Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
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हम नैनोस्ट्रक्चर फैब्रिकेशन और एसईएम इमेजिंग का समर्थन करने के लिए नानयांग टेक्नोलॉजिकल यूनिवर्सिटी (एनटीयू) में नानयांग नैनोफैब्रिकेशन सेंटर (एन 2 एफसी) और सेंटर फॉर डिसरप्टिव फोटोनिक टेक्नोलॉजीज (सीडीपीटी), प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए स्कूल ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज एनटीयू में प्रोटीन प्रोडक्शन प्लेटफॉर्म (पीपीपी) और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए स्कूल ऑफ केमिकल एंड बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एनटीयू को धन्यवाद देते हैं। इस काम को सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय (एमओई) (डब्ल्यू झाओ, आरजी 112/20, आरजी 95/21, और एमओई-टी 2ईपी 30220-0009), इंस्टीट्यूट फॉर डिजिटल मॉलिक्यूलर एनालिटिक्स एंड साइंस (आईडीएमएक्सएस) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, जो रिसर्च सेंटर ऑफ एक्सीलेंस स्कीम (डब्ल्यू झाओ), ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम फाउंडेशन (डब्ल्यू झाओ, आरजीवाई0088/2021) के तहत एमओई फंडिंग द्वारा समर्थित है। अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए स्कूल ऑफ केमिकल एंड बायोमेडिकल इंजीनियरिंग एनटीयू (एक्स मियाओ), और अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद (जे वू)।

1. नैनोचिप की सफाई
<ol><li>नैनोचिप को 10 एमएल बीकर में रखें, जिसमें पैटर्न वाला साइड ऊपर की ओर हो। नोट: यह क्वार्ट्ज नैनोचिप इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी के माध्यम से बनाया गया है जैसा कि21 से प...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
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	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
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	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
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	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
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	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
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	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
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	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
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	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
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	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
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	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
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	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

यहां वर्णित नैनोबार-एसएलबी प्रणाली कई मौजूदा इन विट्रो परखों में फायदे का एक अनूठा संयोजन प्रदान करती है। यह कुशलतापूर्वक लिपोसोम फ्लोटेशन या अवसादन परख के रूप में अत्यधिक घुमावदार झिल्ली के लिए ...

