Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
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Ringraziamo il Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e il Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) della Nanyang Technological University (NTU) per aver supportato la fabbricazione di nanostrutture e l'imaging SEM, la Protein Production Platform (PPP) presso la School of Biological Sciences NTU per la purificazione delle proteine e la School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per il microscopio confocale. Questo lavoro è finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), dall'Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) supportato dal finanziamento MOE nell'ambito del programma Research Centres of Excellence (W. Zhao), dalla Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), dalla NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per la borsa di studio di ricerca (X. Miao) e China Scholarship Council per la borsa di studio di ricerca (J. Wu).

1. Pulizia del nanochip
<ol><li>Posizionare il nanochip in un becher da 10 mL con il lato modellato rivolto verso l'alto. NOTA: Questo nanochip di quarzo è stato fabbricato mediante litografia a fascio di elettroni come descritto prima21. La geometria e la disposizione della nanostruttura sul chip possono essere progettate su misura. Le dimensioni delle nanobarre di gradiente utilizzate qui sono 2000 nm di lunghezza, 600 nm di altezza e da 100 a 1000 nm di larghezza...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
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	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
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	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Il sistema nanobar-SLB qui descritto offre una combinazione unica dei vantaggi in diversi saggi in vitro esistenti. Rivela in modo efficiente il legame preferenziale delle proteine a membrane altamente curve come il test di galleggiamento o sedimentazione dei liposomi, ma richiede molti meno campioni e offre una curvatura definita con maggiore precisione su singole nanobarre 8,29. Offre inoltre una vasta gamma di curvature controllate con precisione per ...

La curvatura della membrana è un parametro fisico critico di una cellula che si verifica in una varietà di processi cellulari come la morfogenesi, la divisione cellulare e la migrazione cellulare1. È ampiamente riconosciuto ora che la curvatura della membrana è al di là di un semplice risultato di eventi cellulari; Invece, è emerso come un efficace regolatore delle interazioni proteiche e della segnalazione intracellulare. Ad esempio, è stato scoperto che diverse proteine coinvolte nell'endocitosi mediata da clatrina si legano preferenzialmente alla membrana curva, con conseguente formazione di un hotspot per l'endocitosi2. Ci sono molte cause diverse di deformazione della membrana come l'attrazione della membrana da parte delle forze citoscheletriche, la presenza di asimmetria lipidica con gruppi di testa di dimensioni diverse, l'esistenza di proteine transmembrana con forma conica, l'accumulo di proteine che modellano la membrana come le proteine del dominio BAR (dal nome delle proteine Bin, anfifisina e Rvs) e l'inserimento del dominio delle eliche anfipatiche nella membrana1 . È interessante notare che queste proteine e lipidi non solo deformano la membrana, ma possono anche percepire la curvatura della membrana e mostrare un accumulo preferenziale1. Pertanto, è fondamentale studiare se e come membrane con diverse curvature alterano la distribuzione e la dinamica delle proteine e dei lipidi ad esse collegati e i potenziali impatti sui relativi processi intracellulari.
Molte tecniche sono state sviluppate per analizzare l'interazione tra membrana curva e proteine sia in cellule vive che in sistemi in vitro. Il sistema di cellule vive fornisce un ambiente cellulare reale con una ricca diversità lipidica e regolazione dinamica della segnalazione proteica 2,3,4,5,6,7. Tuttavia, un sistema così sofisticato è difficile da studiare a causa delle incertezze e delle fluttuazioni nell'ambiente intracellulare. Quindi, i saggi in vitro che utilizzano una membrana artificiale composta da specie lipidiche note e proteine purificate sono diventati potenti sistemi di ricostituzione per caratterizzare la relazione tra proteine e membrane curve. Tradizionalmente, liposomi di diversi diametri sono generati per estrusione per rilevare proteine sensibili alla curvatura tramite un saggio di co-sedimentazione utilizzando la forza centrifuga o un saggio di co-flottazione con un gradiente di densità per evitare l'aggregazione proteica 8,9. Tuttavia, la curvatura dei liposomi estrusi è limitata dalla dimensione dei pori disponibile del filtro a membrana utilizzato nell'estrusore10. È stato dimostrato che il test di curvatura a liposoma singolo (SLiC) supera questa limitazione, in cui i liposomi con diametri diversi sono marcati con fluorescenza e immobilizzati sulla superficie in modo che la curvatura possa essere contrassegnata dall'intensità fluorescente11. Tuttavia, è stata osservata una forte variabilità nella composizione lipidica nelle piccole vescicole, che influisce sull'accuratezza della misurazione della curvatura12. Gli esperimenti di tirare il tethering forniscono una misurazione più accurata della curvatura sul cavo transitorio tirato da vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando una pinzetta ottica, dove la curvatura può essere ben controllata dalla tensione della membrana generata13,14. Questo metodo è adatto per studiare proteine sensibili a curvatura positiva o negativa, ma è limitato dal throughput della generazione del tubo10. Il test SMrT (Supported Membrane Tubes) consente la generazione simultanea di più tubi a membrana che vengono estrusi dallo stesso serbatoio lipidico mediante flussi microfluidici. Tuttavia, la curvatura della membrana varia intrinsecamente lungo il nanotubo, il che compromette l'accuratezza della misurazione della curvatura basata sull'intensità di fluorescenza15,16. In confronto, l'utilizzo di piccole vescicole unilamellari (SUV, diametro <100 nm17) per formare un doppio strato lipidico supportato (SLB) su superfici contenenti topografie progettate ha generato una singola membrana a doppio strato con curvature predeterminate da nanofabbricazione o nanomateriali in alta precisione18,19,20.
Qui, presentiamo un protocollo per la formazione dell'SLB su superfici di nanochip fabbricate con array di nanobar e come può essere utilizzato per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in vitro. Come mostrato in Figura 1, ci sono sei componenti essenziali del test: A) Pulizia e assemblaggio del chip con una camera microfluidica; B) Preparazione di SUV con composizione lipidica definita; C) Formazione dell'SLB su un nanochip e legame con proteine sensibili alla curvatura; D) Imaging e caratterizzazione delle proteine SLB e curvature sensibili al microscopio a fluorescenza; E) Pulizia del chip per il riutilizzo; F) Elaborazione di immagini per l'analisi quantitativa della capacità di rilevamento della curvatura proteica. Il protocollo dettagliato è descritto passo dopo passo di seguito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

