Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

Vi tackar Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) och Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) vid Nanyang Technological University (NTU) för att stödja nanostrukturtillverkning och SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) vid School of Biological Sciences NTU för proteinrening och School of Chemical and Biomedical Engineering NTU för konfokalmikroskopet. Detta arbete finansieras av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 och MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) som stöds av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-systemet (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), Skolan för kemisk och biomedicinsk teknik NTU för forskningsstipendiet (X. Miao) och China Scholarship Council för forskningsstipendiet (J. Wu).

1. Rengöring av nanochip
<ol><li>Placera nanochipet i en 10 ml bägare med den mönstrade sidan uppåt. OBS: Detta kvartsnanochip har tillverkats via elektronstrålelitografi som beskrivits före21. Geometrin och arrangemanget av nanostrukturen på chipet kan specialdesignas. Storleken på de gradientnanobarer som används här är 2000 nm långa, 600 nm höga och 100 till 1000 nm breda (100 nm steguppsättning).</li>
	<li>Tillsätt försiktigt 1 ml 98% svavelsyra t...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Nanobar-SLB-systemet som beskrivs här erbjuder en unik kombination av fördelarna i flera befintliga in vitro-analyser. Det avslöjar effektivt den föredragna bindningen av proteiner till mycket krökta membran som liposomflytning eller sedimenteringsanalys men kräver mycket färre prover och erbjuder mer exakt definierad krökning på enskilda nanobarer 8,29. Det erbjuder också ett brett utbud av exakt kontrollerad krökning för samtidig jämförel...

Membrankrökning är en kritisk fysisk parameter för en cell som förekommer i en mängd olika cellulära processer såsom morfogenes, celldelning och cellmigration1. Det är allmänt erkänt nu att membrankrökningen är bortom ett enkelt resultat av cellulära händelser; Istället har det framstått som en effektiv regulator för proteininteraktioner och intracellulär signalering. Till exempel visade sig flera proteiner som är involverade i clathrinmedierad endocytos företrädesvis binda till det krökta membranet, vilket resulterade i bildandet av en hotspot för endocytos2. Det finns många olika orsaker till membrandeformation såsom membrandragning av cytoskelettkrafterna, närvaron av lipidasymmetri med olika stora huvudgrupper, förekomsten av transmembranproteiner med konisk form, ackumulering av membranformande proteiner som BAR-domänproteiner (uppkallad efter Bin-, amfifysin- och Rvs-proteiner) och införandet av amfipatiska helicesdomän i membranet1 . Intressant nog deformerar dessa proteiner och lipider inte bara membranet utan kan också känna av membrankrökningen och uppvisa preferensackumulering1. Därför är det viktigt att studera om och hur membran med olika krökningar förändrar fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider som är fästa vid dem och de potentiella effekterna på de relaterade intracellulära processerna.
Många tekniker har utvecklats för att analysera interaktionen mellan krökt membran och proteiner i både levande celler och in vitro-system. Det levande cellsystemet ger en verklig cellmiljö med rik lipiddiversitet och dynamisk proteinsignalreglering 2,3,4,5,6,7. Ett sådant sofistikerat system är emellertid svårt att studera på grund av osäkerheter och fluktuationer i den intracellulära miljön. Därför har in vitro-analyserna med hjälp av ett artificiellt membran bestående av kända lipidarter och renade proteiner blivit kraftfulla rekonstitueringssystem för att karakterisera förhållandet mellan proteiner och krökta membran. Traditionellt genereras liposomer med olika diametrar genom extrudering för att detektera krökningskänsliga proteiner via antingen en samsedimenteringsanalys med användning av centrifugalkraft eller en samflotationsanalys med en densitetsgradient för att undvika proteinaggregering 8,9. Krökningen hos de extruderade liposomerna begränsas emellertid av den tillgängliga porstorleken hos membranfiltret som används i extrudern10. SLiC-analys (Single liposome curvatur) har visat sig övervinna denna begränsning, där liposomer med olika diametrar fluorescensmärks och immobiliseras på ytan så att krökningen kan markeras av den fluorescerande intensiteten11. Emellertid har stark variation i lipidkompositionen observerats i små vesiklar, vilket påverkar noggrannheten hos krökningsmätningen12. Tether-pulling-experiment ger en mer exakt mätning av krökningen på den övergående tjudern som dras från gigantiska unilamellära vesiklar (GUV) med hjälp av en optisk pincett, där krökningen kan kontrolleras väl av membranspänningen som genereras13,14. Denna metod är lämplig för att studera antingen positiva eller negativa krökningsavkänningsproteiner, men begränsas av genomströmningen av rörgenerering10. SMrT-analys (Supported Membrane Tubes) ger samtidig generering av flera membranrör som strängsprutas från samma lipidreservoar genom mikrofluidiska flöden. Ändå varierar membrankrökningen i sig längs nanoröret, vilket äventyrar noggrannheten hos fluorescensintensitetsbaserad krökningsmätning15,16. Som jämförelse genererade användning av små unilamellära vesiklar (SUV, diameter <100 nm17) för att bilda ett stödd lipid-dubbelskikt (SLB) på ytor som innehåller designade topografier ett enda dubbelskiktsmembran med krökningar förutbestämda av nanofabrikation eller nanomaterial med hög noggrannhet18,19,20.
Här presenterar vi ett protokoll för bildandet av SLB på tillverkade nanochipytor med nanobarmatriser och hur det kan användas för att undersöka krökningskänsligheten hos proteiner in vitro. Som visas i figur 1 finns det sex väsentliga komponenter i analysen: A) Rengöring och montering av chipet med en mikrofluidisk kammare; B) Framställning av stadsjeepar med definierad lipidsammansättning; C) Bildning av SLB på ett nanochip och bindning med krökningskänsliga proteiner; D) Avbildning och karakterisering av SLB- och krökningskänsliga proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengöring av chipet för återanvändning; F) Bildbehandling för kvantitativ analys av proteinkrökningsavkänningsförmåga. Det detaljerade protokollet beskrivs steg för steg nedan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

