscopie; E) Het reinigen van de chip voor hergebruik; F) Beeldverwerking voor kwantitatieve analyse van het detectievermogen van eiwitkrommingen. Het gedetailleerde protocol wordt hieronder stap voor stap beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

Membraankromming speelt een belangrijke rol in verschillende essentiële processen van cellen, zoals celmigratie, celdeling en vesikelhandel. Het wordt niet alleen passief gegenereerd door cellulaire activiteiten, maar reguleert ook actief eiwitinteracties en is betrokken bij veel intracellulaire signalering. Het is dus van grote waarde om de rol van membraankromming bij het reguleren van de distributie en dynamiek van eiwitten en lipiden te onderzoeken. Onlangs zijn er veel technieken ontwikkeld om de relatie tussen het gebogen membraan en eiwit in vitro te bestuderen. In vergelijking met traditionele technieken biedt de nieuw ontwikkelde nanobar-supported lipid bilayer (SLB) zowel een hoge doorvoer als een betere nauwkeurigheid bij het genereren van membraankrommingen door een continue lipide bilayer te vormen op patroonarrays van nanobaren met een vooraf gedefinieerde membraankromming en lokale vlakke controle. Zowel de lipidefluïditeit als de eiwitgevoeligheid voor gebogen membranen kunnen kwantitatief worden gekarakteriseerd met behulp van fluorescentiemicroscopiebeeldvorming. Hier wordt een gedetailleerde procedure geïntroduceerd voor het vormen van een SLB op gefabriceerde glazen oppervlakken met nanobar arrays en de karakterisering van krommingsgevoelige eiwitten op dergelijke SLB. Daarnaast komen protocollen voor hergebruik van nanochips en beeldverwerking aan bod. Naast de nanobar-SLB is dit protocol gemakkelijk toepasbaar op alle soorten nanogestructureerde glaschips voor krommingsdetectiestudies.

Nanobar-ontwerp wordt aanbevolen voor het onderzoeken van positieve krommingsgevoelige eiwitten, die aan elk uiteinde een halve cirkel bevatten met kromming gedefinieerd door de nanobarbreedte en één vlakke / nulkrommingsregeling lokaal in het midden (figuur 2A, B). Succesvolle vorming van de SLB op nanobars resulteert in gelijkmatig verdeelde lipidemarkersignalen over het gehele nanobaroppervlak, zoals weergegeven in figuur 2C. Signalen van m...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Hier wordt een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem ontwikkeld om een synthetisch membraan te bieden met een gedefinieerde kromming die de karakterisering van eiwitten met krommingsdetectievermogen in vitro mogelijk maakt.

