Name: deciphering the molecular mechanism and function of pore-forming toxins using leishmania major
Uploaded: 2022-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major at JoVE.com

저자는 원고에 대한 비판적 검토에 대해 Keyel 및 Zhang 연구실 구성원에게 감사하고 싶습니다. 저자는 시설 사용에 대해 예술 과학 대학 현미경에 감사드립니다.

RG2 병원체 리슈만편모충 메이저 및 재조합 DNA의 사용 및 취급을 위해 모든 적절한 지침과 표준 미생물학적, 안전성 및 세포 배양 관행이 사용되었습니다. 살아있는 L. 전공 에 대한 모든 실험은 BSL-2 인증 실험실의 생물 안전 캐비닛에서 수행되었습니다. 이 작업은 텍사스 공대 기관 생물 안전위원회가 감독했습니다.
참고: 안전성 관점에서 살아있는 L. 주요...

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	<li>Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+macrophages+and+cholesterol-dependent+cytolysins:+The+impact+on+immune+response+and+cellular+survival.">Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival.</a> Toxins. 12 (9), 531 (2020).</li><li>Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+streptolysin+O+in+a+mouse+model+of+invasive+group+A+streptococcal+disease.">Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease.</a> Infection &amp; Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).</li><li>Farrand, A. 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A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+bacterial+toxin+induced+responses+using+live+cell+fluorescence+microscopy.">Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).</li><li>Romero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+repair+protects+cells+from+pore-forming+toxins+by+microvesicle+shedding.">Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).</li><li>Keyel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+porous+defects+in+plasma+membranes+of+adenosine+triphosphate-depleted+Madin-Darby+canine+kidney+cells+and+its+inhibition+by+glycine.">Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine.</a> Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).</li><li>Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+small+molecules+prevent+macrophage+lysis+during+pyroptosis.">Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (4), 326 (2019).</li></ol>

본 연구에서는 인간 병원균 리슈만편모충 전공 을 모델 시스템으로 사용하여 PFT의 분자 메커니즘과 기능을 연구하는 방법을 설명했습니다. 단일 세포 생존율을 측정하기 위한 배지-처리량 유세포분석-기반 세포독성 분석법이 개발되었다. LC50 값은 로지스틱 모델링을 사용하여 용량-반응 곡선에서 계산할 수 있기 때문에 모집단 수준에서 생존력이 정량적입니다. 원리 증명으로 유?...

