Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

אנו מודים למרכז ננו-פבריקציה של נאניאנג (N2FC) ולמרכז לטכנולוגיות פוטוניות משבשות (CDPT) באוניברסיטה הטכנולוגית של נאניאנג (NTU) על התמיכה בייצור ננו-מבנים והדמיית SEM, לפלטפורמת ייצור החלבונים (PPP) בבית הספר למדעי הביולוגיה NTU לטיהור חלבונים, ולבית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU למיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו ממומנת על ידי משרד החינוך של סינגפור (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21, ו- MOE-T2EP30220-0009), המכון לניתוח מולקולרי דיגיטלי ומדע (IDMxS) הנתמך על ידי מימון MOE במסגרת תוכנית מרכזי המחקר למצוינות (W. Zhao), קרן תוכנית המדע של הגבול האנושי (W. Zhao, RGY0088/2021), מענק הסטארט-אפ של NTU (W. Zhao), בית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU עבור מלגת המחקר (X. Miao), ומועצת המלגות של סין עבור מלגת המחקר (J. Wu).

1. ניקוי של ננו-שבב
<ol><li>הניחו את הננו-שבב בכוס של 10 מ"ל כשהצד המעוצב פונה כלפי מעלה. הערה: ננו-שבב קוורץ זה יוצר באמצעות ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים כפי שתואר לפני21. הגיאומטריה והסידור של הננו-מבנה על השבב ניתנים לתכנון מותאם אישית. הגדלים של הננו-ברים ההדרגתיים ה...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

מערכת nanobar-SLB המתוארת כאן מציעה שילוב ייחודי של היתרונות במספר בדיקות קיימות במבחנה. הוא חושף ביעילות את הקשירה המועדפת של חלבונים לממברנות מעוקלות מאוד כבדיקת ציפה או שקיעה של ליפוזום, אך דורש הרבה פחות דגימות ומציע עקמומיות מוגדרת בצורה מדויקת יותר על ננו-ברים בודדים <su...

