Name: deciphering the molecular mechanism and function of pore-forming toxins using leishmania major
Uploaded: 2022-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major at JoVE.com

著者らは、原稿の批判的レビューに対してKeyelとZhangの研究室のメンバーに感謝したいと思います。著者らは、施設の使用について教養学部顕微鏡法に感謝します。

RG2病原体リー シュマニアメジャー および組換えDNAの使用および取り扱いには、すべての適切なガイドラインおよび標準的な微生物学的、安全性、および細胞培養慣行が採用されました。ライブ L.メジャー を使用したすべての実験は、BSL-2認定ラボのバイオセーフティキャビネットで実施されました。この作業は、テキサス工科大学の機関バイオセーフティ委員会によって監督?...

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	<li>Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+macrophages+and+cholesterol-dependent+cytolysins:+The+impact+on+immune+response+and+cellular+survival.">Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival.</a> Toxins. 12 (9), 531 (2020).</li><li>Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+streptolysin+O+in+a+mouse+model+of+invasive+group+A+streptococcal+disease.">Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease.</a> Infection &amp; Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).</li><li>Farrand, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholesterol-dependent+cytolysin+membrane-binding+interface+discriminates+lipid+environments+of+cholesterol+to+support+beta-barrel+pore+insertion.">The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).</li><li>Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+elements+of+the+cholesterol-dependent+cytolysins+that+are+responsible+for+their+cholesterol-sensitive+membrane+interactions.">Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).</li><li>Schoenauer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+acid+sphingomyelinase+and+neutral+sphingomyelinase-2+inversely+determines+the+cellular+resistance+to+plasmalemmal+injury+by+pore-forming+toxins.">Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins.</a> FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).</li><li>Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+repair+triggered+by+cholesterol-dependent+cytolysins+is+activated+by+mixed+lineage+kinases+and+MEK.">Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK.</a> Science Advances. 8 (11), (2022).</li><li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+annexin+A1+reveals+dynamics+of+ceramide+platforms+in+living+cells.">Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells.</a> Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).</li><li>Jimenez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESCRT+machinery+is+required+for+plasma+membrane+repair.">ESCRT machinery is required for plasma membrane repair.</a> Science. 343 (6174), 1247136 (2014).</li><li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle.">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).</li><li>Wolfmeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2)(+)-dependent+repair+of+pneumolysin+pores:+A+new+paradigm+for+host+cellular+defense+against+bacterial+pore-forming+toxins.">Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).</li><li>Bravo, F., Sanchez, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+re-emerging+cutaneous+infectious+diseases+in+Latin+America+and+other+geographic+areas.">New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas.</a> Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).</li><li>Manfredi, M., Iuliano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+leishmaniasis+with+long+duration+and+bleeding+ulcer.">Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer.</a> Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+are+essential+for+differentiation+but+not+growth+in+Leishmania.">Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania.</a> EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).</li><li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+de+novo+synthesis+and+salvage+of+lipids+by+Leishmania+amastigotes.">Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes.</a> Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).</li><li>Kaur, P., Goyal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+mitogen+activated+protein+kinases+in+protozoan+parasites.">Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites.</a> Biochimie. 193, 78-89 (2022).</li><li>Wiese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+MAP+kinases--Familiar+proteins+in+an+unusual+context.">Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context.</a> International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).</li><li>Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite+mitogen-activated+protein+kinases+as+drug+discovery+targets+to+treat+human+protozoan+pathogens.">Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens.</a> Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).</li><li>Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+involved+in+flagellar-length+control.">Protein kinase involved in flagellar-length control.</a> Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).</li><li>Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential,+putative+MEK+kinase+of+Leishmania+major.">An essential, putative MEK kinase of Leishmania major.</a> Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).</li><li>Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+parameters+beyond+lipid+binding+affinity+drive+cytotoxicity+of+cholesterol-dependent+cytolysins.">Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins.</a> Toxins. 11 (1), (2018).</li><li>Beneke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+Cas9+high-throughput+genome+editing+toolkit+for+kinetoplastids.">A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids.</a> Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).</li><li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression.">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li><li>Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylcholine+synthesis+through+cholinephosphate+cytidylyltransferase+is+dispensable+in+Leishmania+major.">Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major.</a> Scientific Reports. 9, 7602 (2019).</li><li>Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bacterial+toxin+induced+responses+using+live+cell+fluorescence+microscopy.">Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).</li><li>Romero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+repair+protects+cells+from+pore-forming+toxins+by+microvesicle+shedding.">Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).</li><li>Keyel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+porous+defects+in+plasma+membranes+of+adenosine+triphosphate-depleted+Madin-Darby+canine+kidney+cells+and+its+inhibition+by+glycine.">Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine.</a> Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).</li><li>Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+small+molecules+prevent+macrophage+lysis+during+pyroptosis.">Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (4), 326 (2019).</li></ol>

本研究では、ヒト病原体 リーシュマニアメジャー をモデル系として、PFTの分子メカニズムと機能を研究する方法について説明しました。単一細胞生存率を測定するためのミディアムスループットフローサイトメトリーベースの細胞毒性アッセイが開発されました。LC50 値はロジスティックモデリングを使用して用量反応曲線から計算できるため、生存率は集団レベルで定量的?...