기공 형성 독소(PFT)는 박테리아 독소의 가장 큰 계열이지만1, 세포를 천공하고 파괴하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 가장 잘 연구된 모공 형성 독소 계열은 콜레스테롤 의존성 세포질(CDC)입니다. CDC는 주로 괴사 성 근막염의 원인균 인 Streptococcus pyogenes2를 포함한 그람 양성 박테리아에 의해 합성됩니다. S. pyogenes 는 숙주 세포의 원형질막에 있는 스테롤에 단량체로 결합하여 올리고머화하고 ~20-30nm 기공을 막1에 삽입하는 CDC 스트렙톨리신 O(SLO)를 분비합니다. 이 과정에서 지질이하는 역할은 아직 결정되지 않았습니다.
지질-CDC 상호작용을 연구하는 한 가지 접근법은 화학적으로 정의된 리포좀을 사용하는 것입니다. 정의된 리포좀은 독소 결합 및 기공 형성3,4을 유지하는 데 필요한 지질의 역치에 대한 정보를 제공하지만 세포 기능을 완전히 요약하지는 않습니다. 예를 들어, 재구성된 리포좀은 포유류 숙주의 지질 비대칭성과 독소에 대한 반응의 지질 변형이 부족합니다5. 리포좀에 대한 한 가지 대안은 포유류 세포주를 사용하는 것입니다. 이러한 세포주는 생리학적으로 더 관련이 있지만 독소 감지 및내성 메커니즘에는 상당한 수준의 중복성이 있습니다2. 결과적으로 CDC에 저항하는 데 사용되는 복구 경로는 제대로 결정되지 않은 상태로 남아 있습니다. 특히,Ca 2+ 유입은 막 복구1의 주요 활성화 제입니다. Ca 2+ 유입의 하류에는 세라마이드 의존적 복구 6,7 및 MEK 의존적 복구 경로6를 포함한 여러 경로가 참여합니다. 이러한 경로는 수송에 필요한 엔도솜 분류 복합체(ESCRT)8 및 부속신 6,9,10을 포함한 다른 단백질 이펙터와 상호 작용합니다. 포유류 세포에서 이러한 경로를 해부하는 것은 데이터 해석을 혼란스럽게 하는 중복성으로 인해 어렵습니다.
복구 경로를 해부하기 위해 복잡성과 단순성의 균형을 맞추는 한 가지 방법은 Leishmania 속의 원생 동물 병원체와 같은 더 간단한 유기체를 사용하는 것입니다. 리슈만편모충 sp. 인간과 다른 동물에서 리슈만편모충증을 유발합니다. 리슈만편모충증은 종 및 기타 요인에 따라 피부 리슈만편모충증(자가 제한된 피부 병변)에서 치명적인 내장 리슈만편모충증(간비장비대)에 이르기까지 다양합니다11. 피부 리슈만편모충증의 원인균인 리슈만편모충은 모래편모충 벡터를 통해 인간에게 전염되며 리슈만편모충 기능과 감염을 이해하는 데 사용됩니다12. 또한, 리슈만편모충 sp. 아르 디제닉12. 그들은 amastigotes라고 불리는 세포 내 포유류 대 식세포 기생충과 모래 파리12에서 자유롭게 수영하는 편모 모양의 프로 마스 티고트로 존재합니다. L. 주요 프로마스티고테는 M199와 같은 혈청 보충 배지에서 고밀도13으로 배양할 수 있습니다. 프로마스티고테는 또한 유전적으로 다루기 쉽습니다. 지질 생합성 경로를 표적으로 하는 것을 포함하여 많은 유전자 녹아웃이 존재합니다13. 이러한 녹아웃은 Balb/c 마우스13의 감염을 통해 감염성 및 병변 발달의 성장 및 차이에 대해 평가할 수 있습니다.
리슈만편모충 배양의 상대적 용이성과 지질 생합성 녹아웃의 범위 외에도 기생충은 포유류보다 더 단순한 게놈을 가지고 있습니다. 리슈만편모충의 가장 잘 특성화된 종은 L. major로, 지질 대사에 결함이 있는 돌연변이와 같은 기존의 많은 유전 도구를 가지고 있습니다14. 특히, 많은 복구 단백질이 없습니다. L. major는 아넥신과 같은 주요 포유류 복구 단백질에 대해 현재까지 확인된 동족체가 없습니다. 이것은 포유류 시스템의 복잡성없이 진화 적으로 보존 된 복구 경로의 특성화를 가능하게합니다. 그러나 수리 경로는 현재까지 리슈만편모충에서 특성화되지 않았습니다. 동시에 MEK 경로6과 같은 복구와 관련된 주요 신호 전달 경로는 리슈만편모충 sp.15,16에서 보존되지만 동족체를 검증해야 합니다. 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로는 L. mexicana에서 잘 연구되어 포유류 세포의 세포 내 생존 및 열 안정성에 기여하고 메타 사이클 생성을 제어합니다16. 리슈만편모충 sp.에서는 15개의 MAPK 중 10개가17개로 특성화되었습니다. LmMAPK9 및 LmMAPK13은 보존된 인산화 립 서열에서의 동일성에 기초하여 포유동물 ERK1/2와 가장 유사한 것으로 예측된다. 인산화 립 서열은 포유동물 ERK1/2 및 LmMAPK9 및 LmMAPK13 둘 다에 대해 TEY이다. 그러나, 리슈만편모충 MAPK 중 8개는 TDY 인산화 모티프15를 갖는다. 적어도 두 개의 MEK 동족체가 리슈만편모충 sp., LmxMKK18 및 MEKK-관련 키나아제(MRK1)19에서 확인되었다. 이것은 리슈만편모충에서 확인된 통찰력이 포유류 시스템으로 번역될 수 있음을 시사합니다. 포유류 시스템으로 번역되지 않는 경우 리슈만편모충증 치료를 위한 치료 표적을 나타냅니다.
L. major promastigotes를 사용하여 막 복구 및 독소와의 상호 작용을 연구하려면 중간 처리량 기술이 필요합니다. 고해상도 라이브 셀 이미징을 사용하면 표지된 단백질과 막을 실시간으로 시각화할 수 있지만 처리량이 적고 세포 생존을 측정하지 못할 수 있습니다. 중간 처리량 생존력 분석에는 유세포 분석으로 측정한 염료 흡수, 미토콘드리아 활성 측정 또는 젖산 탈수소효소(LDH)와 같은 세포 단백질의 방출이 포함됩니다. 포유류 세포에서, LDH 분석은 세포 사멸을 정량적으로 측정하지 않는다20. 또한, LDH 방출 또는 미토콘드리아 활성과 같은 인구 기반 분석은 강력한 단일 세포 또는 다중 파라미터 분석을 허용하지 않습니다20. 대조적으로, 유세포분석 기반 분석은 다중 파라미터 단일 세포 분석을 가능하게 합니다(20). 그러나 이러한 분석은 독소 생물학 또는 L. 주요 프로마스티고테의 독소에 대한 반응을 이해하는 데 적용되지 않았습니다.
이 연구에서 SLO는 L. major promastigotes와 더 간단한 Tyrode 완충액을 배양하는 데 일상적으로 사용되는 M199 배지의 두 가지 다른 완충액에서 L. major의 스핑고지질 널 돌연변이의 원형질막 섭동을 이해하는 도구로 사용됩니다. 중간 처리량 유세포 분석 분석이 설명되고 독소 용량-반응 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 유동 세포분석 분석으로부터의 데이터는LC50 값을 결정하기 위해 로지스틱 곡선으로 모델링된다. 이러한 정보를 이용하여, SLO의 전분해 용량을 결정하여 웨스턴 블롯팅을 사용하여 MAPK 항체를 검증할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2 mL microtiter (Marsh) tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-376</td>
			<td>Cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Toxin dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Avantor VWR (Radnor, PA)</td>
			<td>89039-666</td>
			<td>To hold cells and media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP399</td>
			<td>For cell processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% H2O2&#160;</td>
			<td>Walmart&#160; (Fayetteville, AR)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x M199</td>
			<td>Cell-gro</td>
			<td>11150067</td>
			<td>Basal growth media for L. major promastigotes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Baker</td>
			<td></td>
			<td>To culture cells in sterile conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td>Fraction V acceptable purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP510-100</td>
			<td>Stock concentration 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>To pellet the cells from culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 Mono-reactive dye pack</td>
