Name: laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00
Duration: 10 min 41 s
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作者要感谢Foresee Biosystems在研究期间借出IntraCell系统。他们还要感谢Hae In Chang的技术援助。这项工作得到了欧盟地平线2020的研究和创新计划根据第964518号资助协议（ToxFree）、欧盟地平线欧洲欧洲创新委员会计划、SiMulTox项目（赠款协议第101057769号）以及巴登-符腾堡州经济事务、劳工和旅游部的资助。

1. 诱导多能干细胞来源心肌细胞制备
注意：iCell心肌细胞2 （称为诱导多能干细胞[iPSCs]来源的心肌细胞）是根据供应商提供的方案制备的。该协议将在下一节中简要总结。
<ol><li>使用前在4°C下解冻电镀和维持培养基24小时。</li>
	<li>通过将无菌纤连蛋白溶解在浓度为 1 mg/mL 的无菌水中来制备纤连蛋白包衣。以等分试样冷冻储存该原液（例如，每等分试样 25 μL）。将等分储备溶液在无菌Dulbecco的平衡盐溶液（dPBS）中以1：20稀释。</li>
	<li>在层流罩下涂覆先前高压灭菌的MEA的电极场，在无菌条件下使用纤连蛋白使用10μL移液管逐滴涂覆。为此，将 5 μL 纤连蛋白包衣溶液滴到电极区域上，并观察电极区域顶部形成液滴。确保不要触摸敏感的电极。 注意：为了保持无菌条件，将MEA芯片转移到无菌培养皿中，然后将其从层流罩中取出。</li>
	<li>优选将包被的MEA在37°C下在培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>将含有心肌细胞的冷冻管在约37°C的水浴中解冻2分钟，直到只剩下一点冰晶。将细胞溶液轻轻转移到 50 mL 管中。</li>
	<li>向空冷冻管中加入 1 mL 电镀介质。在 90 秒的时间内将溶液滴入 50 mL 管中以减少渗透冲击。将额外的 8 mL 电镀介质轻轻添加到试管中。</li>
	<li>使用 10 mL 移液器仔细混合细胞悬液。使用自动荧光细胞术计算活细胞总数。该数字应接近制造商提供的数据表中的数字。</li>
	<li>在室温下以200× g 旋转细胞溶液3分钟。使用连接到泵送系统的玻璃移液管抽吸除去上清液。在 6，000 到 15，000 个活细胞/μL 之间调整细胞数。 注意：电池数量通常在上面给出的范围内，但可能因相应的供应商而异。</li>
	<li>在细胞接种前直接使用10μL移液管从MEA电极区域除去步骤1.3中施加的涂层溶液。取出后立即接种细胞，以避免涂层干燥。为此，以与包衣相同的方式将 6 孔 MEA 和 1 孔 MEA 的细胞滴落在 4 μL 下接种到电极场上。</li>
	<li>让细胞在37°C和5%CO2 的培养箱中粘附1小时，然后在层流罩下用加热至约37°C的无菌电镀培养基在200μL下加热至约6孔MEA和1mL的单孔MEA。</li>
	<li>在层流罩下电镀48小时后进行完整的培养基更换。为此，使用连接到泵送系统的玻璃移液器抽吸去除电镀介质。然后，向孔中加入200μL加热至37°C的无菌维持培养基。</li>
	<li>每隔一天进行一次完整的培养基更换。</li>
	<li>解冻后5-8天开始测量细胞。在开始实验前2小时进行完整的培养基更换。</li>
</ol>2. 多边环境协定录音
注意：用于将 FP 信号转换为 liAP 的设备由正置显微镜和 1064 nm 激光器组成。
<ol><li>将 MEA 系统放在设备顶部，MEA 芯片支架位于物镜孔的中心。将MEA设置的位置定位为使物镜直接位于MEA系统的孔下方，以使激光聚焦在电极上。</li>
	<li>在记录前15分钟将带有培养细胞的MEA芯片从培养箱转移到MEA设置中，使细胞从机械干扰中恢复。</li>
	<li>使用异丙醇和棉签仔细清洁接触垫和针脚，以降低噪音水平。将 MEA 小心地放入 MEA 设置中。将带有徽标的 MEA 芯片放置在左上角的底部（6 孔 MEA）或参比电极放在左侧（单孔 MEA）。</li>
