Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
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나노 구조 제조 및 SEM 이미징을 지원하는 난양 기술 대학교 (NTU)의 난양 나노 제조 센터 (N2FC)와 파괴 광자 기술 센터 (CDPT), 단백질 정제를위한 생명 과학 학교 NTU의 단백질 생산 플랫폼 (PPP), 컨포칼 현미경을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU에 감사드립니다. 이 연구는 싱가포르 교육부(MOE)(W. Zhao, RG112/20, RG95/21 및 MOE-T2EP30220-0009), 디지털 분자 분석 및 과학 연구소(IDMxS)가 자금을 지원합니다. 우수 연구 센터 제도(W. Zhao), 휴먼 프론티어 과학 프로그램 재단(W. Zhao, RGY0088/2021), NTU 스타트업 보조금(W. Zhao), 연구 장학금을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU (X. Miao), 연구 장학금을위한 중국 장학금위원회 (J. Wu).

1. 나노 칩 청소
<ol><li>나노칩을 패턴화된 면이 위를 향하도록 10mL 비커에 넣습니다. 참고 :이 석영 나노 칩은 앞서 설명한 바와 같이 전자빔 리소그래피를 통해 제조되었습니다21. 칩상의 나노 구조의 기하학적 구조와 배열은 맞춤 설계 될 수있다. 여기에 사용 된 그래디언트 나노 바의 크기는 길이 2000nm, 높이 600nm, 너비 100-1000nm (100nm 스텝 세트)입니다.</li>
	...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
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	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
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	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
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	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
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	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
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	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
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	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

여기에 설명된 나노바-SLB 시스템은 기존의 여러 시험관 분석에서 장점의 고유한 조합을 제공합니다. 리포솜 부유 또는 침강 분석과 같이 고도로 구부러진 막에 대한 단백질의 우선적 결합을 효율적으로 나타내지만 훨씬 적은 수의 샘플이 필요하며 개별 나노바 8,29에서 보다 정확하게 정의된 곡률을 제공합니다. 또한 SLiC 분석법과 동시 비교를 위...