עקמומיות הממברנה היא פרמטר פיזיקלי קריטי של התא המתרחש במגוון תהליכים תאיים כגון מורפוגנזה, חלוקת תאים ונדידת תאים1. כיום ידוע כי עקמומיות הממברנה היא מעבר לתוצאה פשוטה של אירועים תאיים; במקום זאת, הוא התגלה כרגולטור יעיל של אינטראקציות חלבונים ואיתות תוך-תאי. לדוגמה, מספר חלבונים המעורבים באנדוציטוזה בתיווך קלתרין נמצאו נקשרים באופן מועדף לממברנה המעוקלת, וכתוצאה מכך נוצרה נקודה חמה לאנדוציטוזה2. ישנם גורמים רבים ושונים לדפורמציה של הממברנה כגון משיכת ממברנה על ידי כוחות השלד הציטוסקטלי, נוכחות של אסימטריה של שומנים עם קבוצות ראש בגדלים שונים, קיומם של חלבונים טרנסממברניים בעלי צורה חרוטית, הצטברות של חלבונים מעצבי ממברנה כמו חלבוני BAR-domain (הקרויים על שם חלבוני בין, אמפיפיסין ו-Rvs), והחדרת תחום הליקסים האמפיפתיים לממברנה1 . באופן מעניין, חלבונים ושומנים אלה לא רק מעוותים את הממברנה אלא יכולים גם לחוש את עקמומיות הממברנה ולהפגין הצטברות מועדפת1. לכן, חיוני לחקור אם וכיצד ממברנות עם עקמומיות שונה משנות את ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים המחוברים אליהם ואת ההשפעות הפוטנציאליות על התהליכים התוך-תאיים הקשורים אליהם.
טכניקות רבות פותחו כדי לנתח את האינטראקציה בין קרום מעוקל וחלבונים הן בתאים חיים והן במערכות חוץ גופיות. מערכת התאים החיים מספקת סביבת תאים אמיתית עם מגוון שומנים עשיר וויסות איתות חלבוני דינמי 2,3,4,5,6,7. עם זאת, מערכת מתוחכמת כזו קשה לחקור בשל אי הוודאות והתנודות בסביבה התוך תאית. לפיכך, הבדיקות במבחנה באמצעות קרום מלאכותי המורכב ממיני שומנים ידועים וחלבונים מטוהרים הפכו למערכות שחזור חזקות כדי לאפיין את הקשר בין חלבונים לממברנות מעוקלות. באופן מסורתי, ליפוזומים בקטרים שונים נוצרים על ידי שחול כדי לזהות חלבונים רגישים לעקמומיות באמצעות בדיקת שקיעה משותפת באמצעות כוח צנטריפוגלי או בדיקת ציפה משותפת עם שיפוע צפיפות כדי למנוע צבירה של חלבונים 8,9. עם זאת, העקמומיות של הליפוזומים המובלטים מוגבלת על ידי גודל הנקבוביות הזמין של מסנן הממברנה המשמש במכבש10. הוכח כי בדיקת עקמומיות ליפוזום יחיד (SLiC) מתגברת על מגבלה זו, שבה ליפוזומים בקטרים שונים מסומנים פלואורסצנטיים ומשותקים על פני השטח, כך שניתן לסמן את העקמומיות על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות11. עם זאת, שונות חזקה בהרכב השומנים נצפתה בשלפוחיות קטנות, המשפיעות על דיוק מדידת העקמומיות12. ניסויים במשיכת קשירה מספקים מדידה מדויקת יותר של העקמומיות על הקשירה החולפת הנמשכת מבועיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs) באמצעות פינצטה אופטית, שבה ניתן לשלוט היטב בעקמומיות על ידי מתח הממברנה שנוצר13,14. שיטה זו מתאימה לחקר חלבונים בעלי חישת עקמומיות חיובית או שלילית, אך היא מוגבלת על ידי התפוקה של דור10 של הצינורית. בדיקת צינורות ממברנה נתמכים (SMrT) מאפשרת יצירה בו זמנית של צינורות ממברנה מרובים המובלטים מאותו מאגר שומנים על ידי זרימות מיקרופלואידיות. אף על פי כן, עקמומיות הממברנה משתנה באופן מהותי לאורך הננו-צינורית, מה שפוגע בדיוק של מדידת עקמומיות מבוססת פלואורסצנציה15,16. לשם השוואה, שימוש בשלפוחיות חד-שכבתיות קטנות (SUVs, קוטר <100 ננומטר17) ליצירת דו-שכבתי של שומנים נתמכים (SLB) על משטחים המכילים טופוגרפיות מתוכננות יצר קרום דו-שכבתי יחיד עם עקמומיות שנקבעה מראש על ידי ננו-פבריקציה או ננו-חומרים בדיוק גבוה18,19,20.
כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת SLB על משטחי ננו-שבבים מפוברקים עם מערכי ננו-ברים וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את רגישות העקמומיות של חלבונים במבחנה. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם שישה מרכיבים חיוניים של הבדיקה: א) ניקוי והרכבה של השבב עם תא מיקרופלואידי; ב) הכנת רכבי שטח עם הרכב שומנים מוגדר; C) היווצרות SLB על ננו-שבב וקשירה עם חלבונים רגישים לעקמומיות; ד) הדמיה ואפיון של SLB וחלבונים רגישים לעקמומיות תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ה) ניקוי השבב לשימוש חוזר; ו) עיבוד תמונה לניתוח כמותי של יכולת חישת עקמומיות חלבון. הפרוטוקול המפורט מתואר שלב אחר שלב להלן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

עקמומיות הממברנה ממלאת תפקידים חשובים בתהליכים חיוניים שונים של תאים, כגון נדידת תאים, חלוקת תאים וסחר בשלפוחית. הוא לא רק נוצר באופן פסיבי על ידי פעילויות תאיות, אלא גם מווסת באופן פעיל אינטראקציות חלבון ומעורב באיתות תוך תאי רבים. לפיכך, יש ערך רב לבחון את תפקידה של עקמומיות הממברנה בוויסות ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים. לאחרונה פותחו טכניקות רבות לחקר הקשר בין הממברנה המעוקלת לחלבון במבחנה. בהשוואה לטכניקות מסורתיות, דו-שכבת השומנים (SLB) הנתמכת על ידי ננו-ברים שפותחה לאחרונה מציעה הן תפוקה גבוהה והן דיוק טוב יותר ביצירת עקמומיות הממברנה על ידי יצירת דו-שכבה רציפה של שומנים על מערכים מעוצבים של ננו-מוטות עם עקמומיות ממברנה מוגדרת מראש ובקרה שטוחה מקומית. ניתן לאפיין הן את נזילות השומנים והן את רגישות החלבון לממברנות מעוקלות באמצעות הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית. כאן מוצג הליך מפורט כיצד ליצור SLB על משטחי זכוכית מפוברקים המכילים מערכי ננו-מוטות ואפיון חלבונים רגישים לעקמומיות על SLB כזה. בנוסף, פרוטוקולים לשימוש חוזר בננו-שבבים ועיבוד תמונה מכוסים. מעבר לננו-בר-SLB, פרוטוקול זה ישים בקלות לכל סוגי שבבי הזכוכית הננו-מובנים למחקרי חישת עקמומיות.

