Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
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Agradecemos ao Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e ao Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) da Nanyang Technological University (NTU) por apoiar a fabricação de nanoestruturas e imagens MEV, a Plataforma de Produção de Proteínas (PPP) da Escola de Ciências Biológicas da NTU para purificação de proteínas e a Escola de Engenharia Química e Biomédica NTU para o microscópio confocal. Este trabalho é financiado pelo Ministério da Educação de Singapura (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), pelo Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) apoiado pelo financiamento do MOE ao abrigo do esquema Research Centres of Excellence (W. Zhao), pela Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), pela NTU Start-up Grant (W. Zhao), Escola de Engenharia Química e Biomédica NTU para a bolsa de pesquisa (X. Miao), e Conselho de Bolsas de Estudo da China para a bolsa de pesquisa (J. Wu).

1. Limpeza de nanochip
<ol><li>Coloque o nanochip em um copo de 10 mL com o lado padronizado voltado para cima. NOTA: Este nanochip de quartzo foi fabricado através de litografia por feixe de elétrons, conforme descrito antesdo 21. A geometria e o arranjo da nanoestrutura no chip podem ser projetados sob medida. Os tamanhos das nanobarras de gradiente usadas aqui são de 2000 nm de comprimento, 600 nm de altura e 100 a 1000 nm de largura (conjunto de degraus de 100...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

O sistema nanobar-SLB descrito aqui oferece uma combinação única das vantagens em vários ensaios in vitro existentes. Revela eficientemente a ligação preferencial de proteínas a membranas altamente curvas como o ensaio de flutuação ou sedimentação de lipossomas, mas requer muito menos amostras e oferece curvatura mais precisamente definida em nanobarras individuais 8,29. Ele também oferece uma ampla gama de curvatura precisamente controlada p...