	<li>将 MEA 系统集成加热设置为 38 °C。 在MEA芯片顶部放置一个小腔室，以不断向细胞灌注加湿的碳原（5%CO2 和95%O2），以重现培养箱条件并防止蒸发。</li>
	<li>合上设备的盖子。集成的安全开关仅在MEA芯片上的盖子关闭时允许激活激光器。使用 MEA 配置程序将 MEA 系统滤波器设置为 0.1 Hz 或更低的高通和 3，500 Hz 低通。</li>
	<li>使用MC_Rack软件（录音软件）或任何其他软件进行录音。根据需要调整输入范围，确保信号不会使放大器和采样率饱和（例如，20 kHz）。使用软件的长期显示功能检查录音。</li>
</ol>3. 激光诱导细胞穿孔
<ol><li>将 MEA 芯片插入 MEA 设置并设置软件后，使用 FB Alps 软件（初始化软件）初始化激光力学。</li>
	<li>首先，单击 “初始化 ”按钮。在初始化结束时，对于6孔MEA，虚拟激光点将分别位于D孔中，对于单孔MEA，虚拟激光点将分别位于左下角。</li>
	<li>使用 Ctrl + 鼠标单击将虚拟激光点移动到电极 D5 的中间并调整焦点。通过 Ctrl + 用鼠标滚轮滚动来调整焦点。</li>
	<li>按下按钮设置 P1。虚拟激光点将自动移动到孔F中，用电极F5重复该过程并选择 设置P2。</li>
	<li>完成此过程后，激光点将移动到孔B.用电极B5重复相同的过程，然后在软件中按 Set P3 。系统现已对齐。</li>
	<li>根据细胞的需要调整激光功率和处理时间。在这里，使用了40%的功率和25%的处理时间。</li>
	<li>要启用激光，请单击“激光关闭”按钮，该按钮将显示为激光打开。切换到记录软件，选择一个文件名，然后单击 红色记录 按钮，然后单击窗口顶部的播放按钮以记录测量结果。</li>
	<li>在用激光打开细胞之前记录60秒的基线。切换回初始化软件。</li>
	<li>使用 Ctrl + 鼠标单击在右侧的虚拟地图上停用要被激光排除的电极。通过在软件窗口右侧的阵列表示上激活感兴趣的电极来选择它们。</li>
	<li>要启动激光，请使用Alt +鼠标单击并选择该孔的中心电极。这启动激光自动打开该孔的每个电极上的细胞。对每个孔重复此操作。然后，激光将自动打开所选孔的所有先前激活的电极。</li>
</ol>4. 药物处理与应用
<ol><li>在测量当天新鲜准备用于药物测试的所有物质。确保培养基中的最终应用浓度高出 10 倍，以便在孔中进行 1：10 的稀释。</li>
	<li>首先将硝苯地平，E4031和多非利特溶解在mM浓度的DMSO中，然后在所需浓度的培养基中进一步溶解至10倍。切勿超过孔中最终DMSO浓度的0.1%。</li>
	<li>记录60秒的基线活动。按照协议步骤3中的描述启动激光诱导穿孔，导致FP转变为liAP形状。</li>
	<li>以每孔单浓度应用所有药物。对于 6 孔 MEA，每孔分别去除 20 μL 培养基，对于单孔 MEA，每孔分别去除 100 μL 培养基。根据MEA类型，将要测量的药物的储备溶液加入20μL或100μL到孔中，并小心地上下移液2-3次。对每种药物和浓度进行至少三次重复，以实现统计相关性。</li>
	<li>让化合物洗涤300秒。在此期间，liAP 形状可能会转换回 FP 形状。同样，诱导激光诱导穿孔并记录可能的化合物诱导对liAP的影响60秒。</li>
</ol>5. 数据导出
<ol><li>通过在录音软件中重放录音来选择相关电极。使用 MC_DataTool 将MC_Rack文件转换为 ASCII .txt文件。</li>
	<li>单击“ 文件”>“打开 MCD”>选择一个MC_Rack文件。单击 txt 按钮（蓝色文本）。</li>
	<li>选择一个电极。所选电极将显示在右侧的列表中。</li>
	<li>单击 “浏览 ”以选择文件夹并更改新.txt文件的名称。点击 保存。</li>
	<li>取消选择导出的电极，然后选择要导出的下一个电极。对所有感兴趣的电极重复该过程。</li>
</ol>6. 数据处理与统计分析