תכנון ננו-בר מומלץ לבדיקת חלבונים חישת עקמומיות חיובית, המכילים חצי עיגול בכל קצה עם עקמומיות המוגדרת על ידי רוחב הננו-מוט ובקרת עקמומיות שטוחה/אפס אחת מקומית במרכז (איור 2A,B). היווצרות מוצלחת של ה-SLB על גבי ננו-מוטות גורמת לאותות סמן שומנים המפוזרים באופן שווה על פנ...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

כאן פותחה מערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על ידי ננו-ברים כדי לספק קרום סינתטי עם עקמומיות מוגדרת המאפשרת אפיון של חלבונים בעלי יכולת חישת עקמומיות במבחנה.

מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

ניתן להשתמש במערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על-ידי ננו-ברים כדי לחקור את התפקיד של עקמומיות הממברנה בוויסות הדינמיקה וההתפלגות של חלבונים ושומנים במהלך פעילות התא. טכניקה זו מציעה גם תת-שורש גבוה וגם רע ביצירת עקמומיות הממברנה על ידי יצירת דו-שכבת שומנים רציפה על שגיאות ננו-מוטות פטנט עם עקמומיות ממברנה המוגדרת מראש על ידי ננו-פבריקציה ברזולוציה גבוהה. כדי להתחיל, מניחים את שבב הננו בכוס של 10 מיליליטר כשצד התבנית פונה כלפי מעלה.הוסיפו בזהירות מיליליטר אחד של 98% חומצה גופרתית לכוס וודאו שהחומצה מכסה באופן מלא את הצד הקדמי והאחורי של השבב. סובבו באיטיות את הכוס והוסיפו 200 מיקרוליטרים של 30% מי חמצן טיפה אחר טיפה עד שכל הכוס מתחממת. ודא כי חומצה גופרתית ומי חמצן מעורבבים היטב כדי ליצור תמיסת פיראנה להסרת מולקולות אורגניות מן שבב ננו.הניחו את הכוס במיכל זכוכית משני ושמרו על שבב הננו שקוע בתמיסת הפיראנה למשך הלילה כדי לנקות את הלכלוך ביסודיות. הוציאו את הכוס והעבירו בזהירות את תמיסת הפיראנה למיכל פסולת חומצה. טען חמישה מיליליטר של מים שעברו דה-יוניזציה לתוך הכוס כדי לדלל את שארית החומצה ולהשליך אותה לפסולת החומצה.חזור על שלב זה חמש פעמים. קח את השבב עם פינצטה ושטוף עם זרם מתמשך של מים deionized כדי להסיר חומצה שיורית ביסודיות. יש לייבש את השבב עם גז חנקן 99.9% להיווצרות SLB.סוניקו את תערובת השומנים למשך 30 דקות. מקפיאים את תערובת השומנים בחנקן נוזלי למשך 20 שניות ואז מפשירים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות באמבט מים. חזרו על מחזורי ההקפאה/הפשרה 30 פעמים.לאחר מכן, תערובת השומנים נראית כמו נוזל צלול. מעבירים את תערובת השומנים דרך המיני אקסטרודר ומוציאים קדימה ואחורה 20 פעמים. לאסוף את רכבי השטח מן המזרק בצד השני כדי להפחית את הזיהום עם חלקיקים גדולים יותר או חומר זר, ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.מוציאים בזהירות את שבב הננו המנוקה ממים שעברו דה-יוניזציה בעזרת זוג פינצטות ומייבשים אותו עם 99.9% גז חנקן. בצע ניקוי פני השטח של שבב הננו עם טיפול פלזמה אוויר במשך שעה אחת. הרכיבו את שבב הננו בתא PDMS.התחל עם הנחת השבב על משטח נקי כאשר התבנית פונה כלפי מעלה. כסו בעדינות את ה-PDMS האמצעי עם השבב וודאו שכל התבנית חשופה לאזור המרכזי של הפתח הגדול בצורת אליפסה ב-PDMS האמצעי. כסו את ה-PDMS העליון ב-PDMS האמצעי ושמרו על שני החורים הקטנים שלו באזור החור הסגלגל הגדול של ה-PDMS האמצעי.לאחר מכן, תא PDMS הוא התאספו. טען את רכבי השטח לתעלת PDMS מאחד משני החורים הקטנים ב- PDMS העליון עם פיפטה ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את ה- SLB. הכניסו בעדינות את מאגר ה-PBS לתעלת ה-PDMS מצד אחד של החור הקטן והוציאו את הפסולת עם ניצן כותנה מהחור השני כדי לשטוף את רכבי השטח הלא מאוגדים.