Name: deciphering the molecular mechanism and function of pore-forming toxins using leishmania major
Uploaded: 2022-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبرات كيل وتشانغ على مراجعتهم النقدية للمخطوطة. يشكر المؤلفون المجهري لكلية الآداب والعلوم على استخدام المرافق.

تم استخدام جميع الإرشادات المناسبة والممارسات الميكروبيولوجية والسلامة وزراعة الخلايا القياسية لاستخدام ومعالجة الحمض النووي الرئيسي والمأشوب RG2 Leishmania . تم إجراء جميع التجارب مع L. major الحية في خزانة السلامة البيولوجية في مختبر معتمد من BSL-2. وأشرفت على العمل لجنة السلامة الأحيا?...

<ol>
	<li>Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+macrophages+and+cholesterol-dependent+cytolysins:+The+impact+on+immune+response+and+cellular+survival.">Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival.</a> Toxins. 12 (9), 531 (2020).</li><li>Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+streptolysin+O+in+a+mouse+model+of+invasive+group+A+streptococcal+disease.">Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease.</a> Infection &amp; Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).</li><li>Farrand, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholesterol-dependent+cytolysin+membrane-binding+interface+discriminates+lipid+environments+of+cholesterol+to+support+beta-barrel+pore+insertion.">The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).</li><li>Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+elements+of+the+cholesterol-dependent+cytolysins+that+are+responsible+for+their+cholesterol-sensitive+membrane+interactions.">Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).</li><li>Schoenauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+acid+sphingomyelinase+and+neutral+sphingomyelinase-2+inversely+determines+the+cellular+resistance+to+plasmalemmal+injury+by+pore-forming+toxins.">Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins.</a> FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).</li><li>Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+repair+triggered+by+cholesterol-dependent+cytolysins+is+activated+by+mixed+lineage+kinases+and+MEK.">Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK.</a> Science Advances. 8 (11), (2022).</li><li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+annexin+A1+reveals+dynamics+of+ceramide+platforms+in+living+cells.">Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells.</a> Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).</li><li>Jimenez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESCRT+machinery+is+required+for+plasma+membrane+repair.">ESCRT machinery is required for plasma membrane repair.</a> Science. 343 (6174), 1247136 (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle.">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).</li><li>Wolfmeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2)(+)-dependent+repair+of+pneumolysin+pores:+A+new+paradigm+for+host+cellular+defense+against+bacterial+pore-forming+toxins.">Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).</li><li>Bravo, F., Sanchez, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+re-emerging+cutaneous+infectious+diseases+in+Latin+America+and+other+geographic+areas.">New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas.</a> Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).</li><li>Manfredi, M., Iuliano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+leishmaniasis+with+long+duration+and+bleeding+ulcer.">Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer.</a> Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+are+essential+for+differentiation+but+not+growth+in+Leishmania.">Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania.</a> EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).</li><li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+de+novo+synthesis+and+salvage+of+lipids+by+Leishmania+amastigotes.">Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes.</a> Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).</li><li>Kaur, P., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+mitogen+activated+protein+kinases+in+protozoan+parasites.">Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites.</a> Biochimie. 193, 78-89 (2022).</li><li>Wiese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+MAP+kinases--Familiar+proteins+in+an+unusual+context.">Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context.</a> International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).</li><li>Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite+mitogen-activated+protein+kinases+as+drug+discovery+targets+to+treat+human+protozoan+pathogens.">Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens.</a> Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).</li><li>Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+involved+in+flagellar-length+control.">Protein kinase involved in flagellar-length control.</a> Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).</li><li>Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential,+putative+MEK+kinase+of+Leishmania+major.">An essential, putative MEK kinase of Leishmania major.</a> Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).</li><li>Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+parameters+beyond+lipid+binding+affinity+drive+cytotoxicity+of+cholesterol-dependent+cytolysins.">Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins.</a> Toxins. 11 (1), (2018).</li><li>Beneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+Cas9+high-throughput+genome+editing+toolkit+for+kinetoplastids.">A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids.</a> Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).</li><li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression.">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li><li>Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylcholine+synthesis+through+cholinephosphate+cytidylyltransferase+is+dispensable+in+Leishmania+major.">Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major.</a> Scientific Reports. 9, 7602 (2019).</li><li>Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bacterial+toxin+induced+responses+using+live+cell+fluorescence+microscopy.">Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).</li><li>Romero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+repair+protects+cells+from+pore-forming+toxins+by+microvesicle+shedding.">Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).</li><li>Keyel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+porous+defects+in+plasma+membranes+of+adenosine+triphosphate-depleted+Madin-Darby+canine+kidney+cells+and+its+inhibition+by+glycine.">Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine.</a> Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).</li><li>Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+small+molecules+prevent+macrophage+lysis+during+pyroptosis.">Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (4), 326 (2019).</li></ol>