막 곡률은 형태 형성, 세포 분열 및 세포 이동과 같은 다양한 세포 과정에서 발생하는 세포의 중요한 물리적 매개 변수입니다1. 막 곡률이 세포 사건의 단순한 결과를 넘어선다는 것이 이제 널리 인식되고 있습니다. 대신, 단백질 상호 작용 및 세포 내 신호 전달의 효과적인 조절자로 부상했습니다. 예를 들어, 클라 트린 매개 세포 내 이입에 관여하는 여러 단백질이 곡선 막에 우선적으로 결합하여 세포 내 이입2에 대한 핫스팟을 형성하는 것으로 나타났습니다. 세포골격력에 의한 막 당김, 크기가 다른 머리 그룹을 가진 지질 비대칭의 존재, 원뿔 모양의 막 횡단 단백질의 존재, BAR 도메인 단백질(Bin, amphiphysin 및 Rvs 단백질의 이름을 따서 명명됨)과 같은 막 형성 단백질의 축적, 양친매성 나선 도메인을 막1에 삽입하는 것과 같은 막 변형의 다양한 원인이 있습니다. . 흥미롭게도 이러한 단백질과 지질은 막을 변형시킬 뿐만 아니라 막 곡률을 감지하고 우선적인 축적을 나타낼 수있습니다1. 따라서 곡률이 다른 막이 단백질과 지질의 분포와 역학을 변화시키고 관련 세포 내 과정에 대한 잠재적 영향을 변화시키는지 여부와 방법을 연구하는 것이 중요합니다.
살아있는 세포와 시험관 내 시스템 모두에서 곡선 막과 단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 살아있는 세포 시스템은 풍부한 지질 다양성과 동적 단백질 신호 조절 2,3,4,5,6,7을 갖춘 실제 세포 환경을 제공합니다. 그러나, 이러한 정교한 시스템은 세포 내 환경의 불확실성 및 변동으로 인해 연구하기가 어렵다. 따라서 알려진 지질 종과 정제된 단백질로 구성된 인공 막을 사용하는 시험관 내 분석은 단백질과 곡선 막 사이의 관계를 특성화하는 강력한 재구성 시스템이 되었습니다. 전통적으로, 다양한 직경의 리포좀은 원심력을 이용한 공동 침강 분석 또는 단백질 응집을 피하기 위한 밀도 구배를 갖는 공동 부유 분석 8,9를 통해 곡률에 민감한 단백질을 검출하기 위해 압출에 의해 생성됩니다. 그러나, 압출된 리포좀의 곡률은 압출기(10)에 사용되는 멤브레인 필터의 사용 가능한 기공 크기에 의해 제한된다. 단일 리포좀 곡률(SLiC) 분석은 이러한 한계를 극복하는 것으로 입증되었으며, 여기서 직경이 다른 리포좀은 형광 표지되고 표면에 고정화되어 곡률이 형광 강도(11)로 표시될 수 있습니다. 그러나, 지질 조성에서의 강한 가변성이 작은 소포에서 관찰되었고, 이는 곡률 측정의 정확도에 영향을 미친다(12). 테더-풀링 실험은 광학 핀셋을 사용하여 거대한 단층 소포(GUV)로부터 당겨진 과도 테더 상의 곡률의 보다 정확한 측정을 제공하며, 여기서 곡률은 생성된 막 장력에 의해 잘 제어될 수 있다(13,14). 이 방법은 포지티브 또는 네거티브 곡률 감지 단백질을 연구하는 데 적합하지만 튜브 생성10의 처리량에 의해 제한됩니다. 지원되는 멤브레인 튜브(SMrT) 분석은 미세유체 흐름에 의해 동일한 지질 저장소에서 압출되는 여러 멤브레인 튜브를 동시에 생성할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 막 곡률은 나노튜브를 따라 본질적으로 변하며, 이는 형광-강도-기반 곡률 측정(15,16)의 정확도를 손상시킨다. 이에 비해, 작은 단층 소포 (SUVs, 직경 <100 nm17)를 사용하여 설계된 지형을 포함하는 표면 상에 지지된 지질 이중층 (SLB)을 형성하여 나노 제조 또는 나노 물질에 의해 미리 결정된 곡률을 갖는 단일 이중층 막을 높은 정확도로 생성하였다18,19,20.
여기에서는 나노바 어레이가 있는 제작된 나노칩 표면에 SLB를 형성하기 위한 프로토콜과 이를 사용하여 시험관 내 단백질의 곡률 감도를 조사하는 방법을 제시합니다. 도 1에 도시된 바와 같이, 분석의 6가지 필수 성분이 있다: A) 칩을 마이크로유체 챔버로 세척 및 조립하는 단계; B) 정의된 지질 조성을 갖는 SUV의 제조; c) 나노칩 상에 SLB를 형성하고 곡률 민감성 단백질과 결합하는 단계; D) 형광 현미경 하에서 SLB 및 곡률 민감성 단백질의 이미징 및 특성화; E) 재사용을 위해 칩을 청소하는 단계; F) 단백질 곡률 센싱 능력의 정량 분석을 위한 영상 처리. 자세한 프로토콜은 아래에 단계별로 설명되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

막 곡률은 세포 이동, 세포 분열 및 소포 트래피킹과 같은 세포의 다양한 필수 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 활동에 의해 수동적으로 생성 될뿐만 아니라 단백질 상호 작용을 적극적으로 조절하고 많은 세포 내 신호 전달에 관여합니다. 따라서 단백질과 지질의 분포와 역학을 조절하는 막 곡률의 역할을 조사하는 것은 큰 가치가 있습니다. 최근에는 시험 관 내에서 곡선 막과 단백질 사이의 관계를 연구하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 기존 기술과 비교하여 새로 개발된 나노바 지지 지질 이중층(SLB)은 사전 정의된 막 곡률 및 국소 평면 제어를 통해 패턴화된 나노바 어레이에 연속 지질 이중층을 형성하여 막 곡률 생성에서 높은 처리량과 더 나은 정확도를 모두 제공합니다. 곡면막에 대한 지질 유동성과 단백질 민감도는 형광 현미경 이미징을 사용하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다. 여기에서는 나노바 어레이를 포함하는 제작된 유리 표면에 SLB를 형성하는 방법과 이러한 SLB 상의 곡률 민감성 단백질의 특성 분석에 대한 자세한 절차를 소개합니다. 또한 나노 칩 재사용 및 이미지 처리를위한 프로토콜을 다룹니다. nanobar-SLB 외에도 이 프로토콜은 곡률 감지 연구를 위한 모든 유형의 나노 구조 유리 칩에 쉽게 적용할 수 있습니다.