			<td>Cytiva (Marlborough, MA)</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>Fluorophore label for toxins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BSH1002</td>
			<td>To denature protein samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0732-100G</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft (Redmond, VA)</td>
			<td></td>
			<td>Data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (4-laser Attune NxT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Cytometer for data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD (Ashland, OR)</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td>Fixative for counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP673-1</td>
			<td>Selection agent for cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Dilute 1:4 for cleaning cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human red blood cells</td>
			<td>Zen-bio (Durham, NC)</td>
			<td>SER-10MLRBC</td>
			<td>To validate toxin activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 55i</td>
			<td>To visualize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88018</td>
			<td>For probing proteins via antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips</td>
			<td>Avantor VWR</td>
			<td></td>
			<td>To dispense reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>To run SDS-PAGE and transfers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40016</td>
			<td>Stock concentration 2 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein ladder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>To determine molecular weight of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-3302</td>
			<td>To separate proteins based on their size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>DY992</td>
			<td>To seal plates with cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptolysin O C530A plasmid insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptolysin O C530A toxin</td>
			<td>Lab purified</td>
			<td></td>
			<td>Specific activity&#160; 4.34 x 105 HU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging bucket rotor</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>75003607</td>
			<td>To centrifuge cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-bottom plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>651206</td>
			<td>For cytotoxicity assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BV1000</td>
			<td>To mix cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (Chemi-doc)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>To visualize proteins by western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3930</td>
			<td>Transfer proteins to nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>3030-700</td>
			<td>Used in transfer of proteins to nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9102S</td>
			<td>Rabbit (1:1000 dilution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody</td>
			<td>CreativeBioLabs&#160;</td>
			<td>Cat# WIC79.3</td>
			<td>Mouse (1: 1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MEK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9122L</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP conjugate</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>Cat#715-035-151</td>
			<td>Donkey (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phosphoERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9101S</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pMEK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>Cat# 9121S</td>
			<td>Rabbit (1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP conjugate</td>
			<td>Jackson Immunoresearch&#160;</td>
			<td>Cat#711-035-152</td>
			<td>Donkey (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T5168</td>
			<td>Mouse (1: 2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leishmania major Genotypes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reference: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Episomal addback (spt2-/+SPT2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#916;spt2::HYG/&#916;spt2:PAC/+pXG-SPT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#916;spt2::HYG/&#916;spt2::PAC&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type (WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deciphering the molecular mechanism and function of pore-forming toxins using leishmania major