मेम्ब्रेन वक्रता एक कोशिका का एक महत्वपूर्ण भौतिक पैरामीटर है जो विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे मॉर्फोजेनेसिस, सेल डिवीजन और सेल माइग्रेशन1 में होता है। अब यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि झिल्ली वक्रता सेलुलर घटनाओं के एक साधारण परिणाम से परे है; इसके बजाय, यह प्रोटीन इंटरैक्शन और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग के एक प्रभावी नियामक के रूप में उभरा है। उदाहरण के लिए, क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस में शामिल कई प्रोटीन अधिमानतः घुमावदार झिल्ली से बंधे हुए पाए गए, जिसके परिणामस्वरूप एंडोसाइटोसिस2 के लिए एक हॉटस्पॉट का गठन हुआ। झिल्ली विरूपण के कई अलग-अलग कारण हैं जैसे साइटोस्केलेटल बलों द्वारा झिल्ली खींचना, विभिन्न आकार के सिर समूहों के साथ लिपिड विषमता की उपस्थिति, शंक्वाकार आकार के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का अस्तित्व, बीएआर-डोमेन प्रोटीन (बिन, एम्फीफिसिन और आरवीएस प्रोटीन के नाम पर) जैसे झिल्ली को आकार देने वाले प्रोटीन का संचय, और झिल्ली में एम्फीपैथिक हेलिकॉप्टर डोमेन का सम्मिलन1 . दिलचस्प बात यह है कि ये प्रोटीन और लिपिड न केवल झिल्ली को विकृत करते हैं, बल्कि झिल्ली वक्रता को भी महसूस कर सकते हैं और अधिमान्य संचय प्रदर्शित करसकते हैं। इसलिए, यह अध्ययन करना महत्वपूर्ण है कि क्या और कैसे विभिन्न वक्रता वाले झिल्ली उनसे जुड़े प्रोटीन और लिपिड के वितरण और गतिशीलता को बदलते हैं और संबंधित इंट्रासेल्युलर प्रक्रियाओं पर संभावित प्रभाव डालते हैं।
जीवित कोशिका और इन विट्रो सिस्टम दोनों में घुमावदार झिल्ली और प्रोटीन के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए कई तकनीकों को विकसित किया गया है। लाइव सेल सिस्टम समृद्ध लिपिड विविधता और गतिशील प्रोटीन सिग्नलिंग विनियमन 2,3,4,5,6,7 के साथ एक वास्तविक सेल वातावरण प्रदान करता है। हालांकि, इंट्रासेल्युलर वातावरण में अनिश्चितताओं और उतार-चढ़ाव के कारण इस तरह की परिष्कृत प्रणाली का अध्ययन करना मुश्किल है। इसलिए, ज्ञात लिपिड प्रजातियों और शुद्ध प्रोटीन से बने कृत्रिम झिल्ली का उपयोग करके इन विट्रो परख प्रोटीन और घुमावदार झिल्ली के बीच संबंधों को चिह्नित करने के लिए शक्तिशाली पुनर्गठन प्रणाली बन गए हैं। परंपरागत रूप से, विभिन्न व्यास के लिपोसोम एक्सट्रूज़न द्वारा उत्पन्न होते हैं ताकि या तो केन्द्रापसारक बल का उपयोग करके सह-अवसादन परख या प्रोटीन एकत्रीकरण 8,9 से बचने के लिए घनत्व ढाल के साथ सह-प्लवनशीलता परख के माध्यम से वक्रता-संवेदनशील प्रोटीन का पता लगाया जा सके। हालांकि, एक्सट्रूडेड लिपोसोम की वक्रता एक्सट्रूडर10 में उपयोग किए जाने वाले झिल्ली फिल्टर के उपलब्ध छिद्र आकार से सीमित है। एकल लिपोसोम वक्रता (एसएलआईसी) परख इस सीमा को दूर करने के लिए साबित हुई है, जिसमें विभिन्न व्यास वाले लिपोसोम को फ्लोरेसेंस-लेबल किया जाता है और सतह पर स्थिर किया जाता है ताकि वक्रता को फ्लोरोसेंट तीव्रता11 द्वारा चिह्नित किया जा सके। हालांकि, छोटे पुटिकाओं में लिपिड संरचना में मजबूत परिवर्तनशीलता देखी गई है, जो वक्रता माप12 की सटीकता को प्रभावित करती है। टीथर-पुलिंग प्रयोग ऑप्टिकल ट्वीज़र का उपयोग करके विशाल यूनिलैमेलर पुटिकाओं (जीयूवी) से खींचे गए क्षणिक टेथर पर वक्रता का अधिक सटीक माप प्रदान करते हैं, जहां वक्रता को13,14 उत्पन्न झिल्ली तनाव द्वारा अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है। यह विधि सकारात्मक या नकारात्मक-वक्रता संवेदन प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन ट्यूब पीढ़ी10 के थ्रूपुट द्वारा बाधित है। समर्थित झिल्ली ट्यूब (एसएमआरटी) परख कई झिल्ली ट्यूबों की एक साथ पीढ़ी को वहन करती है जो माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह द्वारा एक ही लिपिड जलाशय से बाहर निकाले जाते हैं। फिर भी, झिल्ली वक्रता नैनोट्यूब के साथ आंतरिक रूप से भिन्न होती है, जो प्रतिदीप्ति-तीव्रता-आधारित वक्रता माप15,16 की सटीकता से समझौता करती है। इसकी तुलना में, डिजाइन किए गए टोपोग्राफी वाली सतहों पर एक समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) बनाने के लिए छोटे यूनिलैमेलर पुटिकाओं (एसयूवी, व्यास <100 एनएम 17) का उपयोग करके उच्च सटीकता 18,19,20 में नैनोफैब्रिकेशन या नैनोमैटेरियल्स द्वारा पूर्व निर्धारित वक्रता के साथ एक एकल बाईलेयर झिल्ली उत्पन्न हुई।
यहां, हम नैनोबार सरणियों के साथ निर्मित नैनोचिप सतहों पर एसएलबी के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और इसका उपयोग विट्रो में प्रोटीन की वक्रता संवेदनशीलता की जांच के लिए कैसे किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, परख के छह आवश्यक घटक हैं: ए) माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष के साथ चिप की सफाई और असेंबली; बी) परिभाषित लिपिड संरचना के साथ एसयूवी की तैयारी; सी) नैनोचिप पर एसएलबी का गठन और वक्रता संवेदनशील प्रोटीन के साथ बंधन; डी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत एसएलबी और वक्रता संवेदनशील प्रोटीन की इमेजिंग और लक्षण वर्णन; ई) पुन: उपयोग के लिए चिप की सफाई; च) प्रोटीन वक्रता संवेदन क्षमता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवि प्रसंस्करण। विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे चरण-दर-चरण वर्णित है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

