Name: laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00
Duration: 10 min 41 s
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著者らは、研究中にイントラセルシステムを貸し出してくれたForesee Biosystemsに感謝したい。彼らはまた、技術支援のためにチャン・ヘインに感謝したいと思います。この作業は、助成金契約番号964518(ToxFree)に基づく欧州連合のホライズン2020の研究およびイノベーションプログラム、EUホライズンヨーロッパ欧州イノベーション評議会プログラム、プロジェクトSiMulTox(助成金契約番号101057769)、およびバーデンヴュルテンベルク州経済労働観光省から資金提供を受けています。

1. 人工多能性幹細胞由来心筋細胞製剤
注:iCell心筋細胞2 (人工多能性幹細胞[iPSC]由来心筋細胞と呼ばれる)は、サプライヤーが提供するプロトコルに従って調製されました。プロトコルについては、次のセクションで簡単に要約します。
<ol><li>使用前にメッキおよびメンテナンス媒体を4°Cで24時間解凍します。</li>
	<li>滅菌フィブロネクチンを滅菌水に1 mg/mLの濃度で溶解することにより、フィブロネクチンコーティングを調製します。このストックをアリコートで凍結保存します(例:アリコートあたり25 μL)。分注したストック溶液を滅菌ダルベッコ平衡塩溶液(dPBS)で1:20に希釈します。</li>
	<li>以前にオートクレーブ滅菌したMEAの電極フィールドを層流フードの下で、10 μLピペットを使用してフィブロネクチンで無菌条件下で液滴状にコーティングします。このために、5μLのフィブロネクチンコーティング溶液を電極フィールドに滴下し、電極領域の上に液滴が形成されるのを観察します。敏感な電極に触れないように注意してください。 注意: 無菌状態を維持するには、MEAチップを層流フードから取り外す前に、MEAチップを滅菌ペトリ皿に移します。</li>
	<li>コーティングされたMEAsをインキュベーター内で37°Cで1時間インキュベートすることが好ましい。</li>
	<li>心筋細胞を含むクライオバイアルを約37°Cの水浴中で2分間、氷の結晶が少し残るまで解凍します。細胞溶液を50 mLチューブに穏やかに移します。</li>
	<li>空のクライオバイアルに1mLのメッキ培地を加えます。溶液を90秒かけて50 mLチューブに滴下し、浸透圧ショックを軽減します。さらに8mLのメッキ媒体をチューブにそっと加えます。</li>
	<li>10 mLピペットを使用して細胞懸濁液を注意深く混合します。自動蛍光サイトメトリーを使用して生細胞の総数を計算します。番号は、製造元が提供するデータシートの番号に近い必要があります。</li>
	<li>細胞溶液を室温で200 x g で3分間スピンダウンします。ポンプシステムに取り付けられたガラスピペットを使用して吸引により上清を除去します。細胞数を6,000〜15,000の生細胞/ μLの間で調整します。 注意: セルの数は通常上記の範囲ですが、それぞれのサプライヤーによって異なる場合があります。</li>
	<li>ステップ1.3で塗布したコーティング溶液を、細胞播種直前に10 μLピペットを使用してMEA電極領域から除去します。コーティングの乾燥を避けるために、除去直後に細胞に播種します。このために、コーティングと同じ方法で、6ウェルMEAと1ウェルMEAの両方について4 μLでセルを電極フィールドに滴下します。</li>
	<li>細胞を37°C、5%CO2 のインキュベーター内で1時間接着させてから、約37°Cに加熱した滅菌めっき培地を層流フードの下で6ウェルMEAの場合は200 μL、単一ウェルMEAの場合は1 mLでウェルに充填します。</li>
	<li>層流フードの下でめっき後48時間で完全な媒体交換を実行します。このために、ポンプシステムに取り付けられたガラスピペットを使用して吸引によってめっき媒体を除去します。次に、37°Cに加熱した滅菌維持培地200 μLをウェルに加えます。</li>
	<li>一日おきに完全な培地交換を実行します。</li>
	<li>解凍後5〜8日で細胞の測定を開始します。実験を開始する2時間前に完全な培地交換を実行します。</li>
</ol>2. 中東・アフリカ録音
注:FP信号をliAPに変換するために使用されるデバイスは、正立顕微鏡と1064nmレーザーで構成されています。