<ol><li>将转换后的二进制跟踪导入 R19。使用包含以下软件包的定制脚本可视化/分析数据：dplyr、tidyr 和 ggplot220、21、22。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+arrhythmias.">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li><li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hERG+(KCNH2+or+Kv11.1)+K++channels:+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk.">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li><li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. 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作者没有什么可透露的。

这种创新方法展示了一种在应用心脏活性药理工具化合物期间体 外 研究心脏动作电位的药理调节的新方法。
经典的MEA记录允许FP记录，这是心脏AP14的衍生物。这种间接记录涉及去极化和复极化的时间过程，从而消除了AP的基本特征。此外，尽管AP的跨细胞电压变化通常达到约100 mV的值，但整体FP幅度仍然相对较低，峰值幅度在几个100μV和低个位数mV值之间。由于记录原理，复极相位小;在许多情况下，它只是可检测的，并且通常形状不明确，因此很难定义FP的末端。细胞膜的打开使我们能够获得细胞内电压，从而揭示心脏AP的时间过程。与FP记录相比，这种记录方法具有多种优点。首先，信号幅度更突出，提供优越的信噪比。其次，波形可以更好地检测复极化。第三，复极相的形状有助于深入了解由信号松弛的陡峭度提供的测试化合物的作用模式。最后，该方法提高了检测关键药物不良反应的灵敏度， 图6 所示的记录示例证明，该示例显示了liAP中EAD的发生，但在FP中没有。
到目前为止，有两种方法可以访问细胞内AP。第一个是通过电穿孔26，27实现的。在这里，通过记录电极 施加 的短而强的电压脉冲可以打开细胞膜28。第二种可能性是通过激光脉冲 打开 膜，利用称为表面等离子体共振的物理现象，如图所示。与电穿孔相比，其优势之一是增加了连续开口的可能性。由于高度聚焦的激光光斑（1-3μm），这种效应非常局部地局限于感兴趣的电极。有趣的是，liAP的启动并没有改变培养合胞体的信号传播。这表明，尽管细胞完整性受损，但心肌细胞似乎没有通过膜上的孔 去 极化。
此方法存在局限性。与电穿孔一样，在大多数情况下，膜开口不会持续整个实验过程。在实验之前，需要独立定义稳定打开特定感兴趣细胞类型所需的激光脉冲的最小功率和持续时间设置。我们发现（未显示）不同细胞类型之间的参数差异很大（在我们的例子中，几种hiPS衍生的和原代心肌细胞）。这避免了化合物测试实验期间对细胞的不必要压力，并产生更可靠和可重复的数据。调整 z 轴以明确聚焦电池和电极至关重要。未聚焦的相机图像会产生位于次优水平的激光光斑，可能导致无法打开细胞膜。即使使用最佳调整参数，liAP效应也是瞬态的，并且幅度会随着时间的推移而减小。此外，进入细胞内空间的途径在liAP诱导之间变化，包括在同一电极的连续开口内和电极之间。这导致liAP振幅的高度可变性。原因尚未完全清楚。可能的解释包括机械问题，例如激光焦点的漂移或膜开口的不同亚细胞定位。这使得此时测试化合物的振幅效应分析变得复杂。此外，MEA系统记录电活动需要高通滤波，以补偿不可避免的基线漂移。尽管在此使用的系统中，此滤波设置为0.1 Hz（该系统可用的最低滤波器设置），但平台期的滤波效应仍然可见，导致心脏AP平台期期间电压偏转缓慢。这对于长的基础AP尤其成问题，例如此处使用的iPSC衍生的iCell心肌细胞2 ，它们在控制条件下已经产生AP>700 ms。使用具有较低滤波的系统可以更好地保存AP的形状，并允许更好地访问复极化阶段的时间过程。

