Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

Мы благодарим Наньянский нанофабрикационный центр (N2FC) и Центр прорывных фотонных технологий (CDPT) в Наньянском технологическом университете (NTU) за поддержку изготовления наноструктур и визуализации SEM, Платформу производства белка (PPP) в Школе биологических наук NTU для очистки белка и Школу химической и биомедицинской инженерии NTU за конфокальный микроскоп. Эта работа финансируется Министерством образования Сингапура (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 и MOE-T2EP30220-0009), Институтом цифровой молекулярной аналитики и науки (IDMxS), поддерживаемым финансированием MOE по схеме Исследовательских центров передового опыта (W. Zhao), Фондом Human Frontier Science Program (W. Zhao, RGY0088/2021), Грантом NTU Start-up Grant (W. Zhao), Школа химической и биомедицинской инженерии NTU для исследовательской стипендии (X. Miao) и China Scholarship Council для исследовательской стипендии (J. Wu).

1. Очистка наночипа
<ol><li>Поместите наночип в стакан объемом 10 мл с узорчатой стороной вверх. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот кварцевый наночип был изготовлен с помощью электронно-лучевой литографии, как описано выше21. Геометрия и расположение наноструктуры на чипе могут б...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Система nanobar-SLB, описанная здесь, предлагает уникальное сочетание преимуществ в нескольких существующих анализах in vitro. Он эффективно выявляет предпочтительное связывание белков с сильно изогнутыми мембранами в качестве анализа липосомной флоатации или седиментации, но требует г...

Кривизна мембраны является критическим физическим параметром клетки, который происходит в различных клеточных процессах, таких как морфогенез, деление клеток и миграция клеток1. В настоящее время широко признано, что кривизна мембраны выходит за рамки простого результата клеточных событий; вместо этого он стал эффективным регулятором белковых взаимодействий и внутриклеточной сигнализации. Например, было обнаружено, что несколько белков, участвующих в клатрин-опосредованном эндоцитозе, предпочтительно связываются с изогнутой мембраной, что приводит к образованию горячей точки для эндоцитоза2. Существует много различных причин деформации мембраны, таких как притяжение мембраны цитоскелетными силами, наличие асимметрии липидов с различными по размеру головными группами, существование трансмембранных белков с конической формой, накопление мембранообразующих белков, таких как белки BAR-домена (названные в честь белков Bin, amphiphysin и Rvs), и вставка домена амфипатических спиралей в мембрану1 . Интересно, что эти белки и липиды не только деформируют мембрану, но также могут ощущать искривление мембраны и проявлять предпочтительное накопление1. Поэтому крайне важно изучить, изменяют ли мембраны с различными кривизнами распределение и динамику белков и липидов, прикрепленных к ним, и потенциальное воздействие на связанные внутриклеточные процессы.
Многие методы были разработаны для анализа взаимодействия между изогнутой мембраной и белками как в живых клетках, так и в системах in vitro. Система живых клеток обеспечивает реальную клеточную среду с богатым липидным разнообразием и динамической регуляцией передачи сигналов белка 2,3,4,5,6,7. Однако такую сложную систему трудно изучать из-за неопределенностей и флуктуаций во внутриклеточной среде. Следовательно, анализы in vitro с использованием искусственной мембраны, состоящей из известных видов липидов и очищенных белков, стали мощными системами восстановления для характеристики отношений между белками и изогнутыми мембранами. Традиционно липосомы различного диаметра генерируются экструзией для обнаружения чувствительных к кривизне белков либо с помощью анализа совместного осаждения с использованием центробежной силы, либо анализа совместной флотации с градиентом плотности, чтобы избежать агрегации белка 8,9. Однако кривизна экструдированных липосом ограничена доступным размером пор мембранного фильтра, используемого в экструдере10. Было доказано, что анализ искривления одной липосомы (SLiC) преодолевает это ограничение, в котором липосомы с различным диаметром мечутся флуоресценцией и иммобилизуются на поверхность, так что кривизна может быть отмечена флуоресцентной интенсивностью11. Однако сильная изменчивость липидного состава наблюдалась в небольших везикулах, что влияет на точность измерения кривизны12. Эксперименты по вытягиванию троса обеспечивают более точное измерение кривизны на переходном тросе, вытягиваемом из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием оптического пинцета, где кривизна может хорошо контролироваться напряжением мембраны, генерируемым13,14. Этот метод подходит для изучения белков, чувствительных к положительной или отрицательной кривизне, но ограничен пропускной способностью трубчатой генерации10. Анализ поддерживаемых мембранных трубок (SMrT) обеспечивает одновременную генерацию нескольких мембранных трубок, которые выдавливаются из одного и того же липидного резервуара микрофлюидными потоками. Тем не менее, кривизна мембраны изменяется внутренне вдоль нанотрубки, что ставит под угрозу точность измерения кривизны на основе интенсивности флуоресценции15,16. Для сравнения, использование небольших одноламеллярных везикул (внедорожников, диаметром <100 нм17) для формирования поддерживаемого липидного бислоя (SLB) на поверхностях, содержащих разработанные топографии, генерировало одну двухслойную мембрану с кривизнами, предопределенными нанопроизводством или наноматериалами с высокой точностью 18,19,20.
Здесь мы представляем протокол формирования SLB на изготовленных поверхностях наночипов с нанобарными массивами и то, как его можно использовать для исследования чувствительности к кривизне белков in vitro. Как показано на рисунке 1, существует шесть основных компонентов анализа: А) Очистка и сборка чипа с микрофлюидной камерой; Б) Подготовка внедорожников с определенным липидным составом; В) Образование SLB на наночипе и связывание с кривизной чувствительных белков; D) Визуализация и характеристика чувствительных к SLB и кривизне белков при флуоресцентной микроскопии; Д) Очистка чипа для повторного использования; F) Обработка изображений для количественного анализа способности восприятия кривизны белка. Подробный протокол описан шаг за шагом ниже.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