La curvatura della membrana svolge un ruolo importante in vari processi essenziali delle cellule, come la migrazione cellulare, la divisione cellulare e il traffico di vescicole. Non solo è generato passivamente dalle attività cellulari, ma regola anche attivamente le interazioni proteiche ed è coinvolto in molte segnalazioni intracellulari. Pertanto, è di grande valore esaminare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della distribuzione e della dinamica delle proteine e dei lipidi. Recentemente, molte tecniche sono state sviluppate per studiare la relazione tra la membrana curva e la proteina in vitro. Rispetto alle tecniche tradizionali, il nuovo nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offre sia un throughput elevato che una migliore precisione nella generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su matrici modellate di nanobar con una curvatura di membrana predefinita e un controllo piatto locale. Sia la fluidità lipidica che la sensibilità proteica alle membrane curve possono essere caratterizzate quantitativamente utilizzando l'imaging al microscopio a fluorescenza. Qui viene introdotta una procedura dettagliata su come formare un SLB su superfici di vetro fabbricate contenenti array di nanobar e la caratterizzazione delle proteine sensibili alla curvatura su tale SLB. Inoltre, sono coperti i protocolli per il riutilizzo dei nanochip e l'elaborazione delle immagini. Oltre al nanobar-SLB, questo protocollo è facilmente applicabile a tutti i tipi di chip di vetro nanostrutturati per studi di rilevamento della curvatura.