झिल्ली वक्रता कोशिकाओं की विभिन्न आवश्यक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जैसे कि कोशिका प्रवास, कोशिका विभाजन और पुटिका तस्करी। यह न केवल सेलुलर गतिविधियों द्वारा निष्क्रिय रूप से उत्पन्न होता है, बल्कि सक्रिय रूप से प्रोटीन इंटरैक्शन को भी नियंत्रित करता है और कई इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग में शामिल होता है। इस प्रकार, प्रोटीन और लिपिड के वितरण और गतिशीलता को विनियमित करने में झिल्ली वक्रता की भूमिका की जांच करना बहुत महत्वपूर्ण है। हाल ही में, विट्रो में घुमावदार झिल्ली और प्रोटीन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है। पारंपरिक तकनीकों की तुलना में, नव विकसित नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी) पूर्व-परिभाषित झिल्ली वक्रता और स्थानीय फ्लैट नियंत्रण के साथ नैनोबार के पैटर्न सरणी पर एक निरंतर लिपिड बाइलेयर बनाकर झिल्ली वक्रता पीढ़ी में उच्च-थ्रूपुट और बेहतर सटीकता दोनों प्रदान करता है। घुमावदार झिल्ली के लिए लिपिड तरलता और प्रोटीन संवेदनशीलता दोनों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग करके मात्रात्मक रूप से विशेषता दी जा सकती है। यहां, नैनोबार सरणियों वाले निर्मित कांच की सतहों पर एसएलबी बनाने और ऐसे एसएलबी पर वक्रता-संवेदनशील प्रोटीन के लक्षण वर्णन पर एक विस्तृत प्रक्रिया पेश की गई है। इसके अलावा, नैनोचिप पुन: उपयोग और छवि प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल कवर किए गए हैं। नैनोबार-एसएलबी से परे, यह प्रोटोकॉल वक्रता संवेदन अध्ययन के लिए सभी प्रकार के नैनोस्ट्रक्चर्ड ग्लास चिप्स पर आसानी से लागू होता है।

सकारात्मक वक्रता संवेदन प्रोटीन की जांच के लिए नैनोबार डिजाइन की सिफारिश की जाती है, जिसमें नैनोबार चौड़ाई द्वारा परिभाषित वक्रता के साथ प्रत्येक छोर पर आधा चक्र होता है और केंद्र में स्थानीय रूप से ए...

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A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

यहां, एक नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर सिस्टम को परिभाषित वक्रता के साथ सिंथेटिक झिल्ली प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है जो विट्रो में वक्रता संवेदन क्षमता के साथ प्रोटीन के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है।

विट्रो में मेम्ब्रेन वक्रता संवेदन प्रोटीन के अध्ययन के लिए एक नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर सिस्टम