في هذه الدراسة ، تم وصف طرق دراسة الآليات الجزيئية ووظائف PFTs ، باستخدام الممرض البشري الليشمانيا الكبرى كنظام نموذجي. تم تطوير مقايسة السمية الخلوية القائمة على قياس التدفق المتوسط لقياس صلاحية الخلية الواحدة. الجدوى كمية على مستوى السكان لأنه يمكن حساب قيم LC50 من منحنى الجرعة ?...

السموم المكونة للمسام (PFTs) هي أكبر عائلة من السموم البكتيرية1 ، ولكن الآليات التي تثقب بها الخلايا وتدمرها غير مفهومة بشكل جيد. أفضل عائلة من السموم المكونة للمسام التي تمت دراستها هي عائلة السيتوليسين المعتمدة على الكوليسترول (CDCs). يتم تصنيع CDCs في المقام الأول عن طريق البكتيريا إيجابية الجرام ، بما في ذلك العامل المسبب لالتهاب اللفافة الناخر ، العقدية المقيحة2. تفرز S. pyogenes CDC streptolysin O (SLO) ، الذي يرتبط بالستيرول في غشاء البلازما للخلايا المضيفة كمونومرات ، oligomerizes ، ويدخل ~ 20-30 نانومتر المسام في الغشاء1. لا يزال الدور الذي تلعبه الليبيدات في هذه العملية غير محدد بشكل جيد.
تتمثل إحدى طرق دراسة تفاعلات الدهون و CDC في استخدام الجسيمات الشحمية المحددة كيميائيا. في حين أن الجسيمات الشحمية المحددة توفر معلومات عن العتبات الضرورية للدهون للحفاظ على ربط السموم وتكوين المسام 3,4 ، إلا أنها لا تلخص الوظائف الخلوية بالكامل. على سبيل المثال ، تفتقر الجسيمات الشحمية المعاد تشكيلها إلى عدم تناسق الدهون في مضيفات الثدييات وتعديلات الدهون استجابة للسموم5. أحد بدائل الجسيمات الشحمية هو استخدام خطوط خلايا الثدييات. في حين أن خطوط الخلايا هذه أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية ، إلا أن هناك درجة كبيرة من التكرار في آليات استشعار السموم والمقاومة2. نتيجة لذلك ، لا تزال مسارات الإصلاح المستخدمة لمقاومة CDCs غير محددة بشكل جيد. والجدير بالذكر أن تدفق Ca2+ هو المنشط الأساسي لإصلاح الغشاء1. في اتجاه مجرى تدفق Ca2+ ، يتم تشغيل مسارات متعددة ، بما في ذلك الإصلاح المعتمد على السيراميد 6,7 ومسار الإصلاح المعتمد على MEK6. تتفاعل هذه المسارات مع مستجيبات البروتين الأخرى ، بما في ذلك مجمع الفرز الاندوسومي المطلوب للنقل (ESCRT)8 ، والمرفقات6،9،10. يمثل تشريح هذه المسارات في خلايا الثدييات تحديا بسبب التكرار ، مما يؤدي إلى تشويش تفسير البيانات.
تتمثل إحدى طرق تحقيق التوازن بين التعقيد والبساطة لتشريح مسارات الإصلاح في استخدام كائنات أبسط ، مثل مسببات الأمراض الأولية في جنس الليشمانيا. الليشمانيا sp. تسبب داء الليشمانيات في البشر والحيوانات الأخرى. يتراوح داء الليشمانيات من داء الليشمانيات الجلدي (آفات جلدية محدودة ذاتيا) إلى داء الليشمانيات الحشوي المميت (تضخم الكبد والطحال) ، اعتمادا على الأنواع وعوامل أخرى11. ينتقل الليشمانيا الكبرى ، العامل المسبب لداء الليشمانيات الجلدي ، إلى البشر عبر ناقل ذبابة الرمل ويستخدم لفهم وظيفة الليشمانيا والعدوى12. بالإضافة إلى ذلك ، الليشمانيا sp. هي digenic12. وهي موجودة كطفيليات بلاعم داخل الخلايا تسمى amastigotes وكبرومستيغوت سوطية حرة السباحة في ذبابة الرمل12. يمكن استزراع L. promastigotes الرئيسية في وسائط مكملة بالمصل مثل M199 إلى كثافة عالية13. Promastigotes هي أيضا قابلة للتتبع وراثيا. توجد العديد من الضربات القاضية الجينية ، بما في ذلك تلك التي تستهدف مسارات التخليق الحيوي للدهون13. يمكن تقييم هذه الضربات القاضية للنمو والاختلافات في العدوى وتطور الآفة عن طريق إصابة الفئران Balb / c13.
بالإضافة إلى السهولة النسبية لثقافة الليشمانيا ومجموعة الضربات القاضية للتخليق الحيوي للدهون ، فإن الطفيلي لديه جينوم أبسط من الثدييات. أفضل أنواع الليشمانيا تميزا هي L. Major ، التي تحتوي على العديد من الأدوات الوراثية الموجودة ، مثل الطفرات ذات التمثيل الغذائي الدهني المعيب14. والجدير بالذكر أن العديد من بروتينات الإصلاح غائبة. لا يوجد لدى L. major أي متجانسات تم تحديدها حتى الآن لبروتينات إصلاح الثدييات الرئيسية مثل المرفقات. وهذا يتيح توصيف مسارات الإصلاح المحفوظة تطوريا دون تعقيد أنظمة الثدييات. ومع ذلك ، لم يتم وصف مسارات الإصلاح في الليشمانيا حتى الآن. في الوقت نفسه ، يتم حفظ مسارات الإشارات الرئيسية المشاركة في الإصلاح ، مثل مسار MEK6 ، في Leishmania sp.15,16 ، على الرغم من الحاجة إلى