Name: a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi'ndeki (NTU) Yıkıcı Fotonik Teknolojiler Merkezi'ne (CDPT), nanoyapı imalatını ve SEM görüntülemeyi destekledikleri için, protein saflaştırma için Biyolojik Bilimler Okulu NTU'daki Protein Üretim Platformu'na (PPP) ve konfokal mikroskop için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu'na teşekkür ederiz. Bu çalışma, Singapur Eğitim Bakanlığı (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 ve MOE-T2EP30220-0009), Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri programı kapsamında MOE finansmanı tarafından desteklenen Dijital Moleküler Analitik ve Bilim Enstitüsü (IDMxS), İnsan Sınırı Bilim Programı Vakfı (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao) tarafından finanse edilmektedir. Araştırma bursu için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu (X. Miao) ve araştırma bursu için Çin Burs Konseyi (J. Wu).

1. Nanoçip temizliği
<ol><li>Nanoçipi, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mL'lik bir beherin içine yerleştirin. NOT: Bu kuvars nanoçip,21'den önce açıklandığı gibi elektron ışını litografisi ile üretilmiştir. Çip üzerindeki nanoyapının geometrisi ve düzenlemesi özel olarak tasarlanabilir. Burada kullanılan gradyan nanoçubuklarının boyutları 2000 nm uzunluğunda, 600 nm yüksekliğinde ve 100 ila 1000 nm genişliğindedir (100 nm ...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Burada açıklanan nanobar-SLB sistemi, mevcut birkaç in vitro tahlildeki avantajların benzersiz bir kombinasyonunu sunmaktadır. Proteinlerin lipozom yüzdürme veya sedimantasyon testi olarak yüksek oranda kavisli membranlara tercihli bağlanmasını etkili bir şekilde ortaya çıkarır, ancak çok daha az numune gerektirir ve bireysel nanobarlarda daha doğru tanımlanmış eğrilik sunar 8,29. Ayrıca, SLB hareketli olduğundan ve sürekli olarak...

Membran eğriliği, morfogenez, hücre bölünmesi ve hücre göçü1 gibi çeşitli hücresel süreçlerde meydana gelen bir hücrenin kritik bir fiziksel parametresidir. Membran eğriliğinin hücresel olayların basit bir sonucunun ötesinde olduğu artık yaygın olarak kabul edilmektedir; bunun yerine, protein etkileşimlerinin ve hücre içi sinyalleşmenin etkili bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, klatrin aracılı endositozda yer alan birkaç proteinin tercihen kavisli membrana bağlandığı ve endositoz2 için bir sıcak nokta oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Membran deformasyonunun sitoiskelet kuvvetleri tarafından membran çekilmesi, farklı büyüklükte kafa gruplarına sahip lipit asimetrisinin varlığı, konik şekilli transmembran proteinlerinin varlığı, BAR-domain proteinleri (Bin, amfifin ve Rvs proteinlerinden sonra adlandırılmıştır) gibi membran şekillendirici proteinlerin birikmesi ve amfipatik helislerin membrana yerleştirilmesi gibi birçok farklı nedeni vardır1 . İlginç bir şekilde, bu proteinler ve lipitler sadece zarı deforme etmekle kalmaz, aynı zamanda membran eğriliğini algılayabilir ve tercihli birikim gösterebilir1. Bu nedenle, farklı eğriliklere sahip membranların, bunlara bağlı proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini ve ilgili hücre içi süreçler üzerindeki potansiyel etkilerini değiştirip değiştirmediğini ve nasıl değiştirdiğini incelemek çok önemlidir.