孔形成毒素(PFT)は細菌毒素の最大のファミリーですが1、それらが細胞を穿孔して破壊するメカニズムはよくわかっていません。最もよく研究されている細孔形成毒素のファミリーは、コレステロール依存性サイトライシン(CDC)のファミリーです。CDCは主に、壊死性筋膜炎の原因物質である化膿レンサ球菌2を含むグラム陽性菌によって合成されます。化膿菌はCDCストレプトリジンO(SLO)を分泌し、宿主細胞の原形質膜のステロールにモノマーとして結合し、オリゴマー化し、膜1に~20-30 nmの細孔を挿入します。このプロセスで脂質が果たす役割は、十分に決定されていないままです。
脂質-CDC相互作用を研究するための1つのアプローチは、化学的に定義されたリポソームの使用である。定義されたリポソームは、毒素結合と細孔形成を維持するために必要な脂質の閾値に関する情報を提供しますが3,4、細胞機能を完全には再現していません。例えば、再構成されたリポソームは、毒素に応答する哺乳動物宿主および脂質修飾の脂質非対称性を欠いている5。リポソームに代わる1つは、哺乳類細胞株を使用することである。これらの細胞株はより生理学的に関連性がありますが、毒素の感知と耐性のメカニズムには大きな冗長性があります2。結果として、CDCに抵抗するために使用される修復経路は十分に決定されていないままです。特に、Ca2+流入は膜修復の主要な活性化因子である1。Ca2+流入の下流には、セラミド依存性修復経路6,7およびMEK依存性修復経路6を含む複数の経路が関与している。これらの経路は、輸送に必要なエンドソームソーティング複合体(ESCRT)8、およびアネキシン6,9,10を含む他のタンパク質エフェクターと相互作用します。哺乳類細胞におけるこれらの経路を解剖することは、データの解釈を混乱させる冗長性のために困難である。
修復経路を解剖するための複雑さと単純さのバランスをとる1つの方法は、リーシュマニア属の原生動物病原体などのより単純な生物を使用することです。リーシュマニア属 人間や他の動物にリーシュマニア症を引き起こします。リーシュマニア症は、種やその他の要因に応じて、皮膚リーシュマニア症(自己限定性皮膚病変)から致命的な内臓リーシュマニア症(肝脾腫)までさまざまです11。皮膚リーシュマニア症の原因物質であるリーシュマニアメジャーは、サンドフライベクターを介してヒトに伝達され、リーシュマニアの機能と感染を理解するために使用されます12。また、リーシュマニア属は12遺伝子性である。それらは、アマスティゴテスと呼ばれる細胞内哺乳類マクロファージ寄生虫として、およびサンドフライ12の自由に泳ぐ鞭毛前鞭毛虫として存在します。L.主要な前鞭毛虫は、M199などの血清添加培地で高密度に培養することができます13。プロマスティゴテスも遺伝的に扱いやすいです。脂質生合成経路を標的とするものを含む多くの遺伝子ノックアウトが存在する13。これらのノックアウトは、Balb/cマウスの感染による感染力および病変発生の成長および差異について評価することができる13。
リーシュマニア培養の比較的容易さと脂質生合成ノックアウトの範囲に加えて、寄生虫は哺乳類よりも単純なゲノムを持っています。リーシュマニアの最も特徴的な種はL.メジャーであり、脂質代謝に欠陥のある突然変異体など、多くの既存の遺伝的ツールがあります14。特に、多くの修復タンパク質は存在しません。L. majorは、アネキシンなどの主要な哺乳類修復タンパク質についてこれまでに同定されたホモログを有していない。これにより、哺乳類システムの複雑さなしに、進化的に保存された修復経路の特性評価が可能になります。しかし、修復経路は今日までリーシュマニアでは特徴付けられていません。同時に、MEK経路6などの修復に関与する主要なシグナル伝達経路は、リーシュマニアsp.15,16に保存されていますが、ホモログを検証する必要があります。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路はL. mexicanaでよく研究されており、哺乳類細胞の細胞内生存と熱安定性に寄与し、メタサイクロジェネシスを制御します16。リーシュマニア属では、15個のMAPKのうち10個が特徴付けられています17。LmMAPK9およびLmMAPK13は、保存されたリン酸化リップ配列における同一性に基づいて、哺乳類ERK1/2に最も類似していると予測される。リン酸化リップ配列は、哺乳類のERK1/2およびLmMAPK9およびLmMAPK13の両方でTEYです。しかしながら、リーシュマニアMAPKのうち8つはTDYリン酸化モチーフ15を有する。リーシュマニア属では、MEKの少なくとも2つのホモログ、LmxMKK18およびMEKK関連キナーゼ(MRK1)19が同定されています。これは、リーシュマニアで特定された洞察が哺乳類のシステムに変換できることを示唆しています。それらが哺乳類系に変換されない場合、それらはリーシュマニア症を治療するための治療標的を表す。
L. major promastigotesを使用して膜修復および毒素との相互作用を研究するためには、中程度のスループット技術が必要です。高解像度のライブセルイメージングは、標識されたタンパク質や膜をリアルタイムで可視化することができますが、スループットが低く、細胞の生存率を測定しない可能性があります。ミディアムスループット生存率アッセイには、フローサイトメトリーによる色素取り込みの測定、ミトコンドリア活性の測定、または乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)などの細胞タンパク質の放出が含まれます。哺乳動物細胞では、LDHアッセイは細胞死を定量的に測定しない20。さらに、LDH放出やミトコンドリア活性などの集団ベースのアッセイでは、堅牢なシングルセルまたはマルチパラメトリック分析はできません20。対照的に、フローサイトメトリーベースのアッセイは、マルチパラメトリックシングルセル解析を可能にします20。しかし、これらのアッセイは、L.主要な前鞭毛虫の毒素生物学または毒素に対する応答の理解には適用されていません。
この研究では、SLOは、L.メジャーの前鞭毛虫の培養に日常的に使用されているM199培地とより単純なTyradeバッファーの2つの異なるバッファーにおけるL.メジャーのスフィンゴ脂質ヌル変異体の原形質膜摂動を理解するためのツールとして使用されます。ミディアムスループットフローサイトメトリーアッセイが説明され、毒素の用量反応曲線を生成するために使用されます。フローサイトメトリーアッセイからのデータは、LC50値を決定するためにロジスティック曲線にモデル化されます。この情報を使用して、SLOのサブライティック用量を決定し、ウェスタンブロッティングを使用してMAPK抗体を検証できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2 mL microtiter (Marsh) tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-376</td>
			<td>Cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Toxin dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Avantor VWR (Radnor, PA)</td>
			<td>89039-666</td>
			<td>To hold cells and media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP399</td>
			<td>For cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2&#160;</td>
			<td>Walmart&#160; (Fayetteville, AR)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x M199</td>
			<td>Cell-gro</td>
			<td>11150067</td>
			<td>Basal growth media for L. major promastigotes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td>To culture cells in sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Fraction V acceptable purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP510-100</td>
			<td>Stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>To pellet the cells from culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 Mono-reactive dye pack</td>