التحقق من صحة المتماثلات. تمت دراسة مسار بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) جيدا في L. mexicana ، حيث يساهم في البقاء داخل الخلايا والاستقرار الحراري في خلايا الثدييات ويتحكم في تكوين الميتاسيكسيكوجينيسيس16. في Leishmania sp. ، تم وصف 10 من 15 MAPKs17. من المتوقع أن يكون LmMAPK9 و LmMAPK13 الأكثر تشابها مع ERK1 / 2 للثدييات بناء على الهوية في تسلسل شفة الفسفرة المحفوظ. تسلسل شفة الفسفرة هو TEY لكل من الثدييات ERK1 / 2 و LmMAPK9 و LmMAPK13. ومع ذلك ، فإن ثمانية من خرائط الليشمانيا لها شكل فسفرة TDY15. تم تحديد اثنين على الأقل من متجانسات مجاهدي خلق في الليشمانيا sp. ، LmxMKK18 و MEKK ذات الصلة كيناز (MRK1) 19. هذا يشير إلى أن الأفكار المحددة في الليشمانيا يمكن أن تترجم إلى أنظمة الثدييات. وحيثما لا تترجم إلى نظم الثدييات، فإنها تمثل أهدافا علاجية لعلاج داء الليشمانيات.
من أجل استخدام L. promastigotes الرئيسية لدراسة إصلاح الغشاء والتفاعلات مع السموم ، هناك حاجة إلى تقنيات متوسطة الإنتاجية. في حين أن التصوير بالخلايا الحية عالي الدقة يتيح تصور البروتينات والأغشية المصنفة في الوقت الفعلي ، إلا أنه منخفض الإنتاجية وقد لا يقيس البقاء الخلوي. تشمل فحوصات قابلية الإنتاجية المتوسطة امتصاص الصبغة المقاس بقياس التدفق الخلوي ، أو قياس نشاط الميتوكوندريا ، أو إطلاق البروتينات الخلوية مثل نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH). في خلايا الثدييات ، لا تقيس فحوصات LDH كميا موت الخلايا20. علاوة على ذلك ، فإن المقايسات القائمة على السكان مثل إطلاق LDH أو نشاط الميتوكوندريا لا تسمح بتحليل قوي أحادي الخلية أو متعدد المعلمات20. في المقابل ، تتيح المقايسات القائمة على قياس التدفق الخلوي تحليل خلية واحدة متعددة المعلمات20. ومع ذلك ، لم يتم تطبيق هذه المقايسات لفهم بيولوجيا السموم أو الاستجابات للسموم في L. promastigotes الرئيسية.
في هذه الدراسة ، تم استخدام SLO كأداة لفهم اضطراب غشاء البلازما للمتحولة الخالية من sphingolipid ل L. major في اثنين من المخازن المؤقتة المختلفة - وسائط M199 المستخدمة بشكل روتيني لاستزراع L. promastigotes الرئيسية وأبسط Tyrode's buffer. يتم وصف مقايسة قياس التدفق الخلوي متوسط الإنتاجية واستخدامها لتوليد منحنيات الاستجابة للجرعة السمية. يتم نمذجة البيانات من مقايسة قياس التدفق الخلوي إلى منحنى لوجستي لتحديد قيم LC50. باستخدام هذه المعلومات ، يمكن تحديد جرعة فرعية من SLO بحيث يمكن التحقق من صحة الأجسام المضادة MAPK باستخدام النشاف الغربي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2 mL microtiter (Marsh) tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-376</td>
			<td>Cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Toxin dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Avantor VWR (Radnor, PA)</td>
			<td>89039-666</td>
			<td>To hold cells and media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP399</td>
			<td>For cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2&#160;</td>
			<td>Walmart&#160; (Fayetteville, AR)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x M199</td>
			<td>Cell-gro</td>
			<td>11150067</td>
			<td>Basal growth media for L. major promastigotes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td>To culture cells in sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Fraction V acceptable purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP510-100</td>
			<td>Stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>To pellet the cells from culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 Mono-reactive dye pack</td>
			<td>Cytiva (Marlborough, MA)</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>Fluorophore label for toxins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH1002</td>