<ol><li>MEAチップホルダーを対物レンズの穴の中央に配置して、MEAシステムをデバイスの上に置きます。対物レンズがMEAシステムの穴の真下になるようにMEAセットアップを配置して、レーザーが電極に焦点を合わせられるようにします。</li>
	<li>培養細胞を含むMEAチップをインキュベーターから記録の15分前にMEAセットアップに移し、細胞が機械的障害から回復できるようにします。</li>
	<li>ノイズレベルを下げるために、イソプロパノールと綿棒を使用してコンタクトパッドとピンを慎重に清掃します。MEA を MEA セットアップに慎重に配置します。左上の下部にロゴが付いたMEAチップ(6ウェルMEA)または参照電極を左側に配置します(シングルウェルMEA)。</li>
	<li>MEAシステム一体型加熱を38°Cに設定します。 MEAチップの上に小さなチャンバーを置き、加湿カルボゲン(5%CO2 および95%O2)でセルを常に灌流して、インキュベーターの状態を再現し、蒸発を防ぎます。</li>
	<li>デバイスの蓋を閉じます。統合された安全スイッチは、MEAチップ上で蓋が閉じられている場合にのみレーザーをアクティブにすることができます。MEA 構成プログラムを使用して MEA システム フィルタを 0.1 Hz 以下のハイパスと 3,500 Hz のローパスに設定します。</li>
	<li>MC_Rackソフトウェア(録音ソフトウェア)または代替ソフトウェアを使用して録音してください。必要に応じて入力範囲を調整し、信号が飽和しないようにします ampリファイアとサンプリングレート(20kHzなど)。ソフトウェアの長期表示機能を使用して、記録を確認します。</li>
</ol>3. レーザー誘起細胞ポレーション
<ol><li>MEAチップをMEAセットアップに挿入し、ソフトウェアをセットアップした後、FB Alpsソフトウェア(初期化ソフトウェア)を使用してレーザーメカニクスを初期化します。</li>
	<li>まず、[ 初期化 ]ボタンをクリックします。初期化の最後に、仮想レーザーポイントは、6ウェルMEAの場合はウェルDに、シングルウェルMEAの場合は左下にあります。</li>
	<li>Ctrl +マウスクリックで仮想レーザーポイントを電極D5の中央に移動し、フォーカスを調整します。Ctrl +マウスホイールでスクロールしてフォーカスを調整します。</li>
	<li>ボタンを押します P1を設定します.仮想レーザーポイントは自動的にウェルFに移動します。 電極F5でこのプロセスを繰り返し、 セットP2を選択します。</li>
	<li>この手順の後、レーザーポイントはウェルBに移動します。 電極B5で同じプロセスを繰り返し、ソフトウェアの セットP3 を押します。これで、システムが調整されました。</li>
	<li>細胞のニーズに応じてレーザー出力と処理時間を調整します。ここでは、40%の電力と25%の処理時間が使用されました。</li>
	<li>レーザーを有効にするには、[レーザーオフ]ボタンをクリックすると、 レーザー オンとして表示されます。録音ソフトウェアに切り替えてファイル名を選択し、 赤い録音 ボタンをクリックしてから、ウィンドウ 上部の再生ボタンをクリックして 測定値を記録します。</li>
	<li>レーザーでセルを開く前に60秒のベースラインを記録します。初期化ソフトウェアに切り替えます。</li>
	<li>右側の仮想マップ上のレーザーによって除外される電極をCtrl+マウスクリックで非アクティブ化します。目的の電極をソフトウェアウィンドウの右側にあるアレイ表示でアクティブにして選択します。</li>
	<li>レーザーを開始するには、Alt +マウスクリックを使用して、このウェルの中心電極を選択します。これにより、レーザーが開始され、このウェルの各電極のセルが自動的に開きます。ウェルごとに繰り返します。レーザーは、選択したウェルの以前にアクティブ化されたすべての電極を自動的に開きます。</li>
</ol>4.薬物の取り扱いと適用
<ol><li>薬物検査に使用するすべての物質は、測定当日に新鮮に準備してください。最終適用濃度が培地の10倍であることを確認して、ウェル内で1:10に希釈します。</li>
	<li>ニフェジピン、E4031、およびドフェチリドを最初にDMSOにmM濃度で溶解し、次にさらに培地に溶解して所望の濃度の10倍にします。ウェル内の最終DMSO濃度0.1%を超えないようにしてください。</li>