Membrankrökning spelar viktiga roller i olika väsentliga processer av celler, såsom cellmigration, celldelning och vesikelhandel. Det genereras inte bara passivt av cellulära aktiviteter, utan reglerar också aktivt proteininteraktioner och är involverat i många intracellulära signaleringar. Således är det av stort värde att undersöka membrankrökningens roll för att reglera fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider. Nyligen har många tekniker utvecklats för att studera förhållandet mellan det krökta membranet och proteinet in vitro. Jämfört med traditionella tekniker erbjuder det nyutvecklade nanobarstödda lipid-dubbelskiktet (SLB) både hög genomströmning och bättre noggrannhet i membrankrökningsgenerering genom att bilda ett kontinuerligt lipid-dubbelskikt på mönstrade arrays av nanobarer med en fördefinierad membrankrökning och lokal platt kontroll. Både lipidfluiditeten och proteinkänsligheten för krökta membran kan karakteriseras kvantitativt med hjälp av fluorescensmikroskopiavbildning. Här introduceras en detaljerad procedur för hur man bildar en SLB på tillverkade glasytor som innehåller nanobarmatriser och karakteriseringen av krökningskänsliga proteiner på sådan SLB. Dessutom omfattas protokoll för återanvändning av nanochip och bildbehandling. Utöver nanobar-SLB är detta protokoll lätt tillämpligt på alla typer av nanostrukturerade glasflisor för krökningsavkänningsstudier.