			<td>To denature protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0732-100G</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft (Redmond, VA)</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (4-laser Attune NxT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cytometer for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD (Ashland, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td>Fixative for counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP673-1</td>
			<td>Selection agent for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Dilute 1:4 for cleaning cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human red blood cells</td>
			<td>Zen-bio (Durham, NC)</td>
			<td>SER-10MLRBC</td>
			<td>To validate toxin activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 55i</td>
			<td>To visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88018</td>
			<td>For probing proteins via antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td></td>
			<td>To dispense reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>To run SDS-PAGE and transfers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40016</td>
			<td>Stock concentration 2 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>To determine molecular weight of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-3302</td>
			<td>To separate proteins based on their size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>DY992</td>
			<td>To seal plates with cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptolysin O C530A plasmid insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptolysin O C530A toxin</td>
			<td>Lab purified</td>
			<td></td>
			<td>Specific activity&#160; 4.34 x 105 HU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>75003607</td>
			<td>To centrifuge cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>651206</td>
			<td>For cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BV1000</td>
			<td>To mix cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (Chemi-doc)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>To visualize proteins by western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3930</td>
			<td>Transfer proteins to nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>3030-700</td>
			<td>Used in transfer of proteins to nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9102S</td>
			<td>Rabbit (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody</td>
			<td>CreativeBioLabs&#160;</td>
			<td>Cat# WIC79.3</td>
			<td>Mouse (1: 1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MEK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9122L</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP conjugate</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>Cat#715-035-151</td>
			<td>Donkey (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phosphoERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9101S</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pMEK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9121S</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP conjugate</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>Cat#711-035-152</td>
			<td>Donkey (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T5168</td>
			<td>Mouse (1: 2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leishmania major Genotypes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reference: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Episomal addback (spt2-/+SPT2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#916;spt2::HYG/&#916;spt2:PAC/+pXG-SPT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#916;spt2::HYG/&#916;spt2::PAC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type (WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the molecular mechanism and function of pore-forming toxins using leishmania major