	<li>ベースラインアクティビティを60秒間記録します。プロトコルのステップ3で説明されているようにレーザー誘起ポレーションを開始し、FPをliAP形状に変換します。</li>
	<li>すべての薬をウェルあたりの単一濃度として適用します。6ウェルMEAの場合はウェルあたり20 μL、シングルウェルMEAの場合は100 μLの培地を除去します。MEAの種類に応じて、測定する薬物のストック溶液を20 μLまたは100 μLウェルに加え、慎重にピペットで上下に2〜3回行います。統計的関連性を達成するために、各薬物および濃度の少なくとも3回の複製を実行する。</li>
	<li>コンパウンドを300秒間洗い流します。この間、liAP形状がFP形状に戻る場合があります。繰り返しになりますが、レーザー誘発性ポレーションを誘発し、liAPに対する化合物誘発効果の可能性をさらに60秒間記録します。</li>
</ol>5. データのエクスポート
<ol><li>録音ソフトウェアで録音を再生して、関連する電極を選択します。MC_DataToolを使用して、MC_Rack ファイルを ASCII .txt ファイルに変換します。</li>
	<li>[ファイル]をクリックして>MCDを開き>MC_Rackファイルを選択します。txtボタン(青いテキスト)をクリックします。</li>
	<li>電極を選択します。選択した電極が右側のリストに表示されます。</li>
	<li>[ 参照 ]をクリックしてフォルダを選択し、新しい.txtファイルの名前を変更します。[ 保存]をクリックします。</li>
	<li>エクスポートした電極の選択を解除し、エクスポートする次の電極を選択します。目的のすべての電極に対して手順を繰り返します。</li>
</ol>6. データの取り扱いと統計分析
<ol><li>変換されたバイナリトレースをR19にインポートします。次のパッケージを含むカスタムメイドのスクリプトを使用して、データを視覚化/分析します:dplyr、tidyr、およびggplot220,21,22。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+arrhythmias.">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li><li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hERG+(KCNH2+or+Kv11.1)+K++channels:+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk.">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li><li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. 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著者は開示するものは何もありません。

この革新的な方法は、心活性薬理学的ツール化合物の適用中の心臓活動電位の薬理学的調節を in vitro で調査する新しい方法を示しています。
古典的なMEA記録は、心臓AP14の派生物であるFP記録を可能にする。この間接的な記録により、脱分極と再分極の時間経過が複雑になり、AP の本質的な特性が排除されます。さらに、APの経細胞間電圧変化は通常約100mVの値に達しますが、全体のFP振幅は比較的低く、ピーク振幅は数100μVから1桁のmV値の間にあります。記録原理により、再分極位相は小さい。多くの場合、それは単に検出可能であり、しばしば不明確な形状であるため、FPの終わりを定義することは困難です。細胞膜の開口部により、細胞内電圧へのアクセスが可能になり、それによって心臓APの時間経過が明らかになります。FP記録と比較して、この記録方法には複数の利点があります。まず、信号振幅がより顕著になり、優れた信号対雑音比を提供します。第二に、波形は再分極の検出をより良くします。第三に、再分極相の形状は、信号緩和の急峻さによって提供される試験化合物の作用機序への洞察に寄与する。そして最後に、この方法は、図6に示されているように、LIAPでは発生するがFPでは発生しないEADの発生について図 6 に示されているように、重大な薬物副作用を検出するための感度が向上しています。
