Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
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Wir danken dem Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) und dem Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) an der Nanyang Technological University (NTU) für die Unterstützung der Nanostrukturherstellung und der REM-Bildgebung, der Protein Production Platform (PPP) an der School of Biological Sciences NTU für die Proteinreinigung und der School of Chemical and Biomedical Engineering NTU für das konfokale Mikroskop. Diese Arbeit wird finanziert durch das singapurische Bildungsministerium (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 und MOE-T2EP30220-0009), das Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS), unterstützt durch MOE-Mittel im Rahmen des Research Centres of Excellence-Programms (W. Zhao), die Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), den NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU für das Forschungsstipendium (X. Miao) und China Scholarship Council für das Forschungsstipendium (J. Wu).

1. Reinigung des Nanochips
<ol><li>Legen Sie den Nanochip mit der gemusterten Seite nach oben in ein 10-ml-Becherglas. HINWEIS: Dieser Quarz-Nanochip wurde mittels Elektronenstrahllithographie hergestellt, wie zuvorbeschrieben 21. Die Geometrie und Anordnung der Nanostruktur auf dem Chip kann kundenspezifisch gestaltet werden. Die Größen der hier verwendeten Gradienten-Nanobarren betragen 2000 nm Länge, 600 nm Höhe und 100 bis 1000 nm Breite (100 nm Step-Set).</l...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
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	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
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	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
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	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
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	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Das hier beschriebene Nanobar-SLB-System bietet eine einzigartige Kombination der Vorteile in mehreren bestehenden in vitro Assays. Es zeigt effizient die bevorzugte Bindung von Proteinen an stark gekrümmte Membranen als Liposomenfloatations- oder Sedimentationsassay, benötigt jedoch viel weniger Proben und bietet eine genauer definierte Krümmung auf einzelnen Nanobars 8,29. Es bietet auch eine breite Palette von präzise kontrollierten Krümmungen f?...

Die Membrankrümmung ist ein kritischer physikalischer Parameter einer Zelle, der bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Morphogenese, Zellteilung und Zellmigration auftritt1. Es ist heute allgemein anerkannt, dass die Membrankrümmung über ein einfaches Ergebnis zellulärer Ereignisse hinausgeht; Stattdessen hat es sich als wirksamer Regulator von Proteininteraktionen und intrazellulären Signalen herausgestellt. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass mehrere Proteine, die an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sind, bevorzugt an die gekrümmte Membran binden, was zur Bildung eines Hotspots für Endozytose2 führt. Es gibt viele verschiedene Ursachen für die Membranverformung wie das Ziehen der Membran durch die Zytoskelettkräfte, das Vorhandensein von Lipidasymmetrie mit unterschiedlich großen Kopfgruppen, das Vorhandensein von Transmembranproteinen mit konischer Form, die Akkumulation von membranformenden Proteinen wie BAR-Domänenproteinen (benannt nach Bin-, Amphiphysin- und Rvs-Proteinen) und das Einfügen amphipathischer Helices-Domäne in die Membran1 . Interessanterweise verformen diese Proteine und Lipide nicht nur die Membran, sondern können auch die Membrankrümmung wahrnehmen und eine bevorzugte Akkumulation aufweisen1. Daher ist es entscheidend zu untersuchen, ob und wie Membranen mit unterschiedlichen Krümmungen die Verteilung und Dynamik der an sie gebundenen Proteine und Lipide verändern und welche Auswirkungen dies auf die damit verbundenen intrazellulären Prozesse haben kann.
Viele Techniken wurden entwickelt, um die Interaktion zwischen gekrümmter Membran und Proteinen sowohl in lebenden Zell- als auch in In-vitro-Systemen zu analysieren. Das Lebendzellsystem bietet eine reale Zellumgebung mit reicher Lipiddiversität und dynamischer Proteinsignalregulation 2,3,4,5,6,7. Ein solch ausgeklügeltes System ist jedoch aufgrund der Unsicherheiten und Schwankungen in der intrazellulären Umgebung schwer zu untersuchen. Daher sind die In-vitro-Assays mit einer künstlichen Membran, die aus bekannten Lipidspezies und gereinigten Proteinen besteht, zu leistungsfähigen Rekonstitutionssystemen geworden, um die Beziehung zwischen Proteinen und gekrümmten Membranen zu charakterisieren. Herkömmlicherweise werden Liposomen unterschiedlicher Durchmesser durch Extrusion erzeugt, um krümmungsempfindliche Proteine entweder über einen Co-Sedimentationsassay mit Zentrifugalkraft oder einen Coflotationsassay mit einem Dichtegradienten zu detektieren, um eine Proteinaggregation zu vermeiden 8,9. Die Krümmung der extrudierten Liposomen ist jedoch durch die verfügbare Porengröße des im Extruder10 verwendeten Membranfilters begrenzt. Es wurde nachgewiesen, dass der Single Liposome Curvature (SLiC) Assay diese Einschränkung überwindet, bei der Liposomen mit unterschiedlichen Durchmessern fluoreszenzmarkiert und auf der Oberfläche immobilisiert werden, so dass die Krümmung durch die Fluoreszenzintensität markiert werden kann11. Es wurde jedoch eine starke Variabilität der Lipidzusammensetzung in kleinen Vesikeln beobachtet, was die Genauigkeit der Krümmungsmessung beeinflusst12. Tether-Pulling-Experimente liefern eine genauere Messung der Krümmung des transienten Seils, das von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) gezogen wird, mit einer optischen Pinzette, bei der die Krümmung durch die erzeugte Membranspannung gut gesteuert werden kann13,14. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung von Proteinen mit positiver oder negativer Krümmung, ist jedoch durch den Durchsatz der Röhrchenerzeugung10 eingeschränkt. Der SMrT-Assay (Supported Membrane Tubes) ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung mehrerer Membranröhren, die durch mikrofluidische Strömungen aus demselben Lipidreservoir extrudiert werden. Dennoch variiert die Membrankrümmung intrinsisch entlang der Nanoröhre, was die Genauigkeit der fluoreszenzintensitätsbasierten Krümmungsmessungbeeinträchtigt 15,16. Im Vergleich dazu erzeugte die Verwendung kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs, Durchmesser <100 nm17) zur Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) auf Oberflächen, die entworfene Topographien enthielten, eine einzelne Doppelschichtmembran mit Krümmungen, die durch Nanofabrikation oder Nanomaterialien in hoher Genauigkeit vorbestimmtwaren 18,19,20.
Hier stellen wir ein Protokoll für die Bildung des SLB auf hergestellten Nanochip-Oberflächen mit Nanobar-Arrays vor und wie damit die Krümmungsempfindlichkeit von Proteinen in vitro untersucht werden kann. Wie in Abbildung 1 gezeigt, gibt es sechs wesentliche Komponenten des Assays: A) Reinigung und Montage des Chips mit einer mikrofluidischen Kammer; B) Herstellung von SUVs mit definierter Lipidzusammensetzung; C) Bildung des SLB auf einem Nanochip und Bindung an krümmungsempfindliche Proteine; D) Bildgebung und Charakterisierung der SLB- und krümmungsempfindlichen Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie; E) Reinigung des Chips zur Wiederverwendung; F) Bildverarbeitung zur quantitativen Analyse der Proteinkrümmungsfähigkeit. Das detaillierte Protokoll wird im Folgenden Schritt für Schritt beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