Hem canlı hücre hem de in vitro sistemlerde kavisli membran ve proteinler arasındaki etkileşimi analiz etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Canlı hücre sistemi, zengin lipit çeşitliliği ve dinamik protein sinyal regülasyonu 2,3,4,5,6,7 ile gerçek bir hücre ortamı sağlar. Bununla birlikte, böyle sofistike bir sistemin, hücre içi ortamdaki belirsizlikler ve dalgalanmalar nedeniyle incelenmesi zordur. Bu nedenle, bilinen lipit türlerinden ve saflaştırılmış proteinlerden oluşan yapay bir membran kullanan in vitro testler, proteinler ve kavisli membranlar arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için güçlü sulandırma sistemleri haline gelmiştir. Geleneksel olarak, farklı çaplardaki lipozomlar, eğriliğe duyarlı proteinleri, santrifüj kuvveti kullanan bir ko-sedimantasyon testi veya protein agregasyonunu önlemek için yoğunluk gradyanına sahip bir ko-yüzdürme testi yoluyla tespit etmek için ekstrüzyon ile üretilir 8,9. Bununla birlikte, ekstrüde lipozomların eğriliği, ekstrüder10'da kullanılan membran filtresinin mevcut gözenek boyutu ile sınırlıdır. Tek lipozom eğriliği (SLiC) testinin, farklı çaplara sahip lipozomların floresan etiketli olduğu ve yüzeye hareketsiz hale getirildiği, böylece eğriliğin floresan yoğunluğu11 ile işaretlenebildiği bu sınırlamanın üstesinden geldiği kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, küçük veziküllerde lipit bileşiminde güçlü değişkenlik gözlenmiştir, bu da eğrilik ölçümünün doğruluğunu etkiler12. Tether çekme deneyleri, optik bir cımbız kullanarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) çekilen geçici tether üzerindeki eğriliğin daha doğru bir ölçümünü sağlar, burada eğrilik13,14 üretilen membran gerilimi tarafından iyi kontrol edilebilir. Bu yöntem, pozitif veya negatif eğrilik algılama proteinlerini incelemek için uygundur, ancak tüp nesil10'un verimi ile sınırlıdır. Desteklenen membran tüpleri (SMrT) testi, mikroakışkan akışlarla aynı lipit rezervuarından ekstrüde edilen çoklu membran tüplerinin eşzamanlı olarak üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, membran eğriliği nanotüp boyunca içsel olarak değişir, bu da floresan yoğunluğuna dayalı eğrilik ölçümünün doğruluğunu tehlikeye atar15,16. Buna karşılık, tasarlanmış topografyaları içeren yüzeylerde desteklenen bir lipit çift katmanlı (SLB) oluşturmak için küçük unilamellar veziküller (SUV'lar, çap <100 nm 17) kullanarak, nanofabrikasyon veya nanomalzemeler tarafından önceden belirlenmiş eğriliklere sahip tek bir çift katmanlı membran üretti18,19,20.
Burada, nanobar dizileri ile imal edilmiş nanoçip yüzeylerinde SLB'nin oluşumu ve proteinlerin in vitro eğrilik hassasiyetini araştırmak için nasıl kullanılabileceği için bir protokol sunuyoruz. Şekil 1'de gösterildiği gibi, tahlilin altı temel bileşeni vardır: A) Çipin mikroakışkan bir oda ile temizlenmesi ve montajı; b) Tanımlanmış lipit bileşimine sahip SUV'ların hazırlanması; C) SLB'nin bir nanoçip üzerinde oluşumu ve eğriliğe duyarlı proteinlerle bağlanması; d) Floresan mikroskobu altında SLB ve eğriliğe duyarlı proteinlerin görüntülenmesi ve karakterizasyonu; e) Çipin yeniden kullanılmak üzere temizlenmesi; f) Protein eğriliği algılama yeteneğinin kantitatif analizi için görüntü işleme. Ayrıntılı protokol aşağıda adım adım açıklanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

Membran eğriliği, hücre göçü, hücre bölünmesi ve vezikül kaçakçılığı gibi hücrelerin çeşitli temel süreçlerinde önemli roller oynar. Sadece hücresel aktiviteler tarafından pasif olarak üretilmez, aynı zamanda protein etkileşimlerini aktif olarak düzenler ve birçok hücre içi sinyallemede rol oynar. Bu nedenle, membran eğriliğinin proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini düzenlemedeki rolünü incelemek büyük değer taşımaktadır. Son zamanlarda, kavisli membran ve protein in vitro arasındaki ilişkiyi incelemek için birçok teknik geliştirilmiştir. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında, yeni geliştirilen nanobar destekli lipit çift katmanlı (SLB), önceden tanımlanmış bir membran eğriliği ve yerel düz kontrol ile desenli nanobar dizileri üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek verim hem de daha iyi doğruluk sunar. Hem lipit akışkanlığı hem de kavisli membranlara protein duyarlılığı, floresan mikroskopi görüntüleme kullanılarak kantitatif olarak karakterize edilebilir. Burada, nanobar dizileri içeren fabrikasyon cam yüzeylerde bir SLB'nin nasıl oluşturulacağına ve bu SLB üzerinde eğriliğe duyarlı proteinlerin karakterizasyonuna ilişkin ayrıntılı bir prosedür tanıtılmaktadır. Ek olarak, nanoçip yeniden kullanımı ve görüntü işleme protokolleri ele alınmaktadır. Nanobar-SLB'nin ötesinde, bu protokol eğrilik algılama çalışmaları için her türlü nanoyapılı cam çipine kolayca uygulanabilir.