			<td>Cytiva (Marlborough, MA)</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>Fluorophore label for toxins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH1002</td>
			<td>To denature protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0732-100G</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft (Redmond, VA)</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (4-laser Attune NxT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cytometer for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD (Ashland, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td>Fixative for counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP673-1</td>
			<td>Selection agent for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Dilute 1:4 for cleaning cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human red blood cells</td>
			<td>Zen-bio (Durham, NC)</td>
			<td>SER-10MLRBC</td>
			<td>To validate toxin activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 55i</td>
			<td>To visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88018</td>
			<td>For probing proteins via antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td></td>
			<td>To dispense reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>To run SDS-PAGE and transfers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40016</td>
			<td>Stock concentration 2 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>To determine molecular weight of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-3302</td>
			<td>To separate proteins based on their size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>DY992</td>
			<td>To seal plates with cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptolysin O C530A plasmid insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptolysin O C530A toxin</td>
			<td>Lab purified</td>
			<td></td>
			<td>Specific activity&#160; 4.34 x 105 HU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>75003607</td>
			<td>To centrifuge cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>651206</td>
			<td>For cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BV1000</td>
			<td>To mix cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (Chemi-doc)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>To visualize proteins by western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3930</td>
			<td>Transfer proteins to nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>3030-700</td>
			<td>Used in transfer of proteins to nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9102S</td>
			<td>Rabbit (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody</td>
			<td>CreativeBioLabs&#160;</td>
			<td>Cat# WIC79.3</td>
			<td>Mouse (1: 1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MEK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9122L</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP conjugate</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>Cat#715-035-151</td>
			<td>Donkey (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phosphoERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9101S</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pMEK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9121S</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP conjugate</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>Cat#711-035-152</td>
			<td>Donkey (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T5168</td>
			<td>Mouse (1: 2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leishmania major Genotypes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reference: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Episomal addback (spt2-/+SPT2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#916;spt2::HYG/&#916;spt2:PAC/+pXG-SPT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#916;spt2::HYG/&#916;spt2::PAC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type (WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the molecular mechanism and function of pore-forming toxins using leishmania major