A curvatura da membrana é um parâmetro físico crítico de uma célula que ocorre em uma variedade de processos celulares, como morfogênese, divisão celular e migração celular1. É amplamente reconhecido agora que a curvatura da membrana está além de um simples resultado de eventos celulares; em vez disso, emergiu como um regulador eficaz das interações proteicas e da sinalização intracelular. Por exemplo, várias proteínas envolvidas na endocitose mediada por clatrina se ligam preferencialmente à membrana curva, resultando na formação de um hotspot para endocitose2. Existem muitas causas diferentes de deformação da membrana, como a tração da membrana pelas forças do citoesqueleto, a presença de assimetria lipídica com grupos de cabeça de diferentes tamanhos, a existência de proteínas transmembranares com forma cônica, o acúmulo de proteínas modeladoras de membrana, como proteínas do domínio BAR (nomeadas após as proteínas Bin, anfifisina e Rvs) e a inserção do domínio das hélices anfipáticas na membrana1 . Curiosamente, essas proteínas e lipídios não apenas deformam a membrana, mas também podem sentir a curvatura da membrana e exibir acúmulo preferencial1. Portanto, é crucial estudar se e como membranas com diferentes curvaturas alteram a distribuição e a dinâmica de proteínas e lipídios ligados a elas e os impactos potenciais nos processos intracelulares relacionados.
Muitas técnicas foram desenvolvidas para analisar a interação entre membrana curva e proteínas em sistemas celulares vivos e in vitro. O sistema celular vivo proporciona um ambiente celular real com rica diversidade lipídica e regulação dinâmica da sinalização proteica 2,3,4,5,6,7. No entanto, um sistema tão sofisticado é difícil de estudar devido às incertezas e flutuações no ambiente intracelular. Assim, os ensaios in vitro utilizando uma membrana artificial composta por espécies lipídicas conhecidas e proteínas purificadas tornaram-se poderosos sistemas de reconstituição para caracterizar a relação entre proteínas e membranas curvas. Tradicionalmente, lipossomas de diferentes diâmetros são gerados por extrusão para detectar proteínas sensíveis à curvatura por meio de um ensaio de co-sedimentação usando força centrífuga ou um ensaio de co-flotação com um gradiente de densidade para evitar a agregação de proteínas 8,9. No entanto, a curvatura dos lipossomas extrudados é limitada pelo tamanho dos poros disponíveis do filtro de membrana utilizado na extrusora10. Está comprovado que o ensaio de curvatura de lipossomo único (SLiC) supera essa limitação, no qual lipossomas com diferentes diâmetros são marcados com fluorescência e imobilizados na superfície para que a curvatura possa ser marcada pela intensidade fluorescente11. Entretanto, tem sido observada forte variabilidade na composição lipídica em pequenas vesículas, o que afeta a acurácia da medida da curvatura12. Experimentos de puxar amarração fornecem uma medida mais precisa da curvatura na corda transitória puxada de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) usando um tweezer óptico, onde a curvatura pode ser bem controlada pela tensão da membrana gerada13,14. Este método é adequado para estudar proteínas de detecção de curvatura positiva ou negativa, mas é limitado pelo rendimento da geração de tubos10. O ensaio de tubos de membrana suportados (SMrT) permite a geração simultânea de múltiplos tubos de membrana que são extrudados do mesmo reservatório lipídico por fluxos microfluídicos. No entanto, a curvatura da membrana varia intrinsecamente ao longo do nanotubo, o que compromete a precisão da medida da curvatura baseada na intensidade de fluorescência15,16. Em comparação, a utilização de pequenas vesículas unilamelares (SUVs, diâmetro <100 nm17) para formar uma bicamada lipídica suportada (SLB) em superfícies contendo topografias projetadas gerou uma única membrana bicamada com curvaturas predeterminadas por nanofabricação ou nanomateriais em alta precisão18,19,20.
Aqui, apresentamos um protocolo para a formação do SLB em superfícies de nanochips fabricadas com matrizes de nanobarras e como ele pode ser usado para sondar a sensibilidade à curvatura de proteínas in vitro. Como mostra a Figura 1, existem seis componentes essenciais do ensaio: A) Limpeza e montagem do chip com câmara microfluídica; B) Preparação de SUVs com composição lipídica definida; C) Formação do SLB em nanochip e ligação com proteínas sensíveis à curvatura; D) Imagem e caracterização do SLB e proteínas sensíveis à curvatura sob microscopia de fluorescência; E) Limpeza do chip para reutilização; F) Processamento de imagens para análise quantitativa da capacidade de detecção da curvatura de proteínas. O protocolo detalhado é descrito passo a passo abaixo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

A curvatura da membrana desempenha papéis importantes em vários processos essenciais das células, como migração celular, divisão celular e tráfico de vesículas. Não é apenas gerado passivamente por atividades celulares, mas também regula ativamente as interações proteicas e está envolvido em muitas sinalizações intracelulares. Assim, é de grande valor examinar o papel da curvatura da membrana na regulação da distribuição e dinâmica de proteínas e lipídios. Recentemente, muitas técnicas foram desenvolvidas para estudar a relação entre a membrana curva e a proteína in vitro. Em comparação com as técnicas tradicionais, a recém-desenvolvida bicamada lipídica suportada por nanobarras (SLB) oferece alto rendimento e melhor precisão na geração de curvatura de membrana, formando uma bicamada lipídica contínua em matrizes padronizadas de nanobarras com uma curvatura de membrana pré-definida e controle plano local. Tanto a fluidez lipídica quanto a sensibilidade proteica a membranas curvas podem ser quantitativamente caracterizadas usando microscopia de fluorescência. Aqui, um procedimento detalhado sobre como formar um SLB em superfícies de vidro fabricadas contendo matrizes de nanobarras e a caracterização de proteínas sensíveis à curvatura em tal SLB são introduzidos. Além disso, os protocolos para reutilização de nanochips e processamento de imagens são cobertos. Além do nanobar-SLB, este protocolo é prontamente aplicável a todos os tipos de chips de vidro nanoestruturados para estudos de detecção de curvatura.