לאחר מכן לרכוש את SLB שנוצר על שבב ננו. הגדר את המיקרוסקופיה הקונפוקלית לסריקת לייזר באמצעות מטרה של 100 x שמן. פתח את תוכנת הזן כדי לבחור את עוצמת לייזר העירור שיכולה לעורר את הפלואורסצנטיות של השומנים והחלבון.בחר מצב רכישה. לאחר מכן לחץ על הגדרה חכמה, ואחריו טקסס אדום. כוונן את המיקוד באמצעות ידית המיקוד כדי לאתר את פסי הננו על השבב עד שקצוות מוטות הננו יהיו חדים מתחת לתעלת השומנים.הגדר את פרמטרי הסריקה כדי לקבל תמונת בקרה של תעלת השומנים לפני הוספת חלבון. בצע את בדיקת FRAP על ידי הלבנה עם דו-שכבת שומנים המסומנים בפלואורסצנט על אזור אקראי של ננו-בר יחיד. בחר בתיבות הסימון אזורי ניסוי והלבנה.ציירו שטח מעגלי בקוטר של חמישה מיקרומטרים שיכול לכלול את כל הננו-מוט במרכז, והוסיפו לאזורי הניסוי. פרמטרי הדמיה של קלט TimeLapse. בחר סדרות זמן.לאחר מכן לחצו על 'משך'. בחר 100 מחזורים ומרווח שווה לשתי שניות. פרמטרי הלבנת קלט.בחר את תיבות הסימון של הלייזר המבצעות FRAP ושנה את צריכת החשמל ל- 100%לחץ על התחל ניסוי עבור ניסוי FRAP. יש לטעון את תמיסת החלבון לתעלת ה-PDMS ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את קשירת החלבון ב-SLB. מקד מחדש את הננו-ברים והגדר את פרמטרי הסריקה כדי לצלם תמונות של תעלות השומנים והחלבונים לצורך זיהוי חישת עקמומיות חלבונים.בחר אזורי ניסוי ובצע את בדיקת FRAP הן בתעלות השומנים והן בתעלות החלבון, ובצע הדמיית TimeLapse כדי לאפיין את הניידות של חלבון חישת עקמומיות. שניהם מראים הצטברות מוגברת בקצה של ננו-מוטות בודדים מצופים SLB ברוחב 300 ננומטר. כאן SLB מכיל 10% PS כדי לשפר באופן אלקטרוסטטי את קשירת החלבון.לשני החלבונים יש יחס קצה למרכז גבוה יותר מאשר שומנים, שהוא בערך אחד. כאשר משווים את IDR FBP17 ו- F-Bar, יחס הקצה למרכז הגבוה יותר של IDR FBP17 מצביע על חישת עקמומיות חזקה יותר מאשר F-Bar. כל שלושת החלבונים הראו הצטברות מועדפת באתרי הממברנה המעוקלים בקצה הננו-בר כאשר העקמומיות ירדה מתחת לקוטר של 400 ננומטר.מבין שלושת תחומי החלבון הללו, IDR FBP17 נותן את פס הננו והצפיפות הגבוהים ביותר, מה שמעיד על יכולת חישת העקמומיות החזקה ביותר שלו, בעוד ש-F-Bar מציג את הערך הנמוך ביותר. ניתן לשרטט את עקומת קשירת החלבון על ידי הגדלה הדרגתית של ריכוז החלבון, מה שמראה כי ל-IDR FBP17 יש יכולת חישת עקמומיות שיתופית חזקה. בהשוואה להתאוששות המהירה של אותות השומנים על ננו-מוטות, ה-F-Bar אינו יכול להתאושש תוך שתי דקות, מה שמרמז על ירידה משמעותית בניידות הממברנה ובדינמיקת האסוציאציה שלו באתרי הממברנה המעוקלים.באופן מפתיע, שונה מההתנהגות של F-Bar, אותות IDR FBP17 הראו התאוששות ברורה באותה מסגרת זמן, מה שמעיד על האופי הדינמי של IDR FBP17 שהצטבר בממברנות המעוגלות. עם זאת, לאחר שטיפת IDR FBP17 הלא מאוגד בתמיסה, לא ניתן היה לראות את אותה התאוששות בערוץ IDR FBP17 כמו קודם. איכות SLB חשובה מאוד כאשר חוקרים את האינטראקציה בין ממברנה מעוקלת לחלבון.לכן בדיקת FRAP נחוצה בניסוי שלנו כדי לאמת את ניידות הממברנה. מערכת זו תסייע לחוקרים לחקור פרמטרים שונים המשפיעים על אינטראקציית החלבון עם הממברנה המעוקלת, כגון תחומי חישת העקמומיות, והרכב השומנים, וכן לערוך את המחקרים הדינמיים על ממברנה מעוקלת כגון התנהגויות הפרדת פנים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...