Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

Vi takker Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) og Senter for forstyrrende fotoniske teknologier (CDPT) ved Nanyang Technological University (NTU) for å støtte nanostrukturfabrikasjon og SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) ved School of Biological Sciences NTU for proteinrensing, og School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for konfokalmikroskopet. Dette arbeidet er finansiert av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 og MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) støttet av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-ordningen (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for forskningsstipendet (X. Miao), og China Scholarship Council for forskningsstipendet (J. Wu).

1. Rengjøring av nanochip
<ol><li>Plasser nanobrikken i et 10 ml beger med den mønstrede siden vendt opp. MERK: Denne kvarts nanochip har blitt produsert via elektronstrålelitografi som beskrevet før21. Geometrien og arrangementet av nanostrukturen på brikken kan tilpasses. Størrelsene på gradient nanobarer som brukes her er 2000 nm i lengde, 600 nm i høyde og 100 til 1000 nm i bredde (100 nm trinnsett).</li>
	<li>Tilsett forsiktig 1 ml 98% svovelsyre til beg...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Nanobar-SLB-systemet beskrevet her tilbyr en unik kombinasjon av fordelene i flere eksisterende in vitro-analyser. Det avslører effektivt den foretrukne bindingen av proteiner til høyt buede membraner som liposomflytning eller sedimenteringsanalyse, men krever mye færre prøver og gir mer nøyaktig definert krumning på individuelle nanobarer 8,29. Det tilbyr også et bredt spekter av nøyaktig kontrollert krumning for samtidig sammenligning som SLiC-...

Membrankrumning er en kritisk fysisk parameter for en celle som forekommer i en rekke cellulære prosesser som morfogenese, celledeling og cellemigrasjon1. Det er allment anerkjent nå at membrankrumning er utenfor et enkelt resultat av cellulære hendelser; I stedet har det dukket opp som en effektiv regulator av proteininteraksjoner og intracellulær signalering. For eksempel ble flere proteiner involvert i clathrin-mediert endocytose funnet å fortrinnsvis binde seg til den buede membranen, noe som resulterte i dannelsen av et hotspot for endocytose2. Det er mange forskjellige årsaker til membrandeformasjon som membrantrekking av cytoskeletale krefter, tilstedeværelsen av lipidasymmetri med forskjellige størrelseshodegrupper, eksistensen av transmembranproteiner med konisk form, akkumulering av membranformende proteiner som BAR-domeneproteiner (oppkalt etter Bin, amfifysin og Rvs-proteiner) og innsetting av amfipatiske helices-domenet i membranen1 . Interessant nok deformerer disse proteinene og lipidene ikke bare membranen, men kan også fornemme membrankrumningen og utvise fortrinnsrettakkumulering 1. Derfor er det avgjørende å studere om og hvordan membraner med forskjellige krumninger endrer fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider festet til dem og de potensielle effektene på de relaterte intracellulære prosessene.