心跳的电贡献是由许多心脏通道和转运蛋白的复杂且精确定时的相互作用以及电信号通过心肌的精确调谐传播的结果1.这些密切协调机制的改变（例如，使用药物）可对心脏功能造成严重后果（即危及生命的心律失常）2，3。心律失常被定义为改变心脏正常节律的不规则心跳，这可能会危及生命。它们可能是由心脏兴奋波的启动受损或心脏兴奋的异常传播引起的4，这反过来又导致心脏泵血机制的功能障碍。
许多强效候选药物在早期药物开发阶段必须被排除在进一步研究之外，因为它们具有（前）心律失常潜力2，3。它们调节负责正常心脏动作电位形成和终止以及随后信号传播的关键心脏通道（例如，人以太-a-go-go相关基因通道[hERG]）5。
制药公司通常使用膜片钳测量或微电极阵列（MEA）来研究候选药物诱导的潜在心脏毒性脱靶效应。膜片钳记录允许破译物质对心脏离子通道的影响，并以高时空分辨率分析跨细胞心脏动作电位6，7。然而，该技术的缺点包括手动膜片钳的低通量以及由于该方法依赖于悬浮细胞而导致自动化的适用性有限。此外，由于该方法的侵入性，无法研究慢性影响。最后，通常只同时研究单个细胞而不是整个心脏合胞体，因此无法解决有关信号传播的信息。
电压敏感染料对于无创研究心脏动作电位和药物引起的心律失常很有价值8。它们允许研究单细胞和合胞体活性。该方法的缺点是染料本身或照明期间反应产物的细胞毒性作用。它们用于急性实验，几乎不适用于长期研究9，10，11。电压敏感蛋白作为替代品在过去几年中在可用性和灵敏度方面取得了重大进展，但需要对感兴趣的细胞进行基因修饰，并且与电生理技术相比缺乏高时间分辨率12。
来自最近的CiPA倡议13 的信息指出，MEAs被广泛用于心脏安全筛查，作为一种替代电生理方法，因为它们代表了研究心脏功能和安全性药理学的强大而成熟的工具。心肌细胞直接培养为芯片顶部的合胞体，并通过底物集成的微电极 无 创地记录细胞外场电位（FP）。这种记录原理允许在几天内进行增加通量的筛选，这使得它们适用于慢性效应的药物研究。产生的FP波形是细胞内AP14的导数。诸如节拍率、FP 初始部分的振幅和 FP 持续时间等参数很容易访问15。由于该技术的AC滤波效应，其他基本标准，例如FP（致心律失常16，17的重要标志物）的延长和三角测量之间的区别是无法获得的。此外，检测其他小的致心律失常事件，如早期和延迟后去极化（分别为EAD和DAD），由于其振幅小，往往很容易被忽视。
在这里，我们描述了一种通过打开心肌细胞膜来获得细胞内膜电位的方法。IntraCell装置（以下简称细胞内记录装置）允许使用高度聚焦的纳秒激光束通过特定的物理现象（表面等离子体共振） 重复 开膜培养在MEA电极顶部的心肌细胞18。结果，记录从常规FP过渡到细胞内样AP（激光诱导AP，liAP）。该协议显示了这如何允许访问波形的动力学方面，而这些方面无法通过分析FP轻松捕获。该方法代表了传统细胞内膜片钳和MEA记录之间的桥梁。因此，该技术是当前心脏安全评估方法的有力扩展。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>7600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>20-139 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>D-100</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>12037539</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>E-500</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB Alps version 0.5.005</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>11051407001</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell cardiomyocytes</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CN09.1</td>