Кривизна мембраны играет важную роль в различных важных процессах клеток, таких как миграция клеток, деление клеток и перемещение пузырьков. Он не только пассивно генерируется клеточной активностью, но и активно регулирует белковые взаимодействия и участвует во многих внутриклеточных передачах сигналов. Таким образом, большое значение имеет изучение роли кривизны мембран в регулировании распределения и динамики белков и липидов. В последнее время было разработано множество методик для изучения взаимосвязи между изогнутой мембраной и белком in vitro. По сравнению с традиционными методами, недавно разработанный липидный бислой с поддержкой нанобара (SLB) обеспечивает как высокую пропускную способность, так и лучшую точность в генерации кривизны мембраны путем формирования непрерывного липидного бислоя на узорчатых массивах нанобаров с заранее определенной кривизной мембраны и локальным плоским контролем. Как липидная текучесть, так и чувствительность белка к изогнутым мембранам могут быть количественно охарактеризованы с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь представлена подробная процедура формирования SLB на изготовленных стеклянных поверхностях, содержащих нанобарные массивы, и характеристика чувствительных к кривизне белков на таких SLB. Кроме того, рассматриваются протоколы повторного использования наночипов и обработки изображений. Помимо нанобара-SLB, этот протокол легко применим ко всем типам наноструктурированных стеклянных чипов для исследований с измерением кривизны.

Конструкция Nanobar рекомендуется для зондирования белков с положительным измерением кривизны, которая содержит полукруг на каждом конце с кривизной, определяемой шириной нанобара, и один плоский / нулевой контроль кривизны локально в центре (рисунок 2A, B). Успешн?...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Здесь разработана липидная бислойная система с поддержкой нанобара, чтобы обеспечить синтетическую мембрану с определенной кривизной, которая позволяет характеризовать белки с способностью зондировать кривизну in vitro.