O projeto de nanobar é recomendado para sondar proteínas de detecção de curvatura positiva, que contém um meio círculo em cada extremidade com curvatura definida pela largura da nanobarra e um controle de curvatura plana/zero localmente no centro (Figura 2A,B). A formação bem-sucedida do SLB em nanobarras resulta em sinais de marcadores lipídicos distribuídos uniformemente em toda a superfície do nanobar, como mostrado na Figura 2C. O...

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A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Aqui, um sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar é desenvolvido para fornecer uma membrana sintética com uma curvatura definida que permite a caracterização de proteínas com capacidade de detecção de curvatura in vitro.

Um Sistema de Bicamada Lipídica Suportado por Nanobar para o Estudo de Proteínas de Detecção de Curvatura de Membrana in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Este sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar pode ser usado para estudar o papel da curvatura da membrana na regulação da dinâmica e distribuição de proteínas e lipídios durante as atividades celulares. Esta técnica oferece alta sub-raiz e ruim na geração de curvatura da membrana, formando uma bicamada lipídica contínua em erros de nanobar patente com curvatura de membrana predefinida por nanofabricação de alta resolução. Para começar, coloque o nano chip em um copo de 10 mililitros com o lado do padrão voltado para cima.Adicione cuidadosamente um mililitro de ácido sulfúrico a 98% ao copo e certifique-se de que o ácido cubra totalmente a parte frontal e traseira do chip. Gire lentamente o copo e adicione 200 microlitros de peróxido de hidrogênio a 30% gota a gota até que todo o copo fique quente. Certifique-se de que o ácido sulfúrico e o peróxido de hidrogênio estejam bem misturados para formar a solução de piranha para a remoção de moléculas orgânicas do nanochip.Coloque o copo em um recipiente de vidro secundário e mantenha o nano chip imerso na solução de piranha durante a noite para limpar bem as impurezas. Retire o copo e pipete cuidadosamente a solução de piranha para um recipiente de resíduos ácidos. Carregue cinco mililitros de água deionizada no copo para diluir o ácido residual e descartá-lo nos resíduos ácidos.Repita esta etapa cinco vezes. Pegue o chip com uma pinça e lave com um fluxo contínuo de água deionizada para remover completamente o ácido residual. Seque o cavaco com gás nitrogênio a 99,9% para formação de SLB.Sonicate a mistura lipídica por 30 minutos. Congele a mistura lipídica em nitrogênio líquido por 20 segundos e depois descongele a 42 graus Celsius por dois minutos em banho-maria. Repita os ciclos de congelamento/descongelamento 30 vezes.Depois disso, a mistura lipídica parece um líquido claro. Passe a mistura lipídica através da mini extrusora e extrudir para frente e para trás 20 vezes. Recolha os SUVs da seringa do outro lado para reduzir a contaminação com partículas maiores ou material estranho e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.Retire cuidadosamente o nanochip limpo da água deionizada com um par de pinças e seque com gás nitrogênio a 99,9%. Realize a limpeza da superfície do nanochip com tratamento a plasma de ar por uma hora. Monte o nano chip em uma câmara PDMS.Comece colocando o chip em uma superfície limpa com o padrão voltado para cima. Cubra suavemente o PDMS médio com o chip e certifique-se de que todo o padrão esteja exposto à área central da grande abertura oval no PDMS médio. Cubra o PDMS superior com o PDMS médio e mantenha seus dois pequenos orifícios dentro da região do grande orifício oval do PDMS médio.Em seguida, a câmara PDMS é montada. Carregue os SUVs no canal PDMS a partir de um dos dois pequenos orifícios no PDMS superior com uma pipeta e incube por 15 minutos à temperatura ambiente para formar o SLB. Pipete suavemente o tampão PBS para o canal PDMS de um lado do pequeno orifício e remova os resíduos com um cotonete do outro orifício para lavar os SUVs não ligados.Em seguida, adquira o SLB formado no nano chip. Configure a microscopia confocal de varredura a laser usando uma