細胞はPFTによって引き起こされる膜損傷に抵抗するため、孔形成毒素(PFT)の機能とメカニズムを理解することは困難です。生物物理学的アプローチは細孔形成を理解するのに役立ちますが、膜脂質とタンパク質の完全な補体がない還元主義的アプローチに依存することがよくあります。培養ヒト細胞は代替システムを提供しますが、修復メカニズムの複雑さと冗長性により、特定のメカニズムを特定することは困難です。対照的に、皮膚リーシュマニア症の原因となるヒト原虫病原体である リーシュマニアメジャーは、複雑さと生理学的関連性の間の最適なバランスを提供します。 L. major は遺伝的に扱いやすく、 in vitroで高密度に培養することができ、感染に対する摂動の影響は、確立されたマウスモデルで測定できます。さらに、 L. major は哺乳類の対応するものとは異なる脂質を合成し、膜動態を変化させる可能性があります。膜動態におけるこれらの変化は、最も特徴付けられた毒素ファミリーであるコレステロール依存性サイトライシン(CDC)のPFTで調べることができます。CDCは リーシュマニア 膜のエルゴステロールに結合し、 L.メジャー 前鞭虫を殺すことができ、 L.メジャー がPFT機能の細胞および分子メカニズムを決定するための適切なモデルシステムであることを示しています。この研究では、寄生虫培養、脂質感受性を評価するための遺伝的ツール、膜結合アッセイ、および細胞死アッセイを含む、 L.主要な 前鞭毛虫のPFT機能を試験する方法について説明しています。これらのアッセイにより、進化的に多様な生物の範囲にわたるPFT機能および脂質組織の共通性を理解するための強力なモデルシステムとして L.メジャー を迅速に使用できるようになります。