Mange teknikker er utviklet for å analysere samspillet mellom buet membran og proteiner i både levende celler og in vitro-systemer. Det levende cellesystemet gir et ekte cellemiljø med rikt lipiddiversitet og dynamisk proteinsignalregulering 2,3,4,5,6,7. Et slikt sofistikert system er imidlertid vanskelig å studere på grunn av usikkerhetene og svingningene i det intracellulære miljøet. Derfor har in vitro-analysene ved bruk av en kunstig membran sammensatt av kjente lipidarter og rensede proteiner blitt kraftige rekonstitueringssystemer for å karakterisere forholdet mellom proteiner og buede membraner. Tradisjonelt genereres liposomer med forskjellige diametre ved ekstrudering for å oppdage krumningsfølsomme proteiner via enten en ko-sedimenteringsanalyse ved bruk av sentrifugalkraft eller en samflotasjonsanalyse med en tetthetsgradient for å unngå proteinaggregering 8,9. Krumningen til de ekstruderte liposomene er imidlertid begrenset av den tilgjengelige porestørrelsen til membranfilteret som brukes i ekstruderen10. Enkelt liposomkurvatur (SLiC) -analyse har vist seg å overvinne denne begrensningen, der liposomer med forskjellige diametre er fluorescensmerket og immobilisert på overflaten slik at krumningen kan markeres med fluorescerende intensitet11. Imidlertid er det observert sterk variasjon i lipidsammensetningen i små vesikler, noe som påvirker nøyaktigheten av krumningsmålingen12. Tether-pulling eksperimenter gir en mer nøyaktig måling av krumningen på den forbigående tether trukket fra gigantiske unilamellar vesikler (GUVs) ved hjelp av en optisk pinsett, hvor krumningen kan styres godt av membranspenningen generert13,14. Denne metoden er egnet til å studere enten positive eller negative krumningsfølende proteiner, men er begrenset av gjennomstrømningen av rørgenerering10. Støttede membranrør (SMrT) -analyse gir samtidig generering av flere membranrør som ekstruderes fra samme lipidreservoar ved mikrofluidiske strømmer. Likevel varierer membrankrumningen iboende langs nanorøret, noe som kompromitterer nøyaktigheten av fluorescensintensitetsbasert krumningsmåling15,16. Til sammenligning genererte bruk av små unilamellære vesikler (SUVer, diameter <100 nm17) for å danne et støttet lipid dobbeltlag (SLB) på overflater som inneholder designede topografier en enkelt dobbeltlagsmembran med krumninger forhåndsbestemt av nanofabrikasjon eller nanomaterialer med høy nøyaktighet18,19,20.
Her presenterer vi en protokoll for dannelsen av SLB på fabrikkerte nanochipflater med nanobararrayer og hvordan den kan brukes til å undersøke krumningsfølsomheten til proteiner in vitro. Som vist i figur 1, er det seks viktige komponenter i analysen: A) Rengjøring og montering av brikken med et mikrofluidisk kammer; B) Fremstilling av SUVer med definert lipidsammensetning; C) Dannelse av SLB på en nanochip og binding med krumningsfølsomme proteiner; D) Avbildning og karakterisering av SLB og krumningsfølsomme proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengjøring av brikken for gjenbruk; F) Bildebehandling for kvantitativ analyse av proteinkrumningssensorevne. Den detaljerte protokollen er beskrevet trinn for trinn nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

Membrankrumning spiller viktige roller i ulike essensielle prosesser av celler, for eksempel cellemigrasjon, celledeling og vesikkelhandel. Det genereres ikke bare passivt av cellulære aktiviteter, men regulerer også aktivt proteininteraksjoner og er involvert i mange intracellulære signaleringer. Dermed er det av stor verdi å undersøke rollen som membrankrumning i regulering av fordelingen og dynamikken til proteiner og lipider. Nylig har mange teknikker blitt utviklet for å studere forholdet mellom den buede membranen og protein in vitro. Sammenlignet med tradisjonelle teknikker tilbyr det nyutviklede nanobar-støttede lipid-dobbeltlaget (SLB) både høy gjennomstrømning og bedre nøyaktighet i membrankrumningsgenerering ved å danne et kontinuerlig lipid-dobbeltlag på mønstrede arrays av nanobarer med en forhåndsdefinert membrankrumning og lokal flat kontroll. Både lipidfluiditeten og proteinfølsomheten for buede membraner kan kvantitativt karakteriseres ved hjelp av fluorescensmikroskopiavbildning. Her introduseres en detaljert prosedyre for hvordan man danner en SLB på fabrikkerte glassflater som inneholder nanobararrayer og karakterisering av krumningsfølsomme proteiner på slike SLB. I tillegg dekkes protokoller for gjenbruk av nanobrikker og bildebehandling. Utover nanobar-SLB, er denne protokollen lett anvendelig for alle typer nanostrukturerte glassbrikker for krumningssensorstudier.