يعد فهم وظيفة وآلية السموم المكونة للمسام (PFTs) أمرا صعبا لأن الخلايا تقاوم تلف الغشاء الناجم عن PFTs. في حين أن النهج الفيزيائية الحيوية تساعد على فهم تكوين المسام ، فإنها غالبا ما تعتمد على الأساليب الاختزالية التي تفتقر إلى المجموعة الكاملة من الدهون الغشائية والبروتينات. توفر الخلايا البشرية المستزرعة نظاما بديلا ، لكن تعقيدها وتكرارها في آليات الإصلاح يجعل تحديد آليات معينة أمرا صعبا. في المقابل ، فإن العامل الممرض البشري الأولي المسؤول عن داء الليشمانيات الجلدي ، الليشمانيا الكبرى ، يوفر توازنا مثاليا بين التعقيد والأهمية الفسيولوجية. L. major قابل للتتبع وراثيا ويمكن استزراعه بكثافة عالية في المختبر ، ويمكن قياس أي تأثير للاضطرابات على العدوى في نماذج الفئران الراسخة. بالإضافة إلى ذلك ، يقوم L. major بتوليف الدهون المتميزة عن نظيراتها في الثدييات ، والتي يمكن أن تغير ديناميكيات الغشاء. يمكن التحقيق في هذه التغييرات في ديناميكيات الغشاء باستخدام PFTs من عائلة السموم الأفضل تميزا ، وهي السيتوليسينات المعتمدة على الكوليسترول (CDCs). ترتبط CDCs بالإرغوستيرول في غشاء الليشمانيا ويمكن أن تقتل L. promastigotes الرئيسية ، مما يشير إلى أن L. major هو نظام نموذجي مناسب لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية لوظيفة PFT. يصف هذا العمل طرق اختبار وظيفة PFT في L. promastigotes الرئيسية ، بما في ذلك زراعة الطفيليات ، والأدوات الوراثية لتقييم حساسية الدهون ، ومقايسات ربط الغشاء ، ومقايسات موت الخلايا. ستمكن هذه المقايسات من الاستخدام السريع ل L. major كنظام نموذجي قوي لفهم وظيفة PFT عبر مجموعة من الكائنات الحية المتنوعة تطوريا والقواسم المشتركة في تنظيم الدهون.