Die Membrankrümmung spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen essentiellen Prozessen von Zellen, wie Zellmigration, Zellteilung und Vesikeltransport. Es wird nicht nur passiv durch zelluläre Aktivitäten erzeugt, sondern reguliert auch aktiv Proteininteraktionen und ist an vielen intrazellulären Signalen beteiligt. Daher ist es von großem Wert, die Rolle der Membrankrümmung bei der Regulierung der Verteilung und Dynamik von Proteinen und Lipiden zu untersuchen. In jüngster Zeit wurden viele Techniken entwickelt, um die Beziehung zwischen der gekrümmten Membran und dem Protein in vitro zu untersuchen. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken bietet die neu entwickelte nanobar-gestützte Lipiddoppelschicht (SLB) sowohl einen hohen Durchsatz als auch eine bessere Genauigkeit bei der Erzeugung von Membrankrümmungen, indem sie eine kontinuierliche Lipiddoppelschicht auf strukturierten Arrays von Nanobarren mit einer vordefinierten Membrankrümmung und lokaler flacher Kontrolle bildet. Sowohl die Lipidfluidität als auch die Proteinempfindlichkeit gegenüber gekrümmten Membranen können mittels fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung quantitativ charakterisiert werden. Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Bildung eines SLB auf hergestellten Glasoberflächen mit Nanobar-Arrays und zur Charakterisierung krümmungsempfindlicher Proteine auf solchen SLB vorgestellt. Darüber hinaus werden Protokolle für die Wiederverwendung von Nanochips und die Bildverarbeitung behandelt. Über den Nanobar-SLB hinaus ist dieses Protokoll leicht auf alle Arten von nanostrukturierten Glaschips für Krümmungsstudien anwendbar.

Das Nanobar-Design wird für die Untersuchung positiver Krümmungssensorproteine empfohlen, die an jedem Ende einen Halbkreis mit einer Krümmung enthalten, die durch die Nanobarbreite definiert ist, und eine flache / Nullkrümmungskontrolle lokal in der Mitte (Abbildung 2A, B). Die erfolgreiche Bildung des SLB auf Nanobarren führt zu gleichmäßig verteilten Lipidmarkersignalen über die gesamte Nanobar-Oberfläche, wie in Abbildung 2C gezeigt...