나노바 설계는 포지티브 곡률 감지 단백질을 프로빙하는 데 권장되며, 각 끝에는 나노바 너비로 정의된 곡률이 있는 반원이 있고 중앙에 국부적으로 하나의 평면/제로 곡률 제어가 포함됩니다(그림 2A,B). 나노바에 SLB를 성공적으로 형성하면 그림 2C와 같이 전체 나노바 표면에 걸쳐 지질 마커 신호가 고르게 분포됩니다. 개별 나노바 이미지...

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A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

이 나노바 지지 지질 이중층 시스템은 세포 활동 중 단백질과 지질의 역학 및 분포를 조절하는 막 곡률의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 고해상도 나노 제조에 의해 사전 정의 된 막 곡률로 특허 나노 바 오류에 연속적인 지질 이중층을 형성함으로써 막 곡률 생성에서 높은 서브 루트와 나쁜 것을 모두 제공합니다. 시작하려면 나노 칩을 패턴면이 위를 향하도록 10 밀리리터 비커에 넣습니다.비커에 98 % 황산 1 밀리리터를 조심스럽게 추가하고 산이 칩의 앞면과 뒷면을 완전히 덮도록합니다. 비커를 천천히 돌리고 전체 비커가 뜨거워 질 때까지 200 마이크로 리터의 30 % 과산화수소를 한 방울 씩 추가합니다. 황산과 과산화수소가 잘 혼합되어 나노 칩에서 유기 분자를 제거하기위한 피라냐 용액을 형성하는지 확인하십시오.비커를 보조 유리 용기에 넣고 나노 칩을 피라냐 용액에 밤새 담가 두어 불순물을 철저히 청소하십시오. 비커를 꺼내 피라냐 용액을 산성 폐기물 용기에 조심스럽게 피펫팅합니다. 5 밀리리터의 탈 이온수를 비커에 넣어 잔류 산을 희석하고 산성 폐기물로 버립니다.이 단계를 다섯 번 반복합니다. 핀셋으로 칩을 잡고 탈이온수의 연속 흐름으로 세척하여 잔류 산을 완전히 제거합니다. SLB 형성을 위해 99.9 % 질소 가스로 칩을 불어 건조시킵니다.지질 혼합물을 30 분 동안 초음파 처리하십시오. 지질 혼합물을 액체 질소에서 20 초 동안 동결시킨 다음 수조에서 섭씨 42도에서 2 분 동안 해동합니다. 동결/해동 주기를 30회 반복합니다.그 후, 지질 혼합물은 투명한 액체처럼 보입니다. 지질 혼합물을 미니 압출기를 통과시키고 앞뒤로 20회 압출합니다. 반대쪽의 주사기에서 SUV를 수집하여 더 큰 입자 나 이물질로 인한 오염을 줄이고 1.5 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.한 쌍의 핀셋으로 탈 이온수에서 청소 된 나노 칩을 조심스럽게 꺼내고 99.9 % 질소 가스로 불어 건조시킵니다. 1시간 동안 공기 플라즈마 처리로 나노칩의 표면 세정을 수행한다. 나노 칩을 PDMS 챔버에 조립합니다.패턴이 위를 향하도록 깨끗한 표면에 칩을 놓는 것으로 시작하십시오. 중간 PDMS를 칩으로 부드럽게 덮고 전체 패턴이 중간 PDMS의 큰 타원형 개구부의 중앙 영역에 노출되는지 확인합니다. 상단 PDMS를 중간 PDMS로 덮고 중간 PDMS의 큰 타원형 구멍 영역 내에 두 개의 작은 구멍을 유지하십시오.이어서, PDMS 챔버가 조립된다. 피펫으로 상단 PDMS의 두 개의 작은 구멍 중 하나에서 SUV를 PDMS 채널로 로드하고 실온에서 15분 동안 배양하여 SLB를 형성합니다. PBS 버퍼를 작은 구멍의 한쪽에서 PDMS 채널로 부드럽게 피펫팅하고 다른 구멍에서 면봉으로 폐기물을 제거하여 바인딩되지 않은 SUV를 씻어냅니다.그런 다음 나노 칩 상에 형성된 SLB를 획득한다. 100 x 오일 대물렌즈를 사용하여 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 설정합니다. Zen 소프트웨어를 열어 지질과 단백질의 형광을 자극할 수 있는 여기 레이저 출력을 선택합니다.획득 모드를 선택합니다. 그런 다음 스마트 설정을 클릭한 다음 Texas Red를 클릭합니다. 