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

इस नैनोबार-समर्थित लिपिड बाइलेयर प्रणाली का उपयोग सेल गतिविधियों के दौरान प्रोटीन और लिपिड की गतिशीलता और वितरण को विनियमित करने में झिल्ली वक्रता की भूमिका का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह तकनीक उच्च रिज़ॉल्यूशन नैनोफैब्रिकेशन द्वारा पूर्वनिर्धारित झिल्ली वक्रता के साथ पेटेंट नैनोबार त्रुटियों पर एक निरंतर लिपिड बाइलेयर बनाकर झिल्ली वक्रता पीढ़ी में उच्च उप-जड़ और खराब दोनों प्रदान करती है। शुरू करने के लिए, नैनो चिप को 10 मिलीलीटर बीकर में पैटर्न साइड के साथ रखें।सावधानी से बीकर में 98% सल्फ्यूरिक एसिड का एक मिलीलीटर जोड़ें और सुनिश्चित करें कि एसिड चिप के सामने और पीछे की तरफ पूरी तरह से कवर करता है। धीरे-धीरे बीकर को घुमाएं और 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड ड्रॉप के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें जब तक कि पूरा बीकर गर्म न हो जाए। सुनिश्चित करें कि सल्फ्यूरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड नैनो चिप से कार्बनिक अणुओं को हटाने के लिए पिरान्हा समाधान बनाने के लिए अच्छी तरह से मिश्रित हैं।बीकर को एक द्वितीयक ग्लास कंटेनर में रखें और अशुद्धियों को अच्छी तरह से साफ करने के लिए नैनो चिप को रात भर पिरान्हा समाधान में डुबोकर रखें। बीकर को बाहर निकालें और पिरान्हा घोल को एक एसिड अपशिष्ट कंटेनर में सावधानीपूर्वक पिपेट करें। अवशिष्ट एसिड को पतला करने और इसे एसिड कचरे में फेंकने के लिए बीकर में पांच मिलीलीटर विआयनीकृत पानी लोड करें।इस चरण को पांच बार दोहराएं। चिप को चिमटी के साथ पकड़ें और अवशिष्ट एसिड को अच्छी तरह से हटाने के लिए विआयनीकृत पानी की निरंतर धारा से धो लें। एसएलबी गठन के लिए 99.9% नाइट्रोजन गैस के साथ चिप को सूखा दें।लिपिड मिश्रण को 30 मिनट के लिए सोनिकेट करें। लिपिड मिश्रण को तरल नाइट्रोजन में 20 सेकंड के लिए फ्रीज करें और फिर पानी के स्नान में दो मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर पिघल जाएं। फ्रीज / पिघलना चक्र 30 बार दोहराएं।उसके बाद, लिपिड मिश्रण एक स्पष्ट तरल की तरह दिखता है। लिपिड मिश्रण को मिनी एक्सट्रूडर के माध्यम से पास करें और 20 बार आगे और पीछे एक्सट्रूड करें। बड़े कणों या विदेशी सामग्री के साथ संदूषण को कम करने के लिए दूसरी तरफ सिरिंज से एसयूवी एकत्र करें, और इसे 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।विआयनीकृत पानी से साफ नैनो चिप को चिमटी की एक जोड़ी के साथ सावधानीपूर्वक निकालें और 99.9% नाइट्रोजन गैस के साथ सूखा दें। एक घंटे के लिए एयर प्लाज्मा उपचार के साथ नैनो चिप की सतह की सफाई करें। नैनो चिप को पीडीएमएस कक्ष में इकट्ठा करें।चिप को एक साफ सतह पर रखने के साथ शुरू करें जिसमें पैटर्न ऊपर की ओर हो। धीरे से चिप के साथ मध्य पीडीएमएस को कवर करें और सुनिश्चित करें कि पूरा पैटर्न मध्य पीडीएमएस में बड़े अंडाकार आकार के उद्घाटन के केंद्रीय क्षेत्र के संपर्क में है। शीर्ष पीडीएमएस को मध्य पीडीएमएस के साथ कवर करें और मध्य पीडीएमएस के बड़े अंडाकार छेद के क्षेत्र के भीतर इसके दो छोटे छेद रखें।फिर, पीडीएमएस कक्ष इकट्ठा किया जाता है। एक पिपेट के साथ शीर्ष पीडीएमएस में दो छोटे छेदों में से एक से एसयूवी को पीडीएमएस चैनल में लोड करें और एसएलबी बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। धीरे से पीबीएस बफर को छोटे छेद के एक तरफ से पीडीएमएस चैनल में डालें और अनबाउंड एसयूवी को धोने के लिए दूसरे छेद से कपास की कली के साथ कचरे को हटा दें।फिर नैनो चिप पर गठित एसएलबी का अधिग्रहण करें। 100 x तेल उद्देश्य का उपयोग करके लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सेट करें। उत्तेजना लेजर शक्ति का चयन करने के लिए ज़ेन सॉफ्टवेयर खोलें जो लिपिड और प्रोटीन की प्रतिदीप्ति को उत्तेजित कर सकता है।अधिग्रहण मोड चुनें. फिर स्मार्ट सेटअप पर क्लिक करें, उसके बाद टेक्सास रेड। चिप पर नैनो सलाखों का पता लगाने के लिए फोकस नॉब के साथ फोकस समायोजित करें जब तक कि लिपिड चैनल के नीचे नैनो बार किनारे तेज न हों।प्रोटीन जोड़ने से पहले लिपिड चैनल की नियंत्रण छवि प्राप्त करने के लिए स्कैनिंग पैरामीटर सेट करें। एक यादृच्छिक एकल नैनोबार क्षेत्र पर फ्लोरोसेंट लेबल लिपिड बाइलेयर के साथ ब्लीचिंग करके एफआरएपी परख का संचालन करें। प्रयोग क्षेत्र और ब्लीचिंग चेक बॉक्स का चयन करें.