세포가 PFT로 인한 막 손상에 저항하기 때문에 기공 형성 독소(PFT)의 기능과 메커니즘을 이해하는 것은 어렵습니다. 생물 물리학 적 접근법은 기공 형성을 이해하는 데 도움이되지만, 종종 막 지질과 단백질의 완전한 보완이 부족한 환원 주의적 접근법에 의존합니다. 배양 된 인간 세포는 대체 시스템을 제공하지만 복구 메커니즘의 복잡성과 중복으로 인해 특정 메커니즘을 식별하기가 어렵습니다. 대조적으로, 피부 리슈만편모충증을 담당하는 인간 원생동물 병원체인 리슈만편모충은 복잡성과 생리학적 관련성 사이의 최적의 균형을 제공합니다. L. major 는 유전적으로 다루기 쉽고 시험관 내에서 고밀도로 배양될 수 있으며 섭동이 감염에 미치는 영향은 확립된 쥐 모델에서 측정할 수 있습니다. 또한 L. major 는 포유류와 구별되는 지질을 합성하여 막 역학을 변경할 수 있습니다. 막 역학의 이러한 변화는 가장 잘 특성화된 독소 계열인 콜레스테롤 의존성 세포용해제(CDC)의 PFT로 프로젝션할 수 있습니다. CDC는 리슈만편모충 막의 에르고스테롤에 결합하여 L. major 프로마스티고테를 죽일 수 있으며, 이는 L. major 가 PFT 기능의 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 적합한 모델 시스템임을 나타냅니다 . 이 연구는 기생충 배양, 지질 감수성 평가를위한 유전 도구, 막 결합 분석 및 세포 사멸 분석을 포함하여 L. 주요 프로마스티고트에서 PFT 기능을 테스트하는 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 진화적으로 다양한 유기체와 지질 조직의 공통점에 걸쳐 PFT 기능을 이해하기 위한 강력한 모델 시스템으로 L. major 를 신속하게 사용할 수 있도록 합니다.