Een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem voor de studie van membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Dit nanobar-ondersteunde lipide bilayer-systeem kan worden gebruikt om de rol van membraankromming te bestuderen bij het reguleren van de dynamiek en distributie van eiwitten en lipiden tijdens celactiviteiten. Deze techniek biedt zowel hoge subwortel als slechte in de membraankrommingsgeneratie door een continue lipide bilayer te vormen op patent nanobarfouten met membraankromming vooraf gedefinieerd door nanofabricage met hoge resolutie. Plaats om te beginnen de nanochip in een bekerglas van 10 milliliter met de patroonzijde naar boven gericht.Voeg voorzichtig een milliliter 98% zwavelzuur toe aan het bekerglas en zorg ervoor dat het zuur de voor- en achterkant van de chip volledig bedekt. Draai het bekerglas langzaam rond en voeg druppel voor druppel 200 microliter 30% waterstofperoxide toe totdat het hele bekerglas heet wordt. Zorg ervoor dat zwavelzuur en waterstofperoxide goed worden gemengd om Piranha-oplossing te vormen voor het verwijderen van organische moleculen uit de nanochip.Plaats het bekerglas in een secundaire glazen container en houd de nanochip 's nachts ondergedompeld in de Piranha-oplossing om de onzuiverheden grondig te reinigen. Haal het bekerglas eruit en pipetteer de Piranha-oplossing voorzichtig in een zuurafvalcontainer. Laad vijf milliliter gedeïoniseerd water in het bekerglas om het restzuur te verdunnen en weg te gooien in het zure afval.Herhaal deze stap vijf keer. Pak de chip met een pincet en was met een continue stroom gedeïoniseerd water om restzuur grondig te verwijderen. Föhn de chip met 99,9% stikstofgas voor SLB-vorming.Soniceer het lipidenmengsel gedurende 30 minuten. Vries het lipidenmengsel gedurende 20 seconden in vloeibare stikstof in en ontdooi vervolgens bij 42 graden Celsius gedurende twee minuten in een waterbad. Herhaal de vries-/dooicycli 30 keer.Daarna ziet het lipidenmengsel eruit als een heldere vloeistof. Laat het lipidenmengsel door de mini-extruder lopen en extrudeer 20 keer heen en weer. Verzamel de SUV's van de spuit aan de andere kant om de verontreiniging met grotere deeltjes of vreemd materiaal te verminderen en breng deze over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.Haal de gereinigde nanochip voorzichtig uit gedeïoniseerd water met een pincet en föhn droog met 99,9% stikstofgas. Voer oppervlaktereiniging van de nanochip uit met luchtplasmabehandeling gedurende één uur. Monteer de nanochip in een PDMS-kamer.Begin met het plaatsen van de chip op een schoon oppervlak met het patroon naar boven gericht. Bedek het middelste PDMS voorzichtig met de chip en zorg ervoor dat het hele patroon wordt blootgesteld aan het centrale deel van de grote ovaalvormige opening in het middelste PDMS. Bedek het bovenste PDMS met het middelste PDMS en houd de twee kleine gaten binnen het gebied van het grote ovale gat van het middelste PDMS.Vervolgens wordt de PDMS-kamer geassembleerd. Laad de SUV's in het PDMS-kanaal vanuit een van de twee kleine gaatjes in het bovenste PDMS met een pipet en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de SLB te vormen. Pipetteer de PBS-buffer voorzichtig in het PDMS-kanaal vanaf de ene kant van het kleine gat en verwijder het afval met een wattenstaafje uit het andere gat om de ongebonden SUV's weg te spoelen.Verkrijg vervolgens de SLB gevormd op de nanochip. Stel de laserscan confocale microscopie in met behulp van een 100 x olie objectief. Open de Zen-software om de excitatielaserkracht te selecteren die de fluorescentie van het lipide en eiwit kan prikkelen.Kies Acquisitiemodus. Klik vervolgens op Smart Setup, gevolgd door Texas Red. Pas de scherpstelling aan met de focusknop om de nanostaven op de chip te lokaliseren totdat de randen van de nanobalk scherp zijn onder het lipidekanaal.Stel de scanparameters in om een controlebeeld van het lipidenkanaal te verkrijgen voordat u eiwit toevoegt. Voer de FRAP-test uit door te bleken met fluorescerend gelabelde lipide bilayer op een willekeurig enkel nanobargebied. Schakel de selectievakjes Experimentgebieden en Bleken in.Teken een cirkelvormig gebied met een diameter van vijf micrometer dat de hele nanobalk in het midden kan omvatten en voeg toe aan de experimentgebieden. Voer TimeLapse-beeldparameters in. Kies Tijdreeks.Klik vervolgens op Duur. Selecteer 100 cycli en interval gelijk aan twee seconden. Voer bleekparameters in.Schakel de laser selectievakjes in die FRAP uitvoeren en wijzig het vermogen in 100% Klik op Experiment starten voor het FRAP-experiment. Laad de eiwitoplossing in het PDMS-kanaal en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de binding van het eiwit op de SLB mogelijk te maken. Heroriënteer de nanobaren en stel de scanparameters in om beelden te maken van zowel lipide- als eiwitkanalen voor detectie van eiwitkromming.Selecteer Experimentregio's en voer de FRAP-test uit op zowel lipide- als eiwitkanalen en voer TimeLapse-beeldvorming uit om de mobiliteit van krommingsgevoelige eiwitten te karakteriseren. Beide tonen een verhoogde accumulatie aan het einde van SLB-gecoate individuele nanobars met een breedte van 300 nanometer. Hier bevat de SLB 10%PS om de eiwitbinding elektrostatisch te verbeteren.Beide eiwitten hebben een hogere end-to-center ratio dan lipiden, die ongeveer één is. Bij het vergelijken van de IDR FBP17 en F-Bar duidt de hogere eind-tot-middenverhouding van IDR FBP17 op een sterkere krommingsdetectie dan F-Bar. Alle drie de eiwitten vertoonden preferentiële accumulatie op de nanobar end curved membrane sites wanneer de kromming afnam tot onder de 400 nanometer in diameter.Van deze drie eiwitdomeinen geeft IDR FBP17 de hoogste nanostaaf en -dichtheid, wat wijst op het sterkste detectievermogen van krommingen, terwijl F-Bar de laagste waarde laat zien. Eiwitbindingscurve kan worden uitgezet door de eiwitconcentratie geleidelijk te verhogen, wat aantoont dat IDR FBP17 een sterk coöperatief krommingsdetectievermogen heeft. Vergeleken met het snelle herstel van lipidesignalen op nanobaren, kan de F-Bar niet binnen twee minuten herstellen, wat wijst op de aanzienlijk verminderde membraanmobiliteit en associatiedynamiek op de gebogen membraanlocaties.Verrassend genoeg vertoonden IDR FBP17-signalen, anders dan het gedrag van F-Bar, duidelijk herstel binnen hetzelfde tijdsbestek, wat wijst op de dynamische aard van IDR FBP17 geaccumuleerd op de gebogen membranen. Na het wegspoelen van de ongebonden IDR FBP17 in de oplossing, kon hetzelfde herstel in het IDR FBP17-kanaal echter niet worden waargenomen als voorheen. De SLB-kwaliteit is erg belangrijk bij het bestuderen van de interactie tussen gebogen membraan en eiwit.Dus de FRAP-test is nodig in ons experiment om de membraanmobiliteit te valideren. Dit systeem zal de onderzoekers helpen om verschillende parameters te bestuderen die van invloed zijn op de eiwitinteractie met het gebogen membraan, zoals de krommingsgevoelige domeinen en de lipidesamenstelling, en om de dynamische studies uit te voeren op gebogen membraan zoals gezichtsscheidingsgedrag.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, een in één stap incorporatie van membraan eiwitten in Biotinylated Peptidiscs voor gestroomlijnde eiwit binding assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...