			<td>For cleaning of MEA contact pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>#M1003</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Data Tool</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Rack</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>MEA recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 - 2x60 - system</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890485</td>
			<td>For MEA-recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>N7634 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>M1001</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergazyme</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>1304-1</td>
			<td>cleaning of MEAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology

危及生命的药物性心律失常之前常伴有心脏动作电位 （AP） 延长，通常伴有小的致心律失常膜电位波动。AP 复极部分的形状和时间过程对于是否存在心律失常至关重要。
微电极阵列（MEA）允许通过细胞外场电位（FP） 轻松 获得心脏毒性化合物效应。尽管FP波形在研究和心脏安全药理学中是一个强大而成熟的工具，但由于细胞外记录原理和由此产生的固有交流电（AC）滤波，FP波形不允许推断原始AP形状。
这里描述的一种新型装置可以使用高度聚焦的纳秒激光束在多个培养时间点重复打开培养在MEA电极顶部的心肌细胞膜。激光穿孔导致将电生理信号从FP转换为细胞内样AP（激光诱导AP，liAP），并能够记录跨细胞电压偏转。与常规MEA记录相比，这种细胞内通路可以更好地描述AP形状，并对致心律失常电位进行更好，更灵敏的分类。该系统是对现有电生理方法的革命性扩展，允许准确评估基于MEA的记录的所有优点（简单，急性和慢性实验，信号传播分析等）。

用于记录培养的心肌细胞电活动的记录系统由标准MEA系统组成，该系统配备了加热器和连接到计算机的碳原室。该系统设置在细胞内记录装置的顶部，而细胞内记录装置又安装在小型防振装置的顶部（图1A-B）。
iPSC来源的心肌细胞2在解冻后2-3天内开始自发跳动（体外天数，DIV），并在显微镜下可见。从DIV 4开始，跳动频率变得规则，并且可以在MEA芯片各自孔内的大多数电极上检测到细胞外场电位（FP），其去极化组分的峰峰值幅度在1至5mV之间。在95%以上的待调查井中可以检测到电活动。从DIV 7开始，细胞脱离的可能性增加，使得进一步使用这些孔是不可能的。
控制激光诱导膜开口的软件允许调整激光的功率和处理时间，该激光仅在所研究的电极上介导细胞膜的开口（图1C），而相应孔中的其他电极不受影响。虽然过于保守的设置不会改变FP的波形，但过高的设置会导致心肌细胞的推定损伤，表现为剧烈但短暂的跳动或信号丢失。当调整到电池耐受良好的40%功率和25%处理时间的设置时，激光脉冲的触发导致记录的波形发生多次变化（参见 图1D 的示例记录）。在这些条件下，宏观上没有观察到电极材料的改变。从随机选择的记录子集分析，记录的信号幅度大幅增加4.1倍±0.41（n = 20，范围1.34-8.83），导致幅度在7到22 mV之间。此外，波形从标准 FP 形状转变为在开始时具有快速、双相和瞬态电压偏转，然后在基线处返回平台相位和指示 FP 结束的小偏转，转变为更接近细胞内记录的 AP 的形状，具有快速上升、扩展的去极化平台相位和下冲低于基线的重极化相位（图 1E).我们将这些电压偏转定义为激光感应AP（liAP）。在大多数情况下，转变是短暂的，并且在5分钟内至少部分倒置。liAP诱导后，心脏合胞体内的信号传播保持不变（图2），表明剩余的合胞体不受激光脉冲潜在损伤的影响。