Il design Nanobar è raccomandato per sondare le proteine sensibili alla curvatura positiva, che contiene un semicerchio a ciascuna estremità con curvatura definita dalla larghezza della nanobarra e un controllo della curvatura piatta / zero localmente al centro (Figura 2A, B). La formazione riuscita dell'SLB sui nanobar si traduce in segnali di marcatori lipidici uniformemente distribuiti su tutta la superficie dei nanobar, come mostrato nella Figura 2...

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A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Qui, viene sviluppato un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per fornire una membrana sintetica con una curvatura definita che consente la caratterizzazione di proteine con capacità di rilevamento della curvatura in vitro.

Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Questo sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar può essere utilizzato per studiare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della dinamica e della distribuzione di proteine e lipidi durante le attività cellulari. Questa tecnica offre sia un'alta sub radice che una cattiva generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su errori di nanobar brevettati con curvatura della membrana predefinita da nanofabbricazione ad alta risoluzione. Per iniziare, posizionare il nano chip in un becher da 10 millilitri con il lato del modello rivolto verso l'alto.Aggiungere con attenzione un millilitro di acido solforico al 98% al becher e assicurarsi che l'acido copra completamente il lato anteriore e posteriore del chip. Ruotare lentamente il becher e aggiungere 200 microlitri di perossido di idrogeno al 30% goccia a goccia fino a quando l'intero becher diventa caldo. Assicurarsi che l'acido solforico e il perossido di idrogeno siano ben miscelati per formare la soluzione Piranha per la rimozione delle molecole organiche dal nano chip.Posizionare il becher in un contenitore di vetro secondario e mantenere il nano chip immerso nella soluzione di Piranha durante la notte per pulire accuratamente le impurità. Estrarre il becher e pipettare con cura la soluzione di Piranha in un contenitore per rifiuti acidi. Caricare cinque millilitri di acqua deionizzata nel becher per diluire l'acido residuo e gettarlo nei rifiuti acidi.Ripetere questo passaggio cinque volte. Afferrare il chip con una pinzetta e lavare con un flusso continuo di acqua deionizzata per rimuovere accuratamente l'acido residuo. Asciugare il truciolo con azoto gassoso al 99,9% per la formazione di SLB.Sonicare la miscela lipidica per 30 minuti. Congelare la miscela lipidica in azoto liquido per 20 secondi e poi scongelare a 42 gradi Celsius per due minuti a bagnomaria. Ripetere i cicli di congelamento/disgelo 30 volte.Dopo di ciò, la miscela lipidica sembra un liquido chiaro. Passare la miscela lipidica attraverso il mini estrusore ed estrudere avanti e indietro 20 volte. Raccogliere i SUV dalla siringa sull'altro lato per ridurre la contaminazione con particelle più grandi o materiale estraneo e trasferirlo in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.Estrarre accuratamente il nano chip pulito dall'acqua deionizzata con un paio di pinzette e asciugare con azoto gassoso al 99,9%. Eseguire la pulizia superficiale del nano chip con trattamento al plasma ad aria per un'ora. Assemblare il nano chip in una camera PDMS.Inizia posizionando il chip su una superficie pulita con il motivo rivolto verso l'alto. Coprire delicatamente il PDMS centrale con il chip e assicurarsi che l'intero modello sia esposto all'area centrale della grande apertura di forma ovale nel PDMS centrale. Coprire il PDMS superiore con il PDMS centrale e mantenere i suoi due piccoli fori all'interno della regione del grande foro ovale del PDMS centrale.Quindi, viene assemblata la camera PDMS. Caricare i SUV nel canale PDMS da uno dei due piccoli fori nel PDMS superiore con una pipetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per formare l'SLB. Pipettare delicatamente il tampone PBS nel canale PDMS da un lato del piccolo foro e rimuovere i rifiuti con un batuffolo di cotone dall'altro foro per lavare via i SUV non legati.Quindi acquisire l'SLB formato sul nano chip. Impostare la microscopia confocale a scansione laser utilizzando un obiettivo olio 