これまでのところ、細胞内APにアクセスする方法は2つあります。第1のものは、エレクトロポレーション26,27によって達成される。ここで、記録電極を介して印加される短くて強い電圧パルスは、細胞膜28を開くことができる。第2の可能性は、表面プラズモン共鳴という物理現象を利用したレーザーパルスによる膜開口です。エレクトロポレーションと比較した利点の1つは、連続した開口部の可能性が高いことです。高度に集束されたレーザースポット(1〜3μm)のため、この効果は目的の電極に非常に局所的に制限されます。興味深いことに、liAPの開始は、培養されたシンシチウムのシグナル伝播を変えませんでした。これは、細胞の完全性が損なわれているが、心筋細胞が膜の穴を介して脱分極していないように見えることを示しています。
この方法には制限があります。エレクトロポレーションと同様に、膜の開口部は、ほとんどの場合、実験コース全体にわたって持続しません。目的の特定の細胞タイプの安定した開口部に必要なレーザーパルスの最小パワーと持続時間の設定は、実験の前に独立して定義する必要があります。我々は、パラメータが異なる細胞タイプ(我々の場合、いくつかのhiPS由来および初代心筋細胞)間で劇的に異なることを見出した(図示せず)。これにより、化合物試験実験中の細胞への不必要なストレスを回避し、より信頼性が高く再現性の高いデータが得られます。セルと電極に明確に焦点を合わせるためにz軸を調整することは非常に重要です。焦点の合っていないカメラ画像は、最適ではないレベルにあるレーザースポットを生成し、細胞膜を開くことができない可能性があります。パラメータを最適に調整しても、liAP効果は過渡的であり、振幅は時間とともに減少します。さらに、細胞の細胞内空間へのアクセスは、同じ電極の連続した開口部内および電極間の両方で、liAP誘導間で変化する。これにより、LiAP振幅の変動性が高くなります。その理由はまだ完全には理解されていません。考えられる説明には、レーザー焦点のドリフトや膜開口部の異なる細胞内局在などの機械的問題が含まれます。これにより、この時点では、試験化合物の振幅効果の分析が複雑になります。また、MEAシステムによる電気的活動の記録には、避けられないベースラインドリフトを補償するためのハイパスフィルタリングが必要です。ここで使用したシステムでは、このフィルタリングは0.1 Hz(このシステムで利用可能な最も低いフィルター設定)に設定されていましたが、プラトー期中のフィルタリング効果は依然として見られ、その結果、心臓APのプラトー期にはベースラインへの電圧偏向の傾向が遅くなりました。これは、ここで使用されているiPS細胞由来のiCell心筋細胞2 のように、制御条件下ですでに>700ミリ秒のAPを生成している、非常に長い基盤となるAPで特に問題になります。フィルタリングの低いシステムを使用すると、AP の形状をより適切に保存し、再分極フェーズの時間経過へのアクセスがさらに向上する可能性があります。

心拍の電気的寄与は、多くの心臓チャネルとトランスポーターの複雑で正確なタイミングの相互作用、および心筋を通る電気信号の正確に調整された伝播に起因します1。これらの密接に調整されたメカニズムの変更(薬物の使用など)は、心臓の機能に深刻な結果をもたらす可能性があります(すなわち、生命を脅かす不整脈)2,3。不整脈は、心臓の正常なリズムを変える不整脈として定義され、生命を脅かす結果をもたらす可能性があります。それらは、心臓興奮の波の開始障害または心臓興奮の異常な伝播4のいずれかによって引き起こされる可能性があり、その結果、心臓のポンプ機構の機能不全が生じます。
多くの非常に強力な薬剤候補は、その(プロ)不整脈の可能性のために、医薬品開発の初期段階でさらなる調査から除外されなければなりません2,3。それらは、正常な心臓活動電位の形成と終結、およびその後のシグナル伝播に関与する主要な心臓チャネル(例えば、ヒトエーテルゴーゴー関連遺伝子チャネル[hERG])を調節します5。
製薬会社は、パッチクランプ測定または微小電極アレイ(MEA)を日常的に使用して、薬剤候補によって誘発される潜在的な心毒性のオフターゲット効果を調査しています。パッチクランプ記録により、心臓イオンチャネルに対する物質の影響を解読し、高い時空間分解能で経細胞的心臓活動電位を分析することができます6,7。しかしながら、この技術の欠点には、手動パッチクランプによる低スループットおよびこの方法の懸濁細胞への依存性による自動化の適用性の制限が含まれる。さらに、この方法の侵襲性のために慢性的な影響を調査することはできません。最後に、通常、心臓合胞体全体ではなく、単一の細胞のみが同時に研究されるため、シグナル伝播に関する情報に対処することは不可能です。