与细胞内记录的AP的相似性允许提取FP无法访问的liAP参数（有关示例参数，请参见图 3A），最突出的是在特定时间点（例如，在20%，50%和90%）测量liAP的持续时间（图3B），类似于通常用于描述AP的APD20 / 50 / 90。
接下来，我们测试了激光打开的心肌细胞对常用的心脏活性药理工具化合物的反应。示例性协议设计如图 3C所示。由于liAP的转化在整个实验过程中并不总是持续存在，因此化合物应用以每孔单浓度而不是累积方式进行，以减少总记录时间。然而，在施用测试化合物之前，有必要重新打开电池或打开另一个电极区域。
添加特定的L型Ca2+通道阻滞剂硝苯地平23，24以浓度依赖性方式降低了liAP的平台期，从而缩短了整个liAP（图4A，B）。这种缩短与从未操纵电极的心肌细胞FP获得的分析相当（图4C），表明与传统的FP记录相比，这种记录方法没有不良影响。
E4031抑制相关Kv1.11（hERG）钾通道25的复极化，并在浓度增加时导致心肌细胞的心律失常行为。与从FP记录中获得的分析类似，E4031以浓度依赖性方式增加了liAP持续时间（图5）。此外，在0.01μM或更高的浓度下，liAP末端的正电压偏转是可见的。这些偏转随着浓度的提高而变得更加突出，表明瞬态的新去极化，这与FP不同，在FP中，这些偏转几乎是不可见的（参见图5B-C，上部（FP）与下部（liAP）迹线）。这种行为称为早期后去极化 （EAD）。在0.1μM的最高浓度下，这些EAD随着时间的推移升级为异位搏动，这是过早的动作电位（图5C）。EAD 和异位搏动都是致心律失常活动的关键指标。在图5D所示的示例结束时，电活动导致心律失常跳动。此外，FP和liAP记录之间显示的浓度 - 响应 - 关系是匹配的（图5E）。然而，在较高浓度的测试化合物下，由于FP的弱复极分量，FP数据存在更大的差异。iPSC 来源的心肌细胞2 的特征似乎是在控制条件下也倾向于产生非生理性长的 AP（AP 持续时间> 700 ms）。MEA 系统应用了固有的 0.1 Hz AC 滤波，这反过来又导致 liAP 的部分滤波形状，尽管没有遮挡有关底层 AP 开始和终止的定性信息。
事实证明，与FP记录相比，可以在较低的浓度下检测到致心律失常电压偏转的初始发生。 图6 所示是施用浓度为3μM的多非利特期间电活动的记录。记录是在同一口井中获得的。尽管FP和liAP都显示出大约2 s的持续时间，但FP波形并不显眼，呈现出规则的重新极化偏转。同时，在liAPs结束时，不同幅度的EAD变得可见。相关安全药理学敏感性的增加进一步支持了以下发现：由表面等离子体共振诱导的liAP可以提高复极化相的鉴定，从而有助于更多地了解正在研究的测试化合物的作用方式。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> 图 1：细胞内记录设置和示例记录 。 （A） 设置概述。（B） 带有开放式 MEA 记录放大器的记录系统的俯视图。（C） 初始化软件，右侧有虚拟MEA地图。1：防振台，2：细胞内记录系统，3：激光保护盖，4：加湿碳原室，5：MEA加热系统，6：MEA接口板，7：1孔MEA芯片内部记录放大器。（D）记录一个电极在诱导liAPs之前和之后的示例。上图：录制约6分钟。虚线标记底部显示的展开区域。（E） 放大的 FP（顶部）和 liAP（底部）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> 图 2：liAP 感应后，信号传播模式保持守恒。 合胞体内激发波信号传播的假色编码。