M199と比較したタイロード緩衝液中のSLOに対する前鞭毛虫感受性の増加 L.主要前鞭毛虫のSLO感受性を異なるアッセイバッファー間で比較した。野生型、spt2-、およびspt2-/+SPT2プロマスティゴテスに、フローサイトメーターで分析する前に、無血清M199または2 mM CaCl2を添加したTyrodeバッファーで30分間SLOに挑戦しました。分析に適した寄?...

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Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

ここに提示されるのは、孔形成毒素によって誘導される結合、細胞毒性、およびシグナル伝達を決定するために リーシュマニアの主要な 前鞭毛虫を使用するプロトコルです。ストレプトリジンOの概念実証が提供されます。他の毒素を使用して、 L.メジャー で利用可能な遺伝子変異体を活用して、毒素耐性の新しいメカニズムを定義することもできます。

リーシュマニアメジャーを用いた細孔形成毒素の分子機構と機能の解明

Understanding the function and mechanism of pore-forming toxins (PFTs) is challenging because cells resist the membrane damage caused by PFTs. While ...

細孔形成毒素に対する耐性のメカニズムはよく理解されていません。私たちのプロトコルは、遺伝的に扱いやすく生理学的に関連するシステムであるリーシュマニアメジャーを使用して毒素を形成する機能とメカニズムを可能にします。細胞毒性アッセイの主な利点は、毒素にリアルタイムで挑戦した場合、ミディアムスループットアッセイで複数の表現型の細胞生存率を単一細胞レベルで比較できることです。アムホテリシンBのような膜摂動剤は、リーシュマニアの最前線の治療法です。このアッセイにより、アムホテリシンBおよび/または新しい膜損傷剤を増強する薬剤の同定が可能になります。このアッセイは、修復応答や修復応答に関連するシグナル伝達経路などの領域への洞察を提供します。このアッセイは、トリパノソーマやナエグレリア・ファウレリなどの原生動物に適用できます。人々は毒素の連続希釈シリーズを理解するのが難しいと感じています。したがって、私ができる最善のアドバイスは、実験を設定する前に、連続希釈シリーズの概略図を描くことです。はじめに、0.5ミリリットルの処理済み前鞭毛を別のチューブに染色されていない対照として予約します。残りの前鞭毛虫に1ミリリットルあたり10マイクログラムの最終濃度に1ミリリットルあたり2ミリグラムのヨウ化プロピジウム、またはPIを追加します。3秒間渦を巻きます。処理済みのプロマスティゴットをV底、96ウェルプレートまたはマーシュチューブの各ウェルに追加し、プレートまたはチューブラックを氷の上に約45度の角度で置きます。ヨウ化プロピジウムを含む100マイクロリットルのアッセイバッファーを各無毒素コントロールに追加します。色が濃く見える総容量200マイクロリットルのチューブを視覚的に識別することにより、コントロールが正しく追加されたことを確認します。毒素の量を最高希釈液に加えます。次に、毒素を順次希釈します。混合を確実にするために、少なくとも8回上下にピペットします。最低の毒素濃度から始めて、100マイクロリットルの毒素を正しい行にすばやく追加し、すべての毒素が細胞に追加されるまで続けます。プレートをシーリングテープでシールします。摂氏37度で30分間インキュベートした後、プレートを包装してフローサイトメーターに輸送します。データ取得の場合は、製造元の指示と施設のポリシーに従って、フローサイトメーターと取得ソフトウェアをセットアップすることから始めます。染色されていないL.majorプロマスティゴートサンプルを使用して、前方散乱と側方散乱のゲートと、選択した色素に基づく初期蛍光パラメータを設定します。単一染色コントロールを使用して、生存率色素および蛍光標識された毒素のゲートを設定します。マイクロクロッグの前方散乱対時間を監視し、サイトメーター上の各サンプルについて10, 000を超えるゲートイベントを取得します。データ解析のために、必要に応じて前方散乱と側方散乱および時間にゲーティングすることにより、全単一細胞L.major前鞭毛虫をゲートします。フローサイトメーターに推奨される高さまたは面積を使用してください。死細胞をPIハイとして識別してゲートします。分析のためにExcelで線量反応曲線を整理します。2つのテクニカル反復間の各条件の平均PI高率を求めます。毒素濃度と平均比溶解率、および/または生のパーセントPI高計算を含めます。さらに 4 つの列に、モデル、残差、パラメーター、およびパラメーター値というラベルを付けます。最初の列が実験パラメータ、毒素濃度、および比溶解率に対応していることを確認します。パラメーター L、k、および c を初期化するには、[パラメーター値] 列に値を入力します。[モデル済み] 列で、ロジスティック モデルを作成します。残差列で、モデル化された数と実際の比溶解との差の二乗を計算します。[パラメーター値] 列の [SUM] の横で、[残差] 列のすべての値を合計します。LC50の横にある[パラメータ値]列で、決定された値からLC50を計算する式を初期化します。[データ]タブからソルバーを開きます。計算された残差の合計を含むセルに設定目標を選択します。[最小] に設定します。L、k、および c のパラメータ値の変数セルを変更します。負の k 値の場合は、k から負の 1 を因数分解して方程式を変更し、k を正に変更します。GRG 非線形解析方法を使用し、[解析]をクリックします。曲線を確認し、LC50が自動的に計算されていることを確認します。特異的溶解率と毒素濃度に対するモデリングの両方をグラフィカルにプロットすることにより、適合度を検証します。スフィンゴ脂質欠損SPT2ノックアウト前鞭毛虫は、無血清M199およびタイロード緩衝液の両方でSLOに感受性を示した。野生型およびSPT2付加前鞭毛虫は、無血清M199ではSLOに耐性がありましたが、Tyrodeバッファーでの特異的溶解は20%未満でした。SPT2ノックアウト前鞭毛虫は、M199よりもタイロード緩衝液中のSLOに対して約8倍敏感であった。これらのデータは、毒素感受性が使用されるバッファーに基づいて変化する可能性があることを示しています。L.major前鞭毛虫のホスホMEKについて120キロダルトンのバンドが観察された。総MEKについて、約120キロダルトンおよび55キロダルトンのバンドが観察され、これらはそれぞれMRK1およびLmxMKKのサイズと一致した。Phospho-ERKは同様のバンドを検出しましたが、ERK抗体染色はこのアッセイでは堅牢ではありませんでした。この手順を試みるときに覚えておくべき最も重要なことは、毒素の適切な取り扱いを確実にすることです。リーシュマニアは、原形質膜修復を研究するための遺伝的に扱いやすいモデルとして利用することができ、サンドフライ中腸におけるリーシュマニア細菌相互作用中の膜修復メカニズムに関する新しい洞察を提供します。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

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ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

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主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...