電位感受性色素は、心臓活動電位および薬物誘発性不整脈を非侵襲的に調査するのに有用です8。それらは、単一細胞活性とシンシチウム活性の両方の調査を可能にします。この方法の欠点は、照明中の色素自体または反応生成物のいずれかの細胞毒性効果である。それらは急性実験に使用され、長期研究にはほとんど適用できません9,10,11。代替としての電位感受性タンパク質は、使いやすさと感度の点で過去数年間で大きな進歩を遂げましたが、目的の細胞の遺伝子改変が必要であり、電気生理学的手法と比較して高い時間分解能が不足しています12。
最新のCiPAイニシアチブ13からの情報によると、MEAは、心機能と安全性薬理学を調査するための強力で確立されたツールであるため、代替の電気生理学的アプローチとして心臓安全性スクリーニングで広く使用されています。心筋細胞はチップ上に直接シンシチウムとして培養され、細胞外電界電位(FP)は基板集積微小電極を介して非侵襲的に記録されます。この記録原理により、数日間にわたってスループットスクリーニングを実施できるため、慢性疾患に関する医薬品研究に適しています。得られたFP波形は、細胞内AP14の導関数である。ビートレート、FPの最初の部分の振幅、FP持続時間などのパラメータに簡単にアクセスできます15。FP(不整脈の重要なマーカー16,17)の延長と三角測量の区別などの他の重要な基準は、技術のACフィルタリング効果のためにアクセスできません。さらに、早期および遅延後脱分極(それぞれEADおよびDAD)などの他の小さな不整脈イベントの検出は、振幅が小さいため見落とされがちです。
ここでは、心筋細胞の膜を開口して細胞内膜電位にアクセスする方法について説明する。IntraCellデバイス(以下、細胞内記録デバイス)は、特定の物理現象(表面プラズモン共鳴) を介して 、高度に集束されたナノ秒レーザービームを使用して、MEA電極上で培養した心筋細胞の膜開口部を繰り返し行うことができます18。その結果、記録は通常のFPから細胞内様AP(レーザー誘導AP、liAP)に移行します。このプロトコルは、FPの解析では容易に捉えられない波形の運動的側面へのアクセスを可能にする方法を示しています。この方法は、従来の細胞内パッチクランプとMEA記録の間の架け橋を表しています。したがって、この技術は、現在の心臓安全性評価方法の強力な拡張です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>7600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>20-139 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>D-100</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>12037539</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>E-500</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB Alps version 0.5.005</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>11051407001</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell cardiomyocytes</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CN09.1</td>
			<td>For cleaning of MEA contact pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>#M1003</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Data Tool</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Rack</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>MEA recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 - 2x60 - system</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890485</td>