زيادة حساسية promastigote ل SLO في المخزن المؤقت ل Tyrode مقارنة ب M199 تمت مقارنة حساسية SLO ل L. promastigotes الرئيسية بين مخازن الفحص المختلفة. تم تحدي promastigotes من النوع البري و spt2- / + SPT2 مع SLO في M199 الخالي من المصل أو المخزن المؤقت ل Tyrode المكمل ب 2 mM CaCl2 لمدة 30 دقيقة قبل ...

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major at JoVE.com

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

يظهر هنا بروتوكول يستخدم promastigotes الليشمانيا الرئيسية لتحديد الارتباط ، والسمية الخلوية ، والإشارات التي تسببها السموم المكونة للمسام. يتم توفير إثبات المفهوم مع ستربتوليسين O. يمكن أيضا استخدام السموم الأخرى للاستفادة من الطفرات الجينية المتاحة في L. major لتحديد آليات جديدة لمقاومة السموم.

فك رموز الآلية الجزيئية ووظيفة السموم المكونة للمسام باستخدام الليشمانيا الكبرى

Understanding the function and mechanism of pore-forming toxins (PFTs) is challenging because cells resist the membrane damage caused by PFTs. While ...

آلية مقاومة السموم المكونة للمسام غير مفهومة بشكل جيد. يتيح بروتوكولنا وظيفة وآلية تكوين السموم باستخدام نظام الليشمانيا الكبرى ، وهو نظام قابل للتتبع وراثيا وذو صلة من الناحية الفسيولوجية. الميزة الرئيسية لمقايسة السمية الخلوية هي مقارنة صلاحية الخلية لأنماط ظاهرية متعددة على مستوى خلية واحدة في مقايسة متوسطة الإنتاجية عند تحديها بالسموم في الوقت الفعلي.العوامل المسببة للاضطراب في الغشاء مثل الأمفوتريسين B هي علاجات الخط الأمامي لليشمانيا. يتيح هذا الفحص تحديد العوامل التي تحفز الأمفوتريسين B و / أو العوامل الجديدة الضارة بالغشاء. يوفر هذا الفحص نظرة ثاقبة لمجالات مثل استجابة الإصلاح ومسارات الإشارات المتعلقة باستجابات الإصلاح.يمكن تطبيق هذا الفحص على الأوليات مثل المثقبيات والنيجلرية الداجنة. يجد الناس صعوبة في فهم سلسلة التخفيف التسلسلي للسموم. لذا فإن أفضل نصيحة يمكنني تقديمها هي رسم تخطيطي لسلسلة التخفيف التسلسلي قبل إعداد التجربة.للبدء ، احتفظ ب 0.5 ملليلتر من promastigotes المعالجة في أنبوب منفصل كتحكم غير ملوث. أضف ملليغرام لكل ملليلتر بروبيديوم يوديد ، أو PI ، إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى promastigotes المتبقية. دوامة لمدة ثلاث ثوان.أضف promastigotes المعالجة إلى كل بئر من قاع V أو لوحة 96 بئر أو أنابيب المستنقعات ، وضع اللوحة أو رف الأنبوب على الجليد بزاوية 45 درجة تقريبا من المشاهدة. أضف 100 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت مع يوديد البروبيديوم إلى كل عنصر تحكم خال من السموم. تحقق من إضافة عنصر التحكم بشكل صحيح عن طريق التعرف بصريا على الأنابيب ذات الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر والتي تظهر أغمق في اللون.أضف حجم السم إلى أعلى تخفيف. ثم ، تمييع السم بشكل متسلسل. ماصة لأعلى ولأسفل ثماني مرات على الأقل لضمان الخلط.بدءا من أدنى تركيز للسموم ، أضف بسرعة 100 ميكرولتر من السم إلى الصف الصحيح ، واستمر حتى تتم إضافة كل السم إلى الخلايا. ختم اللوحة بشريط مانع للتسرب. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، قم بتعبئة اللوحة ونقلها إلى مقياس التدفق الخلوي.للحصول على البيانات ، ابدأ بإعداد مقياس التدفق الخلوي وبرنامج الاستحواذ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وسياسة كل منشأة. باستخدام عينة L.major promastigote غير الملوثة ، اضبط بوابات التشتت الأمامي والجانبي ومعلمات الفلورسنت الأولية بناء على الأصباغ المختارة. باستخدام أدوات تحكم ذات صبغة واحدة ، اضبط بوابات صبغة الصلاحية وأي سموم تحمل علامة الفلورسنت.