M199에 비해 Tyrode의 버퍼에서 SLO에 대한 프로마스티고트 민감도 증가 L. 주요 프로마스티고테의 SLO 민감도를 상이한 분석 완충액 간에 비교하였다. 야생형, spt2- 및 spt2-/+SPT2 프로마스티고테는 유세포분석기에서 분석하기 전에 30분 동안 2mMCaCl2가 보충된 무혈청 M199 또는 Tyrode의 완충액에서 SLO로 도전되었습니다. 분석에 적합한 기생충은 전...

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Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

여기에 제시된 것은 리슈만편모충 주요 프로마스티고테를 사용하여 기공 형성 독소에 의해 유도된 결합, 세포독성 및 신호전달을 결정하는 프로토콜입니다. 스트렙톨리신 O를 사용한 개념 증명이 제공됩니다. 다른 독소는 또한 독소 내성의 새로운 메커니즘을 정의하기 위해 L. major에서 사용할 수 있는 유전적 돌연변이를 활용하는 데 사용될 수 있습니다.

리슈만편모충 전공을 이용한 기공 형성 독소의 분자 메커니즘과 기능 해독

Understanding the function and mechanism of pore-forming toxins (PFTs) is challenging because cells resist the membrane damage caused by PFTs. While ...

기공 형성 독소에 대한 내성 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 우리의 프로토콜은 유전적으로 다루기 쉽고 생리학적으로 관련된 시스템인 Leishmania major를 사용하여 독소를 기공에 형성하는 기능과 메커니즘을 가능하게 합니다. 세포독성 분석의 주요 장점은 실시간으로 독소에 도전할 때 중간 처리량 분석에서 단일 세포 수준에서 여러 표현형의 세포 생존율을 비교하는 것입니다.암포테리신 B와 같은 막 교란 작용제는 리슈만편모충의 최전선 치료법입니다. 이 분석은 암포테리신 B 및/또는 새로운 막 손상 제제를 강화시키는 작용제의 식별을 가능하게 합니다. 이 분석은 수리 반응과 관련된 수리 반응 및 신호 경로와 같은 영역에 대한 통찰력을 제공합니다.이 분석은 Trypanosoma 및 Naegleria fowleri와 같은 원생 동물에 적용될 수 있습니다. 사람들은 독소 연속 희석 시리즈를 이해하기 어렵다고 생각합니다. 그래서 제가 드릴 수있는 최선의 조언은 실험을 설정하기 전에 직렬 희석 시리즈의 개략도를 그리는 것입니다.시작하려면 0.5 밀리리터의 가공 된 프로 마스티고트를 별도의 튜브에 염색되지 않은 대조군으로 예약하십시오. 밀리리터당 2밀리그램의 프로피듐 요오드화물 또는 PI를 나머지 프로마스티고테에 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도로 추가합니다. 3 초 동안 소용돌이.V- 바닥, 96 웰 플레이트 또는 습지 튜브의 각 웰에 가공 된 프로 마스티 고트를 추가하고 플레이트 또는 튜브 랙을 얼음 위에 약 45도 각도로 놓습니다. 프로피듐 요오드화물이 포함된 100마이크로리터의 분석 완충액을 각 무독소 대조군에 추가합니다. 색상이 더 어둡게 표시되는 총 부피가 200마이크로리터인 튜브를 시각적으로 식별하여 컨트롤이 올바르게 추가되었는지 확인합니다.독소의 양을 가장 높은 희석액에 첨가하십시오. 그런 다음 독소를 연속적으로 희석하십시오. 혼합을 보장하기 위해 적어도 8 번 위아래로 피펫.가장 낮은 독소 농도에서 시작하여 100 마이크로 리터의 독소를 올바른 행에 빠르게 추가하고 모든 독소가 세포에 추가 될 때까지 계속하십시오. 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 후, 플레이트를 포장하고 유세포분석기로 운반한다.데이터 수집의 경우, 제조업체의 지침과 시설 정책에 따라 유세포분석기 및 수집 소프트웨어를 설정하는 것부터 시작하십시오. 