			<td>For MEA-recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>N7634 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>M1001</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergazyme</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>1304-1</td>
			<td>cleaning of MEAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology

生命を脅かす薬物誘発性心不整脈は、しばしば長期の心臓活動電位(AP)が先行し、一般に小さな不整脈膜電位の変動を伴う。APの再分極画分の形状および経時変化は、不整脈の有無にとって極めて重要であり得る。
微小電極アレイ(MEA)は、細胞外電界電位(FP) を介して 心毒性化合物の影響に容易にアクセスできるようにします。FP波形は、研究および心臓安全性薬理学において強力で確立されたツールですが、細胞外記録原理と結果として生じる固有の交流(AC)フィルタリングにより、元のAP形状を推測することはできません。
ここで説明する新しいデバイスは、高度に集束されたナノ秒レーザービームを使用して、複数の培養時点でMEA電極上で培養された心筋細胞の膜を繰り返し開くことができます。レーザーポレーションは、電気生理学的シグナルをFPから細胞内様AP(レーザー誘起AP、liAP)に変換し、経細胞電圧偏向の記録を可能にします。この細胞内アクセスにより、AP形状をよりよく記述し、通常のMEA記録よりも整脈電位をより良く、より感度の高い分類することができます。このシステムは、既存の電気生理学的方法の革新的な拡張であり、MEAベースの記録のすべての利点(簡単、急性、慢性実験、シグナル伝播分析など)を備えた心毒性効果の正確な評価を可能にします。

培養心筋細胞からの電気的活動を記録するために使用される記録システムは、ヒーターとコンピューターに取り付けられたカルボゲン用のチャンバーを備えた標準的なMEAシステムから構成されていました。このシステムは細胞内記録装置の上に置かれ、細胞内記録装置は小型の防振ユニットの上に取り付けられました(図1A-B)。
iPS細胞由来心筋細胞2は、融解後2〜3日以内(in vitro、DIV)に自発的に拍動を開始し、顕微鏡下で観察した。DIV 4以降、拍動周波数は規則的になり、MEAチップの各ウェル内のほとんどの電極で、脱分極成分のピークtoピーク振幅が1〜5 mVの細胞外電界電位(FP)を検出できました。電気的活動は、調査中の井戸の95%以上で検出できました。DIV 7以降、細胞剥離の可能性が高まり、これらのウェルのさらなる使用が不可能になりました。
レーザー誘起膜開口部を制御するソフトウェアにより、細胞膜の開口部を介するレーザーの出力とプロセス時間の両方を調査中の電極上でのみ調整できますが(図1C)、それぞれのウェル内の他の電極は影響を受けません。設定が保守的すぎてもFPの波形は変化しませんでしたが、設定が高すぎると心筋細胞の推定損傷が発生し、激しいが一時的な拍動または信号の喪失によって示されます。セルによって十分に許容される40%のパワーおよび25%のプロセス時間の設定に調整された場合、レーザパルスのトリガは、記録された波形に複数の変化をもたらした(例示的な記録については 図1D を参照されたい)。これらの条件下では、電極材料の変質は肉眼的に観察されなかった。記録された信号振幅は、ランダムに選択された記録のサブセットから分析され、4.1±0.41(n = 20、範囲1.34〜8.83)倍と大幅に増加し、7〜22mVの振幅をもたらしました。さらに、波形は、最初に急速、二相性、および過渡的な電圧偏向を伴う標準的なFP形状から、ベースラインでプラトー位相が戻り、FPの終わりを示す小さなたわみが、急速な上昇、拡張された脱分極プラトー相、およびベースラインを下回るアンダーシュートを伴う再分極相を伴う細胞内に記録されたAPに近い形状に変換されました(図1E).これらの電圧たわみをレーザー誘起AP(liAP)と定義しました。ほとんどの場合、遷移は一時的であり、少なくとも部分的に5分以内に反転しました。心臓合胞体内の信号伝播は、liAP誘導後も変化せず(図2)、残りの合胞体がレーザーパルスによる潜在的な損傷の影響を受けなかったことを示しています。