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A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Hier wird ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem entwickelt, um eine synthetische Membran mit einer definierten Krümmung bereitzustellen, die die Charakterisierung von Proteinen mit Krümmungssensorik in vitro ermöglicht.

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Dieses nanobar-gestützte Lipiddoppelschichtsystem kann verwendet werden, um die Rolle der Membrankrümmung bei der Regulierung der Dynamik und Verteilung von Proteinen und Lipiden während der Zellaktivitäten zu untersuchen. Diese Technik bietet sowohl eine hohe Subwurzel als auch eine schlechte Membrankrümmung durch Bildung einer kontinuierlichen Lipiddoppelschicht auf offensichtlichen Nanobarfehlern mit Membrankrümmung, die durch hochauflösende Nanofabrikation vordefiniert ist. Legen Sie den Nanochip zunächst mit der Musterseite nach oben in ein 10-Milliliter-Becherglas.Geben Sie vorsichtig einen Milliliter 98% Schwefelsäure in das Becherglas und stellen Sie sicher, dass die Säure die Vorder- und Rückseite des Chips vollständig bedeckt. Drehen Sie das Becherglas langsam und fügen Sie 200 Mikroliter 30% Wasserstoffperoxid Tropfen für Tropfen hinzu, bis das ganze Becherglas heiß wird. Stellen Sie sicher, dass Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid gut gemischt sind, um Piranha-Lösung zur Entfernung organischer Moleküle aus dem Nanochip zu bilden.Stellen Sie das Becherglas in einen sekundären Glasbehälter und lassen Sie den Nanochip über Nacht in die Piranha-Lösung eintauchen, um die Verunreinigungen gründlich zu reinigen. Nehmen Sie das Becherglas heraus und pipetten Sie die Piranha-Lösung vorsichtig in einen sauren Abfallbehälter. Laden Sie fünf Milliliter entionisiertes Wasser in das Becherglas, um die Restsäure zu verdünnen und in den sauren Abfall zu werfen.Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal. Nehmen Sie den Chip mit einer Pinzette und waschen Sie ihn mit einem kontinuierlichen Strom von entionisiertem Wasser, um Restsäure gründlich zu entfernen. Föhnen Sie den Chip mit 99,9% Stickstoffgas für die SLB-Bildung.Die Lipidmischung für 30 Minuten beschallen. Das Lipidgemisch in flüssigem Stickstoff für 20 Sekunden einfrieren und dann bei 42 Grad Celsius für zwei Minuten in einem Wasserbad auftauen. Wiederholen Sie die Gefrier-/Auftauzyklen 30 Mal.Danach sieht die Lipidmischung wie eine klare Flüssigkeit aus. Die Lipidmischung durch den Mini-Extruder leiten und 20 Mal hin und her extrudieren. Sammeln Sie die SUVs von der Spritze auf der anderen Seite, um die Kontamination mit größeren Partikeln oder Fremdmaterial zu reduzieren, und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Nehmen Sie den gereinigten Nanochip vorsichtig mit einer Pinzette aus entionisiertem Wasser heraus und föhnen Sie ihn mit 99,9% Stickstoffgas trocken. Führen Sie die Oberflächenreinigung des Nanochips mit Luftplasmabehandlung für eine Stunde durch. Montieren Sie den Nanochip in einer PDMS-Kammer.Beginnen Sie damit, den Chip mit dem Muster nach oben auf eine saubere Oberfläche zu legen. Decken Sie das mittlere PDMS vorsichtig mit dem Chip ab und stellen Sie sicher, dass das gesamte Muster dem zentralen Bereich der großen ovalen Öffnung im mittleren PDMS ausgesetzt ist. Decken Sie das obere PDMS mit dem mittleren PDMS ab und halten Sie seine beiden kleinen Löcher im Bereich des großen ovalen Lochs des mittleren PDMS.Dann wird die PDMS-Kammer zusammengebaut. Laden Sie die SUVs aus einem der beiden kleinen Löcher im oberen PDMS mit einer Pipette in den PDMS-Kanal und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur, um den SLB zu bilden. Pipettieren Sie den PBS-Puffer vorsichtig von einer Seite des kleinen Lochs in den PDMS-Kanal und entfernen Sie den Abfall mit einem Wattestäbchen aus dem anderen Loch, um die ungebundenen SUVs wegzuwaschen.Dann erfassen Sie das SLB, das auf dem Nanochip gebildet wird. Richten Sie die konfokale Laserscanning-Mikroskopie mit einem 100-fach-Ölobjektiv ein. Öffnen Sie die Zen-Software, um die Anregungslaserleistung auszuwählen, die