Nanobar-design rekommenderas för att undersöka proteiner med positiv krökningsavkänning, som innehåller en halvcirkel i varje ände med krökning definierad av nanobarbredden och en platt/noll krökningskontroll lokalt i mitten (figur 2A,B). Framgångsrik bildning av SLB på nanobarer resulterar i jämnt fördelade lipidmarkörsignaler över hela nanobarytan som visas i figur 2C. Signaler från flera nanobarer kan kombineras genom att medel...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Här utvecklas ett nanobarstödt lipid-dubbelskiktssystem för att tillhandahålla ett syntetiskt membran med en definierad krökning som möjliggör karakterisering av proteiner med krökningsavkänningsförmåga in vitro.

Ett nanobar-stött lipid-dubbelskiktssystem för studier av membrankrökningsavkännande proteiner in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Detta nanobarstödda lipid-dubbelskiktssystem kan användas för att studera membrankrökningens roll för att reglera dynamiken och fördelningen av protein och lipider under cellaktiviteter. Denna teknik erbjuder både hög subrot och dålig i membrankrökningsgenereringen genom att bilda ett kontinuerligt lipid-dubbelskikt på patenterade nanobarfel med membrankrökning fördefinierad av högupplöst nanofabrikation. För att börja, placera nanochipet i en 10 ml bägare med mönstersidan uppåt.Tillsätt försiktigt en milliliter 98% svavelsyra till bägaren och se till att syran helt täcker fram- och baksidan av chipet. Rotera långsamt bägaren och tillsätt 200 mikroliter 30% väteperoxid droppe för droppe tills hela bägaren blir varm. Se till att svavelsyra och väteperoxid är väl blandade för att bilda Piranha-lösning för avlägsnande av organiska molekyler från nanochipet.Placera bägaren i en sekundär glasbehållare och håll nanochipet nedsänkt i Piranha-lösningen över natten för att rengöra föroreningarna noggrant. Ta ut bägaren och pipettera försiktigt Piranha-lösningen i en syraavfallsbehållare. Ladda fem milliliter avjoniserat vatten i bägaren för att späda ut restsyran och kasta den i syraavfallet.Upprepa detta steg fem gånger. Ta tag i chipet med pincett och tvätta med en kontinuerlig ström av avjoniserat vatten för att avlägsna kvarvarande syra noggrant. Föna chipet med 99,9% kvävgas för SLB-bildning.Sonicate lipidblandningen i 30 minuter. Frys lipidblandningen i flytande kväve i 20 sekunder och tina sedan vid 42 grader Celsius i två minuter i ett vattenbad. Upprepa frys-/upptiningscyklerna 30 gånger.Därefter ser lipidblandningen ut som en klar vätska. För lipidblandningen genom mini-extrudern och extrudera fram och tillbaka 20 gånger. Samla SUV: erna från sprutan på andra sidan för att minska föroreningen med större partiklar eller främmande material och överför den till ett 1,5 ml centrifugrör.Ta försiktigt ut det rengjorda nanochipet från avjoniserat vatten med en pincett och föna med 99,9% kvävgas. Utför ytrengöring av nanochipet med luftplasmabehandling i en timme. Montera nanochipet i en PDMS-kammare.Börja med att placera chipet på en ren yta med mönstret uppåt. Täck försiktigt det mellersta PDMS med chipet och se till att hela mönstret utsätts för det centrala området i den stora ovalformade öppningen i mitten av PDMS. Täck det övre PDMS med det mellersta PDMS och håll dess två små hål inom området för det stora ovala hålet i det mellersta PDMS.Därefter monteras PDMS-kammaren. Ladda SUV: erna i PDMS-kanalen från ett av de två små hålen i det övre PDMS med en pipett och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur för att bilda SLB. Pipettera försiktigt PBS-bufferten i PDMS-kanalen från ena sidan av det lilla hålet och ta bort avfallet med en bomullsknopp från det andra hålet för att tvätta bort de obundna SUV: erna.Skaffa sedan SLB som bildas på nanochipet. Ställ in laserskanningskonfokalmikroskopi med ett 100 x oljemål. Öppna Zen-programvaran för att välja excitationslaserkraft som kan