100x. Apri il software Zen per selezionare la potenza del laser di eccitazione che può eccitare la fluorescenza del lipide e delle proteine.Scegliere Modalità di acquisizione. Quindi fare clic su Configurazione intelligente, seguito da Texas Red. Regolare la messa a fuoco con la manopola di messa a fuoco per individuare le nano barre sul chip fino a quando i bordi della barra nano sono nitidi sotto il canale lipidico.Impostare i parametri di scansione per ottenere un'immagine di controllo del canale lipidico prima di aggiungere proteine. Condurre il test FRAP sbiancando con doppio strato lipidico marcato fluorescente su una singola area nanobar casuale. Selezionare le caselle di controllo Aree esperimento e Sbiancamento.Disegna un'area circolare di cinque micrometri di diametro che può includere l'intera nanobarra al centro e aggiungi alle regioni dell'esperimento. Parametri di imaging TimeLapse di input. Scegliere Serie temporali.Quindi fare clic su Durata. Selezionare 100 cicli e intervallo pari a due secondi. Parametri di sbiancamento in ingresso.Selezionare le caselle di controllo laser che eseguono FRAP e impostare l'alimentazione su 100%Fare clic su Avvia esperimento per l'esperimento FRAP. Caricare la soluzione proteica nel canale PDMS e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire il legame della proteina sull'SLB. Rifocalizzare le nanobarre e impostare i parametri di scansione per acquisire immagini di entrambi i canali lipidici e proteici per il rilevamento della curvatura proteica.Selezionare le regioni dell'esperimento e condurre il test FRAP su entrambi i canali lipidici e proteici ed eseguire l'imaging TimeLapse per caratterizzare la mobilità della proteina sensibile alla curvatura. Entrambi mostrano un maggiore accumulo all'estremità delle singole nanobarre rivestite SLB con larghezza di 300 nanometri. Qui l'SLB contiene 10% PS per migliorare elettrostaticamente il legame proteico.Entrambe le proteine hanno un rapporto end-to-centro più alto rispetto ai lipidi, che è di circa uno. Quando si confrontano IDR FBP17 e F-Bar, il rapporto più alto tra estremità e centro di IDR FBP17 indica un rilevamento della curvatura più forte rispetto a F-Bar. Tutte e tre le proteine hanno mostrato un accumulo preferenziale nei siti di membrana curva dell'estremità nanobar quando la curvatura è diminuita al di sotto dei 400 nanometri di diametro.Tra questi tre domini proteici, IDR FBP17 fornisce la più alta nano barra e densità, indicando la sua più forte capacità di rilevamento della curvatura, mentre F-Bar mostra il valore più basso. La curva di legame proteico può essere tracciata aumentando gradualmente la concentrazione proteica che mostra che IDR FBP17 ha una forte capacità di rilevamento della curvatura cooperativa. Rispetto al rapido recupero dei segnali lipidici sui nanobar, l'F-Bar non può recuperare entro due minuti, suggerendo la sua mobilità di membrana significativamente ridotta e la dinamica di associazione nei siti curvi della membrana.Sorprendentemente, a differenza del comportamento di F-Bar, i segnali IDR FBP17 hanno mostrato un evidente recupero nello stesso lasso di tempo, indicando la natura dinamica di IDR FBP17 accumulata sulle membrane curve. Tuttavia, dopo aver lavato via l'IDR FBP17 non legato nella soluzione, non è stato possibile osservare lo stesso recupero nel canale IDR FBP17 di prima. La qualità SLB è molto importante quando si studia l'interazione tra membrana curva e proteina.Quindi il test FRAP è necessario nel nostro esperimento per convalidare la mobilità della membrana. Questo sistema aiuterà i ricercatori a studiare vari parametri che influenzano l'interazione proteica con la membrana curva, come i domini di rilevamento della curvatura e la composizione lipidica, nonché a condurre studi dinamici sulla membrana curva come i comportamenti di separazione facciale.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cavitazione di azoto e centrifugazione differenziale permette di monitorare la distribuzione periferica delle proteine di membrana in cellule coltivate

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, un'incorporazione in un solo passaggio di proteine membrana in Peptidiscbio biotinylated per analisi di legame proteico semplificato

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...