蓝色表示早期（从 -4 毫秒开始）;红色表示在参比电极E54获得的信号的延迟时间点（+3 ms），如颜色条所示。信号从电极阵列的右上角传播到左下角。（A）在liAP诱导之前，（B）在liAP诱导后1分钟。（C）liAP诱导后4分钟。闪光符号表示电极64处的激光感应点。请注意，总体传播方向没有差异。黑色矩形表示无效数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> 图 3：FP/liAP 参数定义和记录协议。 （A） 可以从经典 FP 中提取的参数。 （B） 可以从 liAP 获得的其他参数。（三）药品计量时间表。从左到右：控制记录60秒，诱导liAP，记录liAP60秒，药物应用，冲洗时间300秒，liAP再诱导，liAP记录60秒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> 图 4：硝苯地平以浓度依赖性方式缩短心脏 liAP。 （A）顶部：对照（蓝色）和0.3μM硝苯地平（红色）存在的FP迹线。迹线以 y 轴偏移显示，以实现更好的可视化。下图：来自同一 MEA 记录的 liAP 轨迹，导致 liAP 缩短并增加节拍率。（B）在对照期间单个liAPs的叠加（蓝色）和应用不同浓度的硝苯地平（红色）。a：0.01 μM，b：0.1 μM和 c：0.3 μM。 注意liAP持续时间随着浓度的增加而缩短。（C）从FP（黑色）和liAP（红色）记录中获得的信号宽度的浓度-响应关系。数据来自n = 3个实验并归一化为对照。误差线表示平均值的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> 图 5：E4031 诱导（促）心律失常行为。 （A）控制条件下的FP（顶部）和liAP（底部）。（乙-丙）在施用E4031（0.1μM）后的不同时间点记录FP和liAP。80 秒后，第一个 EAD 在 liAP 的末尾可见（B;用红色箭头标记）。EAD在测试化合物（C）存在下320秒后转化为异位搏动。（D）530秒后，心脏合胞体进入心动过速状态。从 liAP 记录中描述的跟踪。（E）FP（黑色）和liAP（红色）宽度的浓度-响应关系。来自n = 4个实验的数据，归一化为对照。误差线表示平均值的标准误差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> 图 6：在 liAP 中检测致心律失常事件比 FP 更敏感 。 （A） 在施用 3 μM 多非利特期间，在同一孔内进行 FP 记录和 （B） liAP 记录。虽然在某些 liAP 结束时，EAD 是可检测到的，但它们在 FP 记录中仍然无法发现。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

激光穿孔和微电极阵列（MEA）的组合允许对培养的原代和干细胞来源的心肌细胞进行类似动作电位的记录。波形形状提供了比标准记录更深入的测试化合物作用方式的洞察力。它将膜片钳和MEA读数连接在一起，以进一步优化未来的心脏安全研究。

激光诱导动作电位样测量微电极阵列上的心肌细胞，以提高安全药理学的预测性

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

该方法能够在传统MEA上记录细胞内相似的动作电位，从而可以更好地描述AP形状和更灵敏地分类促心律失常电位。与典型的场电位记录相比，细胞内的实际电位形状提供了对潜在离子通道的精确授权的更多见解。当通过干细胞技术应用于来自临床患者的心肌细胞时，该方法有助于因果诊断，C R P和心律失常等心脏病的个性化我们的技术人员Karin Gebhardt将演示心肌细胞培养。为了开始涂覆先前高压灭菌的MEA的电极场，在层流罩下使用10微升移液管滴加纤连蛋白。为了减少渗透休克，将电镀溶液滴入含有解冻心肌细胞的50毫升管中90秒。将八毫升电镀介质轻轻加入试管中，并小心地混合细胞悬液。使用10毫升移液管，除去上清液，确保不丢弃沉淀并将细胞数调整至最终浓度。在细胞就位之前，使用10微升移液管从MEA电极区域去除涂覆的涂层溶液。