Nanobar tasarımı, nanobar genişliği ile tanımlanan eğrilik ve merkezde yerel olarak bir düz / sıfır eğrilik kontrolü ile her iki ucunda yarım daire içeren pozitif eğrilik algılama proteinlerini araştırmak için önerilir (Şekil 2A, B). SLB'nin nanobarlar üzerinde başarılı bir şekilde oluşturulması, Şekil 2C'de gösterildiği gibi tüm nanobar yüzeyi boyunca eşit olarak dağılmış lipit işaretleyici sinyalleri ile s...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Bu nanobar destekli lipit çift katmanlı sistem, hücre aktiviteleri sırasında protein ve lipitlerin dinamiklerini ve dağılımını düzenlemede membran eğriliğinin rolünü incelemek için kullanılabilir. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü nanofabrikasyon ile önceden tanımlanmış membran eğriliği ile patent nanobar hataları üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek alt kök hem de kötü sunar. Başlamak için, nano çipi desen tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mililitrelik bir beherin içine yerleştirin.Beher'e dikkatlice bir mililitre% 98 sülfürik asit ekleyin ve asidin çipin ön ve arka tarafını tamamen kapladığından emin olun. Beheri yavaşça döndürün ve tüm beher ısınana kadar damla damla damla 200 mikrolitre% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Sülfürik asit ve hidrojen peroksitin, organik moleküllerin nano çipten uzaklaştırılması için Piranha çözeltisi oluşturmak üzere iyi karıştırıldığından emin olun.Beheri ikincil bir cam kaba koyun ve safsızlıkları iyice temizlemek için nano çipi gece boyunca Piranha çözeltisine batırılmış halde tutun. Beheri çıkarın ve Piranha çözeltisini dikkatlice bir asit atık kabına pipetleyin. Artık asidi seyreltmek ve asit atığına atmak için beherin içine beş mililitre deiyonize su yükleyin.Bu adımı beş kez yineleyin. Çipi cımbızla alın ve artık asidi iyice gidermek için sürekli bir deiyonize su akışıyla yıkayın. SLB oluşumu için talaş %99,9 azot gazı ile üflenerek kurutun.Lipid karışımını 30 dakika boyunca sonikleştirin. Lipit karışımını sıvı azotta 20 saniye dondurun ve ardından bir su banyosunda iki dakika boyunca 42 santigrat derecede çözün. Donma/çözülme döngülerini 30 kez tekrarlayın.Bundan sonra, lipit karışımı berrak bir sıvı gibi görünür. Lipit karışımını mini ekstrüderden geçirin ve 20 kez ileri geri ekstrüzyon yapın. Daha büyük parçacıklar veya yabancı madde ile kontaminasyonu azaltmak için SUV'ları diğer taraftaki şırıngadan toplayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Temizlenmiş nano çipi deiyonize sudan bir çift cımbızla dikkatlice çıkarın ve% 99,9 azot gazı ile fön ile kurulayın. Bir saat boyunca hava plazma işlemi ile nano çipin yüzey temizliğini yapın. Nano çipi bir PDMS odasına monte edin.Çipi, desen yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirerek başlayın. Orta PDMS'yi çiple yavaşça örtün ve tüm desenin orta PDMS'deki oval şekilli büyük açıklığın merkezi alanına maruz kaldığından emin olun. Üst PDMS'yi orta PDMS ile örtün ve iki küçük deliğini orta PDMS'nin büyük oval deliği bölgesinde tutun.Daha sonra, PDMS odası monte edilir. SUV'ları üst PDMS'deki iki küçük delikten birinden PDMS kanalına bir pipetle yükleyin ve SLB'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. PBS tamponunu küçük deliğin bir tarafından PDMS kanalına nazikçe pipetleyin ve bağlanmamış SUV'ları yıkamak için atıkları diğer delikten pamuklu bir tomurcukla çıkarın.Ardından nano çip üzerinde oluşan SLB'yi edinin. 