पांच माइक्रोमीटर व्यास का एक गोलाकार क्षेत्र बनाएं जिसमें केंद्र में पूरे नैनोबार शामिल हो सकते हैं, और प्रयोग क्षेत्रों में जोड़ सकते हैं। इनपुट टाइमलैप्स इमेजिंग पैरामीटर। समय श्रृंखला चुनें.फिर अवधि क्लिक करें. दो सेकंड के बराबर 100 चक्र और अंतराल का चयन करें। इनपुट ब्लीचिंग पैरामीटर।FRAP निष्पादित करने वाले लेज़र चेक बॉक्स का चयन करें और FRAP प्रयोग के लिए प्रयोग प्रारंभ करें पर 100% क्लिक करें में शक्ति बदलें. प्रोटीन समाधान को पीडीएमएस चैनल में लोड करें और एसएलबी पर प्रोटीन के बंधन की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। नैनोबार को फिर से फोकस करें और प्रोटीन वक्रता संवेदन का पता लगाने के लिए लिपिड और प्रोटीन चैनल दोनों की छवियां लेने के लिए स्कैनिंग पैरामीटर सेट करें।प्रयोग क्षेत्रों का चयन करें और लिपिड और प्रोटीन चैनलों दोनों पर एफआरएपी परख का संचालन करें, और वक्रता संवेदन प्रोटीन की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए टाइमलैप्स इमेजिंग करें। दोनों 300 नैनोमीटर चौड़ाई के साथ एसएलबी लेपित व्यक्तिगत नैनोबार के अंत में संचय में वृद्धि दिखाते हैं। यहां एसएलबी में प्रोटीन बाइंडिंग को इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से बढ़ाने के लिए 10% पीएस होता है।दोनों प्रोटीनों में लिपिड की तुलना में उच्च अंत से केंद्र अनुपात होता है, जो लगभग एक होता है। आईडीआर एफबीपी 17 और एफ-बार की तुलना करते समय, आईडीआर एफबीपी 17 का उच्च अंत से केंद्र अनुपात एफ-बार की तुलना में मजबूत वक्रता संवेदन को इंगित करता है। सभी तीन प्रोटीनों ने नैनोबार अंत घुमावदार झिल्ली साइटों पर अधिमान्य संचय दिखाया जब वक्रता व्यास में 400 नैनोमीटर से कम हो गई।इन तीन प्रोटीन डोमेन में से, आईडीआर एफबीपी 17 उच्चतम नैनो बार और घनत्व देता है, जो इसकी सबसे मजबूत वक्रता संवेदन क्षमता का संकेत देता है, जबकि एफ-बार सबसे कम मूल्य दिखाता है। प्रोटीन बाइंडिंग वक्र को धीरे-धीरे प्रोटीन एकाग्रता को बढ़ाकर प्लॉट किया जा सकता है जो दर्शाता है कि आईडीआर एफबीपी 17 में एक मजबूत सहकारी वक्रता संवेदन क्षमता है। नैनोबार पर लिपिड संकेतों की तेजी से वसूली की तुलना में, एफ-बार दो मिनट के भीतर ठीक नहीं हो सकता है, जिससे पता चलता है कि घुमावदार झिल्ली साइटों पर इसकी झिल्ली गतिशीलता और जुड़ाव में काफी कमी आई है।आश्चर्यजनक रूप से, एफ-बार के व्यवहार से अलग, आईडीआर एफबीपी 17 संकेतों ने एक ही समय सीमा के भीतर स्पष्ट वसूली दिखाई, जो घुमावदार झिल्ली पर संचित आईडीआर एफबीपी 17 की गतिशील प्रकृति का संकेत देती है। हालांकि, समाधान में अनबाउंड आईडीआर एफबीपी 17 को धोने के बाद, आईडीआर एफबीपी 17 चैनल में पहले की तरह वसूली नहीं देखी जा सकी। घुमावदार झिल्ली और प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करते समय एसएलबी गुणवत्ता बहुत महत्वपूर्ण है।इसलिए झिल्ली गतिशीलता को मान्य करने के लिए हमारे प्रयोग में एफआरएपी परीक्षण आवश्यक है। यह प्रणाली शोधकर्ताओं को घुमावदार झिल्ली के साथ प्रोटीन इंटरैक्शन को प्रभावित करने वाले विभिन्न मापदंडों का अध्ययन करने में मदद करेगी, जैसे वक्रता संवेदन डोमेन, और लिपिड संरचना के साथ-साथ घुमावदार झिल्ली जैसे चेहरे के पृथक्करण व्यवहार पर गतिशील अध्ययन करने के लिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

नाइट्रोजन Cavitation और अवकलन केंद्रापसारक संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में परिधीय झिल्ली प्रोटीन के वितरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

डिटर्जेंट-मुक्त Ultrafast Bilayers में झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन Fusogenic पूरक का उपयोग कर Proteoliposomes आरोप लगाया ।

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

जीवाणु रोगजनक फैटी एसिड समावेश के अध्ययन के लिए चिकन अंडे Yolk से लाइपोप्रोटीन कणों का अलगाव झिल्ली Phospholipids में शामिल

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, एक एक कदम झिल्ली प्रोटीन का शामिल Biotinylated Peptidiscs के लिए सुव्यवस्थित प्रोटीन बंधन परख के लिए

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...