为了避免涂层立即干燥，将四微升的细胞滴加到电极场上，六个孔MEA和一个孔M E A.现在，让细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下粘附在孔中一小时。在层流罩下，加入200微升和1毫升加热至37摄氏度的无菌电镀介质，分别用于6孔MEA和单孔MEA。对于MEA记录，将MEA系统放在设备顶部，MEA芯片支架位于物镜孔的中心。然后通过定位MEA设置使激光聚焦在电极上，使物镜直接位于MEA系统的孔下方。为了使细胞从机械干扰中恢复，请在记录前15分钟将带有培养细胞的MEA芯片从培养箱转移到MEA设置中。接下来，使用异丙醇棉签仔细清洁接触垫和针脚以降低噪音水平。将 MEA 小心地放入 MEA 设置中，并将序列号可见的六孔 MEA 芯片放置在右侧，或将参比电极放在左侧的单孔 MEA 芯片中。现在，将MEA系统集成加热设置为38摄氏度。关闭设备的盖子，因为集成的安全开关只允许激活激光 如果盖子在 MEA 芯片上关闭。使用 MEA 配置程序将高通和低通 MEA 系统滤波器分别设置为 0.1 赫兹或更低和 3， 500 赫兹。使用 MC 机架软件或任何其他软件进行录制。根据实验调整输入范围。确保信号不会使放大器和采样率饱和。使用软件的长期显示功能检查录音。将MEA芯片插入MEA设置并设置软件后，使用FB ALP软件初始化激光力学。现在，单击初始化按钮。在初始化结束时，对于六孔MEA，虚拟激光点将分别位于D井中，对于单孔MEA，虚拟激光点将分别位于左下角。然后使用鼠标单击的控制键将虚拟激光点移动到D五电极的中间，并通过按住控制键并用鼠标滚轮滚动来调整焦点。或者，使用自动对焦功能。按下按钮设置P一，虚拟激光点将自动移动到孔F中。根据实验要求调整激光功率和处理时间。要启用激光，请单击激光关闭按钮，该按钮将显示为激光打开，切换到录制软件。选择一个文件名，然后单击红色记录按钮，然后单击窗口顶部的播放按钮以记录测量结果。在用激光打开细胞之前记录基线60秒。切换回初始化软件，并在软件窗口右侧的虚拟地图上停用要被激光排除的电极。要启动激光，请使用Alt鼠标单击，并选择此孔的中心电极。这启动激光自动打开该孔的每个电极上的细胞，对每个孔重复以打开该选定孔的所有先前激活的电极。首先将毫摩尔浓度的硝苯地平E-40 31和多非利特溶解在DMSO中，然后在完全培养基中溶解至所需浓度的10倍。切勿超过孔中最终DMSO浓度的0.1%。记录基线活动 60 秒。如前所述，启动激光诱导，导致FPS转换为liAP。以每孔单浓度应用所有药物。分别从六孔和单孔MEA中每孔去除20微升和100微升培养基。向孔中加入20微升或100微升待测的药物储备溶液。根据 MEA 类型，小心地上下移液两到三次。让化合物冲洗 300 秒。在此期间，liAP 形状可能会转变为 FP 形状。再次，诱导激光诱导穿孔并在liAP上记录可能的化合物诱导缺陷60秒。硝苯地平的加入以浓度依赖性方式降低了liAPs的平台期，从而缩短了整个liAPs。这种缩短与来自未操纵电极的心肌细胞的场电位相当。E-40 31抑制相关KV单点11钾通道的复极化，导致心肌细胞在浓度增加时的心律失常行为。此外，E-40 31以浓度依赖性方式增加了liAP持续时间。在liAP结束时，在0.1微摩尔处观察到小的正电压偏转，随着浓度的增加而变得更加突出，表明称为EAD的瞬态新去极化。在0.1微摩尔的最高浓度下，这些EAD随着时间的推移升级为异位搏动。哪些是过早的动作电位。EAD 和异位搏动是促心律失常活动的关键指标。最后，电活动导致心律失常跳动。浓度反应关系与FP和liAP记录相关。此外，在多非利特存在下，FP和liAP在同一孔内均显示出约两秒的持续时间，FP波形呈现规则的复极偏转。在liAP中，EAD是可检测到的。在每个旋律之前调整焦点很重要，因为失焦显微镜图像可能会影响细胞的开放。此外，在优化后不久就采取动作电位进行分析。与标准MEA相比，该技术在检测先前的心律失常效应方面更敏感，可以更精确地检测不良化合物效应。

Research

JoVE Journal

Medicine

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