Липидная двухслойная система с поддержкой нанобара для изучения белков, чувствительных к кривизне мембраны in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Эта липидная двухслойная система, поддерживаемая нанобаром, может быть использована для изучения роли кривизны мембраны в регулировании динамики и распределения белка и липидов во время клеточной деятельности. Этот метод предлагает как высокий подкорневой, так и плохой в генерации кривизны мембраны путем формирования непрерывного липидного бислоя на патентных ошибках нанобара с кривизной мембраны, предопределенной нанофабрикцией высокого разрешения. Для начала поместите наночип в 10-миллилитровый стакан лицом вверх.Осторожно добавьте один миллилитр 98% серной кислоты в стакан и убедитесь, что кислота полностью покрывает переднюю и заднюю стороны чипа. Медленно поверните стакан и добавьте 200 микролитров 30% перекиси водорода капля за каплей, пока весь стакан не станет горячим. Убедитесь, что серная кислота и перекись водорода хорошо перемешаны с образованием раствора пираньи для удаления органических молекул из наночипа.Поместите стакан во вторичный стеклянный контейнер и держите наночип погруженным в раствор пираньи на ночь, чтобы тщательно очистить примеси. Выньте стакан и аккуратно выложите раствор пираньи в контейнер для кислотных отходов. Загрузите пять миллилитров деионизированной воды в стакан, чтобы разбавить остаточную кислоту и выбросить ее в кислотные отходы.Повторите этот шаг пять раз. Возьмите чип пинцетом и промойте непрерывным потоком деионизированной воды, чтобы тщательно удалить остаточную кислоту. Высушите чип феном с 99,9% газообразным азотом для образования SLB.Настаивайте липидной смесью в течение 30 минут. Заморозьте липидную смесь в жидком азоте на 20 секунд, а затем разморозьте при 42 градусах Цельсия в течение двух минут на водяной бане. Повторите циклы замораживания/оттаивания 30 раз.После этого липидная смесь выглядит как прозрачная жидкость. Пропустите липидную смесь через мини-экструдер и выдавите туда-сюда 20 раз. Соберите внедорожники со шприца с другой стороны, чтобы уменьшить загрязнение более крупными частицами или посторонним материалом, и перенесите его в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.Осторожно извлеките очищенный наночип из деионизированной воды с помощью пинцета и высушите его феном с 99,9% газообразным азотом. Выполните очистку поверхности наночипа с помощью обработки воздушной плазмой в течение одного часа. Соберите наночип в камеру PDMS.Начните с размещения чипа на чистой поверхности с рисунком вверх. Аккуратно накройте среднюю PDMS чипом и убедитесь, что весь рисунок подвергается воздействию центральной области большого отверстия овальной формы в середине PDMS. Закройте верхнюю PDMS средней PDMS и держите два ее небольших отверстия в области большого овального отверстия средней PDMS.Затем собирается камера PDMS. Загрузите внедорожники в канал PDMS из одного из двух небольших отверстий в верхней PDMS с пипеткой и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы сформировать SLB. Аккуратно нанесите буфер PBS в канал PDMS с одной стороны небольшого отверстия и удалите отходы ватной палочкой из другого отверстия, чтобы смыть несвязанные внедорожники.Затем приобретите SLB, сформированный на наночипе. Настройте лазерную сканирующую конфокальную микроскопию с использованием масляного объектива 100 x. Откройте программное обеспечение Zen, чтобы выбрать мощность лазера возбуждения, которая может возбуждать флуоресценцию липидов и белков.Выберите Режим получения. Затем нажмите Smart Setup, а затем Texas Red. Отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки, чтобы найти нанобары на чипе до тех пор, пока края нанобара не станут острыми под липидным каналом.Задайте параметры сканирования для получения контрольного изображения липидного канала перед добавлением белка. Проводят анализ FRAP путем отбеливания флуоресцентным меченым липидным бислоем на случайной области нанобара. Установите флажки Области эксперимента и Отбеливание.Нарисуйте круглую область диаметром пять микрометров, которая может включать в себя весь нанобар в центре, и добавьте к эксперименту области. Входные параметры изображения TimeLapse. Выберите Временные ряды.Затем нажмите кнопку Длительность. Выберите 100 циклов и интервал, равный двум секундам. Входные параметры отбеливания.Установите флажки лазера, выполняющие FRAP, и измените питание на 100%Нажмите кнопку Начать эксперимент для эксперимента FRAP. Загрузите белковый раствор в канал PDMS и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить связывание белка на SLB. Перефокусируйте нанобары и задайте параметры сканирования для получения изображений как липидных, так и белковых каналов для обнаружения искривления белка.Выберите области эксперимента и проведите анализ FRAP как на липидном, так и на белковом каналах, а также выполните визуализацию TimeLapse для характеристики подвижности белка, чувствительного к кривизне. Оба показывают повышенное накопление на конце SLB покрытых отдельных нанобаров шириной 300 нанометров. Здесь SLB содержит 10% PS для электростатического усиления связывания с белками.Оба белка имеют более высокое отношение конца к центру, чем липиды, которое составляет около единицы. При сравнении IDR FBP17 и F-Bar более высокое отношение конца к центру IDR FBP17 указывает на более сильное измерение кривизны, чем F-Bar. Все три белка показали преимущественное накопление на нанобарных концевых изогнутых мембранных участках, когда кривизна уменьшилась ниже 400 нанометров в диаметре.Среди этих трех белковых доменов IDR FBP17 дает самый высокий нанобар и плотность, что указывает на его самую сильную способность к восприятию кривизны, в то время как F-Bar показывает самое низкое значение. Кривая связывания белка может быть построена путем постепенного увеличения концентрации белка, что показывает, что IDR FBP17 обладает сильной способностью к совместному восприятию кривизны. По сравнению с быстрым восстановлением липидных сигналов на нанобарах, F-Bar не может восстановиться в течение двух минут, что свидетельствует о его значительном снижении подвижности мембраны и ассоциативной динамики на изогнутых участках мембраны.Удивительно, но в отличие от поведения F-Bar, сигналы IDR FBP17 показали очевидное восстановление в течение того же периода времени, что указывает на динамический характер IDR FBP17, накопленный на изогнутых мембранах. Однако после смывания несвязанного IDR FBP17 в растворе такое же восстановление в канале IDR FBP17 не могло наблюдаться, как раньше. Качество SLB очень важно при изучении взаимодействия между изогнутой мембраной и белком.Таким образом, тест FRAP необходим в нашем эксперименте для проверки подвижности мембраны. Эта система поможет исследователям изучить различные параметры, влияющие на взаимодействие белка с изогнутой мембраной, такие как домены, чувствительные к кривизне, и липидный состав, а также провести динамические исследования изогнутой мембраны, такие как поведение разделения лица.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Кавитация азота и дифференциального центрифугирования позволяет для контроля за распределением периферийных мембранных белков в культивируемых клеток

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Моющее бесплатно сверхскоростной воссоздание мембранных белков в липидных бислоев с помощью дополнительных заряженные Proteoliposomes Fusogenic.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Изоляция частиц липопротеинов из куриного яичного желтка для изучения бактериального патогена жирной кислоты Инкорпорации в Мембрана фосфолипиды

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Pepti'uick, одноступенчатая инкорпорация мембранных белков в биотинилатированные пептидиски для оптимизированных белковых связывающих анализов

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...