راقب التشتت الأمامي مقابل الوقت للسجلات الدقيقة ، واحصل على أكثر من 10،000 حدث مسور لكل عينة على مقياس الخلايا. لتحليل البيانات ، بوابة مجموع خلية واحدة L.major promastigotes عن طريق بوابة على التشتت الأمامي والجانبي والوقت حسب الحاجة. استخدم الارتفاع أو المساحة على النحو الموصى به لمقياس التدفق الخلوي.تحديد وبوابة الخلايا الميتة على أنها PI عالية. تنظيم منحنى الجرعة والاستجابة في Excel للتحليل. حدد متوسط النسبة المئوية ل PI عالية لكل شرط بين التكرارين الفنيين.قم بتضمين تركيز السم ومتوسط التحلل النوعي للنسبة المئوية ، جنبا إلى جنب مع التفاصيل التجريبية و / أو الحسابات العالية لنسبة PI الخام. قم بتسمية أربعة أعمدة أخرى كقيم نموذجية وبقايا ومعلمات ومعلمات. تحقق من أن الأعمدة الأولى تتوافق مع المعلمات التجريبية وتركيز السم والتحلل النوعي بالنسبة المئوية.قم بتهيئة المعلمات L وk وc عن طريق إدخال القيم في عمود قيم المعلمات. في العمود نموذج، قم بإنشاء النموذج اللوجستي. في عمود المتبقيات، احسب مربع الفرق بين الرقم النموذجي والتحلل المحدد الفعلي.في العمود قيم المعلمات، بجوار SUM، اجمع كل القيم الموجودة في عمود المتبقيات. في عمود قيم المعلمات، بجوار LC50، قم بتهيئة المعادلة لحساب LC50 من القيم المحددة. افتح Solver من علامة التبويب البيانات.حدد الهدف المحدد ليكون الخلية التي تحتوي على مجموع البقايا المحسوبة. اضبطه على Min. قم بتغيير الخلايا المتغيرة لقيم المعلمات L و k و c.بالنسبة لقيم k السالبة ، قم بتعديل المعادلات عن طريق تحليل سالب واحد من k لتغيير k إلى موجب. استخدم طريقة الحل غير الخطي GRG، وانقر فوق حل. تحقق من المنحنى وأن LC50 يتم حسابه تلقائيا.تحقق من الملاءمة عن طريق رسم بياني لكل من التحلل النوعي للنسبة المئوية والنمذجة مقابل تركيز السموم. كانت promastigotes SPT2 التي تعاني من نقص السفينغوليبيد حساسة ل SLO في كل من M199 الخالي من المصل ومخزن Tyrode. كان النوع البري و SPT2 promastigotes الإضافي مقاوما ل SLO في M199 الخالي من المصل ولكن كان لديه أقل من 20٪ تحلل محدد في مخزن Tyrode.كانت promastigotes بالضربة القاضية SPT2 أكثر حساسية بثمانية أضعاف تقريبا ل SLO في المخزن المؤقت ل Tyrode مقارنة ب M199. توضح هذه البيانات أن حساسية السموم قد تختلف بناء على المخزن المؤقت المستخدم. لوحظ وجود نطاق 120 كيلودالتون لفوسفو-مجاهدي خلق في L.major promastigotes.بالنسبة لإجمالي مجاهدي خلق ، لوحظت نطاقات عند حوالي 120 كيلودالتون و 55 كيلو دالتون ، والتي تتوافق مع أحجام MRK1 و LmxMKK ، على التوالي. اكتشف Phospho-ERK نطاقات مماثلة ، في حين أن تلطيخ الأجسام المضادة ERK لم يكن قويا في هذا الفحص. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو ضمان التعامل السليم مع السم.يمكن استخدام الليشمانيا كنموذج قابل للتتبع وراثيا لدراسة إصلاح غشاء البلازما ، مما يوفر رؤى جديدة في ميكانيكا إصلاح الغشاء أثناء تفاعل بكتيريا الليشمانيا في الأمعاء الوسطى لذبابة الرمل.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط ​​الفرعية صورة مقطعية

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

في الكشف الموضعي للخلايا CD4 T Autoreactive في الدماغ والقلب عن طريق التوافق النسيجي الرئيسية الدرجة الثانية مجمع Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

فك رموز والتصوير إمراض وحبال من<em&gt; المتفطرة خراج</em&gt; في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...