excitera fluorescensen hos lipiden och proteinet.Välj Förvärvsläge. Klicka sedan på Smart Setup, följt av Texas Red. Justera fokus med fokusvredet för att hitta nanostängerna på chipet tills nanostångens kanter är skarpa under lipidkanalen.Ställ in skanningsparametrarna för att få en kontrollbild av lipidkanalen innan du tillsätter protein. Utför FRAP-analysen genom blekning med fluorescerande märkt lipid-dubbelskikt på ett slumpmässigt enda nanobarområde. Markera kryssrutorna Experimentregioner och Blekning.Rita ett cirkulärt område med fem mikrometers diameter som kan inkludera hela nanobaren i mitten och lägg till experimentregionerna. Mata in TimeLapse-avbildningsparametrar. Välj Tidsserie.Klicka sedan på Varaktighet. Välj 100 cykler och intervall som är lika med två sekunder. Mata in blekningsparametrar.Markera laserkryssrutorna som utför FRAP och ändra effekten till 100 %Klicka på Starta experiment för FRAP-experimentet. Ladda proteinlösningen i PDMS-kanalen och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur för att möjliggöra bindning av proteinet på SLB. Fokusera om nanobarerna och ställ in skanningsparametrarna för att ta bilder av både lipid- och proteinkanaler för detektering av proteinkrökningsavkänning.Välj experimentregioner och utför FRAP-analysen på både lipid- och proteinkanaler och utför TimeLapse-avbildning för att karakterisera rörligheten hos krökningsavkännande protein. Båda visar ökad ackumulering i slutet av SLB-belagda enskilda nanobarer med 300 nanometers bredd. Här innehåller SLB 10% PS för att elektrostatiskt förbättra proteinbindningen.Båda proteinerna har ett högre förhållande mellan ände och centrum än lipider, vilket är runt ett. När man jämför IDR FBP17 och F-Bar indikerar det högre förhållandet mellan ände och centrum för IDR FBP17 starkare krökningsavkänning än F-Bar. Alla tre proteinerna visade preferensackumulering vid nanobarens ändböjda membranställen när krökningen minskade under 400 nanometer i diameter.Bland dessa tre proteindomäner ger IDR FBP17 den högsta nanostången och densiteten, vilket indikerar dess starkaste krökningsförmåga, medan F-Bar visar det lägsta värdet. Proteinbindningskurvan kan plottas genom att gradvis öka proteinkoncentrationen vilket visar att IDR FBP17 har en stark kooperativ krökningsförmåga. Jämfört med den snabba återhämtningen av lipidsignaler på nanobarer kan F-Bar inte återhämta sig inom två minuter, vilket tyder på dess signifikant minskade membranmobilitet och associeringsdynamik vid de böjda membranställena.Överraskande, till skillnad från beteendet hos F-Bar, visade IDR FBP17-signaler uppenbar återhämtning inom samma tidsram, vilket indikerar den dynamiska naturen hos IDR FBP17 som ackumuleras vid de krökta membranen. Men efter att ha tvättat bort den obundna IDR FBP17 i lösningen kunde samma återhämtning i IDR FBP17-kanalen inte observeras som tidigare. SLB-kvaliteten är mycket viktig när man studerar interaktionen mellan krökt membran och protein.Så FRAP-testet är nödvändigt i vårt experiment för att validera membranmobiliteten. Detta system kommer att hjälpa forskarna att studera olika parametrar som påverkar proteininteraktionen med det böjda membranet, såsom krökningsavkänningsdomänerna och lipidkompositionen samt att genomföra de dynamiska studierna på krökt membran såsom ansiktsseparationsbeteenden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kväve kavitation och differentiell centrifugering tillåter övervakning fördelningen av perifera membranproteiner på odlade celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, en enstegs inkorporering av membranproteiner i biotinylerade Peptidiscs för strömlinjeformade Proteinbindnings analyser

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Inbyggt cellmembrannanopartiklar system för membranprotein-protein interaktionsanalys

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...