100 x yağ hedefi kullanarak lazer taramalı konfokal mikroskopiyi ayarlayın. Lipid ve proteinin floresansını uyarabilecek uyarma lazer gücünü seçmek için Zen yazılımını açın.Edinme Modu'nu seçin. Ardından Akıllı Kurulum'a ve ardından Texas Red'e tıklayın. Nano çubuk kenarları lipit kanalının altında keskin olana kadar çip üzerindeki nano çubukları bulmak için odak düğmesiyle odağı ayarlayın.Protein eklemeden önce lipit kanalının kontrol görüntüsünü elde etmek için tarama parametrelerini ayarlayın. FRAP tahlilini, rastgele tek bir nanobar alanı üzerinde floresan etiketli lipit çift katmanlı ağartarak yapın. Deneme Bölgeleri ve Ağartma onay kutularını seçin.Merkezdeki tüm nanobarı içerebilen beş mikrometre çapında dairesel bir alan çizin ve deney bölgelerine ekleyin. TimeLapse görüntüleme parametrelerini girin. Zaman Serisi'ni seçin.Ardından Süre'yi tıklayın. 100 döngü ve iki saniyeye eşit aralık seçin. Giriş ağartma parametreleri.FRAP gerçekleştiren lazer onay kutularını seçin ve FRAP denemesi için gücü %100 Denemeyi Başlat'a değiştirin. Protein çözeltisini PDMS kanalına yükleyin ve proteinin SLB üzerine bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Nanoçubukları yeniden odaklayın ve protein eğriliği algılama tespiti için hem lipit hem de protein kanallarının görüntülerini almak için tarama parametrelerini ayarlayın.Deney Bölgeleri'ni seçin ve FRAP testini hem lipit hem de protein kanallarında yapın ve eğrilik algılama proteininin hareketliliğini karakterize etmek için TimeLapse görüntüleme gerçekleştirin. Her ikisi de 300 nanometre genişliğinde SLB kaplı bireysel nanobarların ucunda artan birikim göstermektedir. Burada SLB, protein bağlanmasını elektrostatik olarak arttırmak için% 10 PS içerir.Her iki protein de lipitlerden daha yüksek bir uç-merkez oranına sahiptir, bu da yaklaşık bir tanesidir. IDR FBP17 ve F-Bar'ı karşılaştırırken, IDR FBP17'nin daha yüksek uçtan merkeze oranı, F-Bar'dan daha güçlü eğrilik algılamasını gösterir. Her üç protein de, eğrilik çapı 400 nanometrenin altına düştüğünde nanobar uç kavisli membran bölgelerinde tercihli birikim gösterdi.Bu üç protein alanı arasında, IDR FBP17 en yüksek nano çubuğu ve yoğunluğu verir, bu da en güçlü eğrilik algılama yeteneğini gösterirken, F-Bar en düşük değeri gösterir. Protein bağlanma eğrisi, IDR FBP17'nin güçlü bir işbirlikçi eğrilik algılama yeteneğine sahip olduğunu gösteren protein konsantrasyonunu kademeli olarak artırarak çizilebilir. Nanobarlardaki lipit sinyallerinin hızlı geri kazanımı ile karşılaştırıldığında, F-Bar iki dakika içinde iyileşemez, bu da kavisli membran bölgelerinde membran hareketliliğinin ve ilişki dinamiğinin önemli ölçüde azaldığını gösterir.Şaşırtıcı bir şekilde, F-Bar'ın davranışından farklı olarak, IDR FBP17 sinyalleri, kavisli membranlarda biriken IDR FBP17'nin dinamik doğasını gösteren, aynı zaman diliminde belirgin bir iyileşme gösterdi. Bununla birlikte, çözümdeki bağlanmamış IDR FBP17'yi temizledikten sonra, IDR FBP17 kanalında eskisi gibi aynı iyileşme gözlenemedi. SLB kalitesi, kavisli membran ve protein arasındaki etkileşimi incelerken çok önemlidir.Bu nedenle, membran hareketliliğini doğrulamak için deneyimizde FRAP testi gereklidir. Bu sistem, araştırmacıların eğrilik algılama alanları ve lipit bileşimi gibi kavisli membran ile protein etkileşimini etkileyen çeşitli parametreleri incelemelerine ve yüz ayırma davranışları gibi kavisli membran üzerinde dinamik çalışmalar yapmalarına yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, Aerodinamik Protein Bağlayıcı Tahliller için Biyotinylated Peptidiskler içine Membran Proteinlerin Bir Adım Dahil

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...