Nanobardesign anbefales for sondering av positive krumningsfølende proteiner, som inneholder en halvsirkel i hver ende med krumning definert av nanobarbredden og en flat/null krumningskontroll lokalt i midten (figur 2A, B). Vellykket dannelse av SLB på nanobarer resulterer i jevnt fordelte lipidmarkørsignaler over hele nanobaroverflaten som vist i figur 2C. Signaler fra flere nanobarer kan kombineres ved å beregne gjennomsnittet av de enkelt...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Her er et nanobar-støttet lipid dobbeltlagssystem utviklet for å gi en syntetisk membran med en definert krumning som muliggjør karakterisering av proteiner med krumningsfølerevne in vitro.

Et nanobar-støttet lipid dobbeltlagssystem for studier av membrankrumningsfølende proteiner in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Dette nanobar-støttede lipid-dobbeltlagssystemet kan brukes til å studere rollen som membrankrumning i regulering av dynamikken og fordelingen av protein og lipider under celleaktiviteter. Denne teknikken gir både høy subrot og dårlig i membrankrumningsgenereringen ved å danne et kontinuerlig lipid dobbeltlag på patent nanobarfeil med membrankrumning forhåndsdefinert ved høyoppløselig nanofabrikasjon. For å begynne, plasser nanobrikken i et 10 milliliter beger med mønstersiden vendt opp.Tilsett forsiktig en milliliter 98% svovelsyre til begeret og sørg for at syren dekker forsiden og baksiden av brikken fullt ut. Roter begeret sakte og tilsett 200 mikroliter 30% hydrogenperoksid dråpe for dråpe til hele begeret blir varmt. Sørg for at svovelsyre og hydrogenperoksid blandes godt for å danne Piranha-løsning for fjerning av organiske molekyler fra nanobrikken.Plasser begeret i en sekundær glassbeholder og hold nanobrikken nedsenket i Piranha-løsningen over natten for å rengjøre urenhetene grundig. Ta begeret ut og pipetter Piranha-løsningen forsiktig i en syreavfallsbeholder. Last fem milliliter avionisert vann inn i begeret for å fortynne restsyren og kast den i syreavfallet.Gjenta dette trinnet fem ganger. Ta tak i brikken med pinsett og vask med en kontinuerlig strøm av avionisert vann for å fjerne gjenværende syre grundig. Blås brikken med 99,9 % nitrogengass for SLB-dannelse.Sonicate lipidblandingen i 30 minutter. Frys lipidblandingen i flytende nitrogen i 20 sekunder og tine deretter ved 42 grader Celsius i to minutter i et vannbad. Gjenta fryse-/tinesyklusene 30 ganger.Etter det ser lipidblandingen ut som en klar væske. Pass lipidblandingen gjennom miniekstruderen og ekstruder frem og tilbake 20 ganger. Samle SUVene fra sprøyten på den andre siden for å redusere forurensningen med større partikler eller fremmedlegemer, og overfør den til et 1,5 milliliter sentrifugerør.Ta ut den rensede nanobrikken fra avionisert vann forsiktig med en pinsett og tørk med 99,9% nitrogengass. Utfør overflaterengjøring av nanobrikken med luftplasmabehandling i en time. Sett sammen nanobrikken i et PDMS-kammer.Begynn med å plassere brikken på en ren overflate med mønsteret vendt opp. Dekk forsiktig den midterste PDMS med brikken og sørg for at hele mønsteret blir utsatt for det sentrale området av den store ovalformede åpningen i midten av PDMS. Dekk den øverste PDMS med den midterste PDMS og hold de to små hullene i regionen av det store ovale hullet i midten av PDMS.Deretter monteres PDMS-kammeret. Last SUV-ene inn i PDMS-kanalen fra et av de to små hullene i topp-PDMS med en pipette og rug i 15 minutter ved romtemperatur for å danne SLB. Pipetter PBS-bufferen forsiktig inn i PDMS-kanalen fra den ene siden av det lille hullet og fjern avfallet med en bomullspinne fra det andre hullet for å vaske bort de ubundne SUV-ene.Skaff deg deretter SLB dannet på nanobrikken. Sett opp laserskanning konfokal mikroskopi ved hjelp av et 100 x oljemål. Åpne Zen-programvaren for å velge eksitasjonslaserkraften som kan opphisse