細胞内に記録されたAPとの類似性は、FPがアクセスできないliAPのパラメータを抽出することを可能にし(例示的なパラメータについては、例えば、図 3Aを参照されたい)、最も顕著なのは、特定の時点(例えば、20%、50%、および90%)におけるliAPの持続時間の測定であり(図3B)、APの説明に一般的に使用されるAPD20/50/90に類似している。
次に、一般的に使用される心臓活性薬理学的ツール化合物に対するレーザー開口心筋細胞の応答をテストしました。例示的なプロトコル設計を 図3Cに見出すことができる。liAPの形質転換は実験全体を通して常に持続するとは限らなかったため、化合物の塗布は、総記録時間を短縮するために累積的な方法ではなく、ウェルあたりの単一濃度として実行されました。それにもかかわらず、試験化合物を適用する前に、セルを再度開くか、別の電極領域を開く必要がありました。
特定のL型Ca2+チャネル遮断薬であるニフェジピン23,24を添加すると、濃度依存的にliAPのプラトー相が減少し、それによってliAP全体が短縮されました(図4A、B)。この短縮は、操作されていない電極からの心筋細胞のFPから得られた分析に匹敵し(図4C)、この記録方法は古典的なFP記録と比較して悪影響を及ぼさないことを示しています。
E4031は、関連するKv1.11(hERG)カリウムチャネル25の再分極を阻害し、増加した濃度で心筋細胞の不整脈挙動を引き起こします。FP記録から得られた分析と同様に、E4031は濃度依存的にliAP持続時間を増加させました(図5)。さらに、0.01μM以上の濃度では、liAPの端に小さな正の電圧たわみが見られました。これらのたわみは濃度が高いほど顕著になり、これらのたわみがほとんど見えないFPとは異なり、一時的な新しい脱分極を示しています(図5B-C、上部(FP)と下部(liAP)のトレースを参照)。この動作は、早期後分極(EAD)として知られています。0.1μMの最高濃度では、これらのEADは時間の経過とともに、早期の活動電位である異所性拍動にエスカレートしました(図5C)。EADと異所性拍動の両方が不整脈活動の重要な指標です。図5Dに示す例の終わりに、電気的活動は不整脈拍動をもたらした。また、FP記録とliAP記録の間に表示された濃度-応答-関係は一致していました(図5E)。ただし、高濃度の試験化合物でのFPの再分極成分が弱いことに起因するFPデータには、より大きなばらつきがあります。iPS細胞由来心筋細胞2の特徴は、制御条件下でも非生理学的に長いAPsを生成する傾向があること(AP持続時間>700ms)であると思われる。MEAシステムは、固有の0.1Hz ACフィルタリングを適用し、その結果、基礎となるAPの開始と終了に関する定性的情報を遮ることなく、部分的にフィルタリングされた形状のLiAPが得られました。
その結果、不整脈電圧たわみの初期発生は、FP記録と比較して、liAPの低濃度で検出できることが判明しました。 図6 に示されているのは、3μMの濃度でのドフェチリドの適用中の電気的活動の記録である。記録は同じウェルで得られた。FPとliAPはどちらも約2秒の持続時間を示しましたが、FP波形は目立たず、規則的な再偏光偏向を示しました。同時に、LiAPの終わりに、さまざまな大きさのEADが表示されるようになりました。関連する安全性-薬理学的感受性のこの増加は、表面プラズモン共鳴によって誘導されるliAPが再分極相の適格性を改善し、それによって研究中の試験化合物の作用機序についてさらに学ぶのに役立つという発見をさらに裏付けています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> 図1:細胞内記録のセットアップおよび例示的な記録 。 (A)セットアップの概要。(B)オープンMEA記録アンプを備えた記録システムの上面図。(C)右側に仮想MEAマップを持つ初期化ソフトウェア。1:防振テーブル、2:細胞内記録システム、3:レーザー保護蓋、4:加湿カルボゲンチャンバー、5:MEA加熱システム、6:MEAインターフェースボード、7:記録アンプ内の1ウェルMEAチップ。(D)LiAPの誘導前後の1つの電極からの記録例。上:約6分の録画点線は、下部に表示される展開領域を示します。(E) 拡大FP (上) と liAP (下) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> 図2:信号伝搬パターンはLiAP誘導後も保存されています。 