objetiva de óleo de 100 x. Abra o software Zen para selecionar a potência do laser de excitação que pode excitar a fluorescência do lipídio e da proteína.Escolha Modo de aquisição. Em seguida, clique em Smart Setup, seguido por Texas Red. Ajuste o foco com o botão de foco para localizar as nano barras no chip até que as bordas da nanobarra estejam afiadas sob o canal lipídico.Defina os parâmetros de varredura para obter uma imagem de controle do canal lipídico antes de adicionar proteína. Realizar o ensaio FRAP por branqueamento com bicamada lipídica marcada fluorescente em uma única área de nanobar aleatória. Marque as caixas de seleção Regiões do experimento e branqueamento.Desenhe uma área circular de cinco micrômetros de diâmetro, que pode incluir toda a nanobarra no centro, e adicione às regiões do experimento. Parâmetros de imagem TimeLapse de entrada. Escolha Série temporal.Em seguida, clique em Duração. Selecione 100 ciclos e intervalo igual a dois segundos. Parâmetros de branqueamento de entrada.Marque as caixas de seleção a laser que executam o FRAP e altere a energia para 100%Clique em Iniciar Experimento para o experimento FRAP. Carregar a solução proteica no canal PDMS e incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente para permitir a ligação da proteína no SLB. Reoriente as nanobarras e defina os parâmetros de varredura para tirar imagens de canais lipídicos e proteicos para detecção de detecção de curvatura de proteínas.Selecione Regiões do Experimento e conduza o ensaio FRAP em ambos os canais lipídicos e proteicos, e realize imagens TimeLapse para caracterizar a mobilidade da proteína de detecção de curvatura. Ambos mostram maior acúmulo na extremidade de nanobarras individuais revestidas de SLB com 300 nanômetros de largura. Aqui o SLB contém 10%PS para melhorar eletrostaticamente a ligação às proteínas.Ambas as proteínas têm uma maior relação extremo-centro do que os lipídios, que é em torno de um. Ao comparar o IDR FBP17 e o F-Bar, a maior relação extremo-centro do IDR FBP17 indica uma detecção de curvatura mais forte do que a F-Bar. Todas as três proteínas apresentaram acúmulo preferencial nos sítios de membrana curva da extremidade da nanobarra quando a curvatura diminuiu abaixo de 400 nanômetros de diâmetro.Entre esses três domínios proteicos, o IDR FBP17 fornece a maior nano barra e densidade, indicando sua maior capacidade de detecção de curvatura, enquanto o F-Bar mostra o menor valor. A curva de ligação às proteínas pode ser plotada aumentando gradualmente a concentração de proteínas, o que mostra que o IDR FBP17 tem uma forte capacidade de detecção de curvatura cooperativa. Em comparação com a rápida recuperação de sinais lipídicos em nanobares, a F-Bar não pode se recuperar dentro de dois minutos, sugerindo sua mobilidade de membrana significativamente diminuída e dinâmica de associação nos locais de membrana curva.Surpreendentemente, diferente do comportamento da F-Bar, os sinais IDR FBP17 mostraram recuperação óbvia dentro do mesmo período de tempo, indicando a natureza dinâmica do IDR FBP17 acumulado nas membranas curvas. No entanto, depois de lavar o IDR FBP17 não ligado na solução, a mesma recuperação no canal IDR FBP17 não pôde ser observada como antes. A qualidade do SLB é muito importante quando se estuda a interação entre membrana curva e proteína.Portanto, o teste FRAP é necessário em nosso experimento para validar a mobilidade da membrana. Este sistema ajudará os pesquisadores a estudar vários parâmetros que afetam a interação da proteína com a membrana curva, como os domínios de detecção de curvatura e a composição lipídica, bem como a realizar estudos dinâmicos sobre a membrana curva, como comportamentos de separação facial.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cavitação de nitrogênio e centrifugação diferencial permite o monitoramento da distribuição de proteínas de membrana periférica em culturas de células

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, uma incorporação de um passo de proteínas da membrana em Peptidiscs biotinylated para ensaios obrigatórios de proteína aerodinâmica

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...