fluorescensen av lipid og protein.Velg Brukeranskaffelsesmodus. Klikk deretter Smart oppsett, etterfulgt av Texas Red. Juster fokuset med fokusknappen for å finne nanostengene på brikken til nanostangkantene er skarpe under lipidkanalen.Still inn skanneparametrene for å få et kontrollbilde av lipidkanalen før du tilsetter protein. Utfør FRAP-analysen ved å bleke med fluorescerende merket lipid dobbeltlag på et tilfeldig enkelt nanobarområde. Merk av for Eksperimentregioner og Bleking.Tegn et sirkulært område med fem mikrometer diameter som kan inkludere hele nanobaren i midten, og legg til eksperimentområdene. Inndata TimeLapse-bildeparametere. Velg Tidsserier.Klikk deretter Varighet. Velg 100 sykluser og intervall lik to sekunder. Skriv inn blekeparametere.Merk av for laseren som utfører FRAP, og endre effekten til 100 %Klikk Start eksperiment for FRAP-eksperimentet. Fyll proteinoppløsningen inn i PDMS-kanalen og inkuber i fem minutter ved romtemperatur for å tillate binding av proteinet på SLB. Fokuser nanobarene på nytt og still inn skanneparametrene for å ta bilder av både lipid- og proteinkanaler for proteinkrumningsdeteksjon.Velg Eksperimentregioner og utfør FRAP-analysen på både lipid- og proteinkanaler, og utfør TimeLapse-avbildning for å karakterisere mobiliteten til krumningsfølende protein. Begge viser økt akkumulering på slutten av SLB-belagte individuelle nanobarer med 300 nanometer bredde. Her inneholder SLB 10% PS for å elektrostatisk forbedre proteinbindingen.Begge proteinene har et høyere ende-til-senter-forhold enn lipider, som er rundt en. Når man sammenligner IDR FBP17 og F-Bar, indikerer det høyere ende-til-senter-forholdet mellom IDR FBP17 sterkere krumningssensor enn F-Bar. Alle tre proteinene viste fortrinnsrett akkumulering på nanobar ende buede membransteder når krumningen reduserte under 400 nanometer i diameter.Blant disse tre proteindomenene gir IDR FBP17 den høyeste nanobaren og tettheten, noe som indikerer den sterkeste krumningssensorevnen, mens F-Bar viser den laveste verdien. Proteinbindingskurve kan plottes ved gradvis å øke proteinkonsentrasjonen som viser at IDR FBP17 har en sterk kooperativ krumningssensorevne. Sammenlignet med rask gjenoppretting av lipidsignaler på nanobarer, kan F-Bar ikke gjenopprette innen to minutter, noe som tyder på dens betydelig reduserte membranmobilitet og assosiasjonsdynamikk på de buede membranstedene.Overraskende, forskjellig fra oppførselen til F-Bar, viste IDR FBP17-signaler åpenbar gjenoppretting innen samme tidsramme, noe som indikerer den dynamiske naturen til IDR FBP17 akkumulert ved de buede membranene. Etter å ha vasket bort den ubundne IDR FBP17 i løsningen, kunne imidlertid ikke den samme gjenopprettingen i IDR FBP17-kanalen observeres som før. SLB-kvaliteten er svært viktig når man studerer samspillet mellom buet membran og protein.Så FRAP-testen er nødvendig i vårt eksperiment for å validere membranmobiliteten. Dette systemet vil hjelpe forskerne til å studere ulike parametere som påvirker proteininteraksjonen med den buede membranen, for eksempel krumningssensordomenene og lipidsammensetningen, samt å gjennomføre de dynamiske studiene på buet membran som ansiktsseparasjonsadferd.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Nitrogen kavitasjon og differensial sentrifugering tillater overvåking fordelingen av ytre membran proteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av lipoprotein partikler fra Chicken egg eggeplomme for studier av bakteriell patogen fatty acid innlemmelse i membran fosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, en ett-trinns innlemmelse av membran proteiner i Biotinylated Peptidiscs for strømlinjeformet protein bindende analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membran Nanopartikler System for membran Protein-Protein Interaksjon Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...