염색되지 않은 L.major 프로마스티고트 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산란에 대한 게이트와 선택한 염료를 기반으로 초기 형광 매개변수를 설정합니다. 단일 염색 대조군을 사용하여 생존 염료 및 형광 표지 독소에 대한 게이트를 설정합니다.마이크로클로그에 대한 순방향 산란 대 시간을 모니터링하고 세포분석기의 각 샘플에 대해 10, 000개 이상의 게이트 이벤트를 수집합니다. 데이터 분석을 위해, 전방 및 측면 산란에 게이팅하여 총 단일 세포 L.major 프로마스티고테를 게이트하고 필요에 따라 시간을 보냅니다. 유세포분석기에 권장되는 높이 또는 면적을 사용하십시오.죽은 세포를 PI 높음으로 식별하고 게이트합니다. 분석을 위해 Excel에서 용량-반응 곡선을 구성합니다. 두 기술 반복실험 사이의 각 조건에 대한 평균 PI 높음 백분율을 결정합니다.독소 농도 및 평균 백분율 특이적 용해와 실험 세부 정보 및/또는 원시 백분율 PI 높은 계산을 포함합니다. 4개 이상의 열에 모델링됨, 잔차, 매개변수 및 매개변수 값으로 레이블을 지정합니다. 첫 번째 열이 실험 매개 변수, 독소 농도 및 백분율 특이적 용해와 일치하는지 확인합니다.매개 변수 값 열에 값을 입력하여 매개 변수 L, k 및 c를 초기화합니다. 모델링됨 열에서 로지스틱 모델을 생성합니다. 잔차 열에서 모델링된 수와 실제 특정 용해 사이의 차이의 제곱을 계산합니다.파라미터 값 열의 SUM 옆에서 잔차 열의 모든 값을 합산합니다. 매개 변수 값 열에서 LC50 옆에 방정식을 초기화하여 결정된 값에서 LC50을 계산합니다. 데이터 탭에서 해 찾기를 엽니다.계산된 잔차의 합을 포함하는 셀이 되도록 설정된 목표를 선택합니다. 최소로 설정합니다. L, k 및 c의 매개 변수 값에 대한 변수 셀을 변경합니다.음수 k 값의 경우 k에서 음수를 빼내어 k를 양수로 변경하여 방정식을 수정합니다. GRG 비선형 해결 방법을 사용하고 해결을 클릭합니다. 곡선을 확인하고 LC50이 자동으로 계산되는지 확인합니다.백분율 특이적 용해와 독소 농도에 대한 모델링을 그래픽으로 플로팅하여 적합성을 확인합니다. 스핑고지질이 결핍된 SPT2 녹아웃 프로마스티고테는 무혈청 M199와 Tyrode의 완충액 모두에서 SLO에 민감했습니다. 야생형 및 SPT2 추가 프로마스티고테는 무혈청 M199에서 SLO에 내성이 있었지만 Tyrode의 완충액에서는 20% 미만의 특이적 용해를 보였습니다.SPT2 녹아웃 프로마스티고테는 M199보다 Tyrode의 완충액에서 SLO에 약 8배 더 민감했습니다. 이러한 데이터는 독소 민감도가 사용된 완충액에 따라 달라질 수 있음을 보여줍니다. L.major 프로마스티고테스에서 포스포-MEK에 대해 120킬로달톤 밴드가 관찰되었습니다.전체 MEK의 경우 약 120킬로달톤 및 55킬로달톤의 대역이 관찰되었으며 이는 각각 MRK1 및 LmxMKK의 크기와 일치합니다. Phospho-ERK는 유사한 밴드를 검출한 반면, ERK 항체 염색은 이 분석에서 견고하지 않았습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 독소의 적절한 취급을 보장하는 것입니다.리슈만편모충은 원형질막 복구를 연구하기 위한 유전적으로 다루기 쉬운 모델로 활용될 수 있으며, 모래파리 중추에서 리슈만편모충 박테리아가 상호 작용하는 동안 막 복구 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deciphering the Molecular Mechanism and Function of Pore-Forming Toxins Using Leishmania major

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

전체 혈액 Phenotyping 분석을 사용하여 Multicenter 임상 시험을위한 주요 말초 혈 백혈구 인구의 열거

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...