초점 노브로 초점을 조정하여 나노 막대 가장자리가 지질 채널 아래에서 날카로워질 때까지 칩의 나노 막대를 찾습니다.단백질을 추가하기 전에 지질 채널의 제어 이미지를 얻기 위해 스캐닝 파라미터를 설정합니다. 임의의 단일 나노바 영역에서 형광 표지된 지질 이중층으로 표백하여 FRAP 분석을 수행합니다. 실험 영역 및 표백 확인란을 선택합니다.중앙에 전체 나노 바를 포함 할 수있는 직경 5 마이크로 미터의 원형 영역을 그리고 실험 영역에 추가합니다. 타임랩스 이미징 파라미터를 입력합니다. 시계열을 선택합니다.그런 다음 기간을 클릭합니다. 100 사이클과 2초와 같은 간격을 선택합니다. 표백 매개 변수를 입력합니다.FRAP를 수행하는 레이저 확인란을 선택하고 전원을 100%로 변경합니다. FRAP 실험에 대해 실험 시작을 클릭합니다. 단백질 용액을 PDMS 채널 내로 로딩하고 SLB 상의 단백질의 결합을 허용하기 위해 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 나노바의 초점을 다시 맞추고 스캐닝 파라미터를 설정하여 단백질 곡률 감지 감지를 위해 지질 및 단백질 채널의 이미지를 촬영합니다.실험 영역을 선택하고 지질 및 단백질 채널 모두에서 FRAP 분석을 수행하고 TimeLapse 이미징을 수행하여 곡률 감지 단백질의 이동성을 특성화합니다. 둘 다 300 나노 미터 너비의 SLB 코팅 된 개별 나노 바의 끝 부분에 증가 된 축적을 보여줍니다. 여기서 SLB는 단백질 결합을 정전기적으로 향상시키기 위해 10%PS를 포함합니다.두 단백질 모두 지질보다 말단 대 중심 비율이 높으며 이는 약 1입니다. IDR FBP17과 F-Bar를 비교할 때 IDR FBP17의 더 높은 끝 대 중심 비율은 F-Bar보다 더 강한 곡률 감지를 나타냅니다. 3 개의 단백질 모두 직경이 400 나노 미터 이하로 감소했을 때 곡률이 감소 할 때 나노 바 말단 곡선 막 부위에서 우선적 인 축적을 보였다.이 세 가지 단백질 도메인 중에서 IDR FBP17은 가장 높은 나노 바 및 밀도를 제공하여 가장 강한 곡률 감지 능력을 나타내는 반면 F-Bar는 가장 낮은 값을 나타냅니다. 단백질 결합 곡선은 IDR FBP17이 강한 협력 곡률 감지 능력을 가지고 있음을 보여주는 단백질 농도를 점진적으로 증가시켜 플롯 할 수 있습니다. 나노바에서 지질 신호의 빠른 회복과 비교할 때, F-Bar는 2분 이내에 회복할 수 없으며, 이는 곡선 막 부위에서 막 이동성과 결합 역학이 크게 감소했음을 시사합니다.놀랍게도, F-Bar의 거동과는 달리, IDR FBP17 신호는 동일한 기간 내에 명백한 회복을 보여 주며, 이는 곡선 멤브레인에 축적 된 IDR FBP17의 동적 특성을 나타냅니다. 그러나 솔루션에서 언바운드 IDR FBP17을 씻어낸 후 IDR FBP17 채널에서 이전과 동일한 복구가 관찰되지 않았습니다. SLB 품질은 곡곡 막과 단백질 간의 상호 작용을 연구 할 때 매우 중요합니다.따라서 FRAP 테스트는 멤브레인 이동성을 검증하기 위해 실험에서 필요합니다. 이 시스템은 연구자들이 곡률 감지 도메인 및 지질 조성과 같은 곡선 막과의 단백질 상호 작용에 영향을 미치는 다양한 매개 변수를 연구하고 얼굴 분리 거동과 같은 곡선 막에 대한 동적 연구를 수행하는 데 도움이 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

세제 없는 보완 청구 Proteoliposomes Fusogenic를 사용 하 여 지질 Bilayers에 막 단백질의 초고속 재구성.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, 간소화 된 단백질 결합 검정을 위한 생체 면역 펩티디스크에 막 단백질의 한 단계 통합

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...