die Fluoreszenz des Lipids und des Proteins anregen kann.Wählen Sie Erfassungsmodus. Klicken Sie dann auf Smart Setup, gefolgt von Texas Red. Stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein, um die Nanobalken auf dem Chip zu lokalisieren, bis die Nanobalkenkanten unter dem Lipidkanal scharf sind.Stellen Sie die Scanparameter ein, um ein Kontrollbild des Lipidkanals zu erhalten, bevor Sie Protein hinzufügen. Führen Sie den FRAP-Assay durch, indem Sie mit fluoreszierend markierter Lipiddoppelschicht auf einem zufälligen einzelnen Nanobarbereich bleichen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Experimentbereiche und Bleichen.Zeichnen Sie eine kreisförmige Fläche von fünf Mikrometern Durchmesser, die den gesamten Nanobalken in der Mitte umfassen kann, und fügen Sie den Experimentregionen hinzu. Geben Sie TimeLapse-Bildgebungsparameter ein. Wählen Sie Zeitreihe aus.Klicken Sie dann auf Dauer. Wählen Sie 100 Zyklen und ein Intervall gleich zwei Sekunden. Eingabe von Bleichparametern.Aktivieren Sie die Laserkontrollkästchen, die FRAP ausführen, und ändern Sie die Leistung auf 100%Klicken Sie auf Test starten für das FRAP-Experiment. Laden Sie die Proteinlösung in den PDMS-Kanal und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Bindung des Proteins an das SLB zu ermöglichen. Fokussieren Sie die Nanobalken neu und stellen Sie die Scanparameter ein, um Bilder von Lipid- und Proteinkanälen für die Erkennung von Proteinkrümmungen aufzunehmen.Wählen Sie Experimentregionen aus und führen Sie den FRAP-Assay sowohl auf Lipid- als auch auf Proteinkanälen durch und führen Sie TimeLapse-Bildgebung durch, um die Mobilität des Krümmungssensorproteins zu charakterisieren. Beide zeigen eine erhöhte Akkumulation am Ende von SLB-beschichteten einzelnen Nanobarren mit 300 Nanometern Breite. Hier enthält der SLB 10%PS, um die Proteinbindung elektrostatisch zu verstärken.Beide Proteine haben ein höheres End-zu-Mitte-Verhältnis als Lipide, was etwa eins ist. Beim Vergleich von IDR FBP17 und F-Bar deutet das höhere End-zu-Mitte-Verhältnis von IDR FBP17 auf eine stärkere Krümmungserfassung als F-Bar hin. Alle drei Proteine zeigten eine bevorzugte Akkumulation an den gekrümmten Membranstellen des Nanobarendes, wenn die Krümmung unter 400 Nanometer im Durchmesser abnahm.Unter diesen drei Proteindomänen liefert IDR FBP17 den höchsten Nano-Balken und die höchste Dichte, was auf seine stärkste Krümmungserfassungsfähigkeit hinweist, während F-Bar den niedrigsten Wert aufweist. Die Proteinbindungskurve kann durch allmähliche Erhöhung der Proteinkonzentration aufgezeichnet werden, was zeigt, dass IDR FBP17 eine starke kooperative Krümmungserfassungsfähigkeit aufweist. Im Vergleich zur schnellen Wiederherstellung von Lipidsignalen auf Nanobarren kann sich der F-Bar nicht innerhalb von zwei Minuten erholen, was auf eine signifikant verminderte Membranmobilität und Assoziationsdynamik an den gekrümmten Membranstellen hindeutet.Überraschenderweise zeigten IDR FBP17-Signale, die sich vom Verhalten von F-Bar unterschieden, eine offensichtliche Erholung innerhalb desselben Zeitrahmens, was auf die dynamische Natur von IDR FBP17 hinweist, das sich an den gekrümmten Membranen angesammelt hat. Nach dem Wegspülen des ungebundenen IDR FBP17 in der Lösung konnte jedoch nicht die gleiche Erholung im IDR FBP17-Kanal beobachtet werden wie zuvor. Die SLB-Qualität ist sehr wichtig, wenn die Wechselwirkung zwischen gekrümmter Membran und Protein untersucht wird.Daher ist der FRAP-Test in unserem Experiment notwendig, um die Membranbeweglichkeit zu validieren. Dieses System wird den Forschern helfen, verschiedene Parameter zu untersuchen, die die Proteininteraktion mit der gekrümmten Membran beeinflussen, wie die Krümmungssensordomänen und die Lipidzusammensetzung, sowie die dynamischen Studien an gekrümmten Membranen wie das Verhalten der Gesichtstrennung durchzuführen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, ein Ein-Schritt-Einbindung von Membranproteinen in biotinylierte Peptidiscs für optimierte Proteinbindungstests

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...