シンシチウム内の励起波の信号伝搬の偽色分け。青は早期(-4ミリ秒から開始)を示します。赤色は、カラーバーで示されているように、参照電極E54で得られた信号からの遅い時間ポイント(+3ms)を示す。信号は電極アレイの右上から左下に移動します。(A)liAP誘導前、(B)liAP誘導の1分後。(C)LiAP誘導の4分後。フラッシュ記号は、電極64におけるレーザ誘導点を示す。全体的な伝搬方向の違いは見られないことに注意してください。黒い四角形は無効なデータを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> 図3:FP/liAPパラメータの定義と記録プロトコル (A)古典的なFPから抽出できるパラメータ。 (B)liAPから取得できる追加のパラメータ。(C)薬物測定のタイムライン。左から右へ:60秒間の制御記録、liAPの誘導、60秒間のliAPの記録、薬物塗布、洗浄時間300秒、liAPの再誘導、60秒間のliAPの記録。 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> 図4:ニフェジピンは濃度依存的に心臓LiAPを短縮 します。 (A)上:コントロール(青)および0.3 μMニフェジピン存在下(赤)でのFPトレース。トレースは、わかりやすくするために Y 軸オフセットで表示されます。下:同じMEA録音からのliAPトレースにより、ビートレートの増加と相まってliAPが短縮されます。(B)対照中の単一LiAPの重ね合わせ(青)および異なる濃度のニフェジピンの適用(赤)。a: 0.01 μM, b: 0.1 μM, c: 0.3 μM. 濃度が上がるにつれてLiAP持続時間が短くなることに注意してください。(C) FP(黒)とliAP(赤)の記録から得られた信号幅の濃度応答関係。データはn=3実験からのものであり、対照に対して正規化したものである。エラーバーは平均の標準誤差を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> 図5:E4031は(プロ)不整脈行動を誘発する。 (A)制御条件におけるFP(上)およびliAP(下)。(B-C)FPとliAPは、E4031(0.1μM)を適用した後、異なる時点で記録されました。80秒後、最初のEADがLiAPの最後に表示されます(B、赤い矢印でマークされています)。EADは、試験化合物(C)の存在下で320秒後に異所性拍動に変換されます。(D)530秒後、心臓合胞体は頻脈状態に入ります。liAP録音から描かれたトレース。(E) FP(黒)とliAP(赤)幅の濃度応答関係。n=4実験からのデータを、対照に正規化した。エラーバーは平均の標準誤差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> 図6:不整脈イベントの検出は、FPよりもliAPの方が感度が高い 。 (A)FP記録と(B)3μMドフェチリドの施用中の同じウェル内でのliAP記録。一部のLiAPの最後にはEADは検出可能ですが、FP記録では検出できません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

レーザーポレーションと微小電極アレイ(MEA)の組み合わせにより、培養された初代および幹細胞由来の心筋細胞の活動電位のような記録が可能になります。波形形状は、標準的な記録よりもテスト化合物の作用モードに関する優れた洞察を提供します。パッチクランプとMEA読み出しをリンクして、将来の心臓安全性研究をさらに最適化します。

安全性薬理学の予測性を高めるための微小電極アレイ上の心筋細胞のレーザー誘起活動電位様測定

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

この方法では、従来のMEAの細胞内同様の活動電位を記録することができ、それによってAP形状のより良い記述と不整脈誘発電位のより敏感な分類が可能になります。典型的な電界電位記録と比較して、細胞内の実際の電位形状は、下にあるイオンチャネルの正確な承認についてより多くの洞察を提供します。本方法は、幹細胞技術により臨床患者由来の心筋細胞に適用することで、原因診断、および不整脈などの心疾患のパーソナライズに寄与することができ、当社の技術者であるKarin Gebhardtが心筋細胞培養を実証します。以前にオートクレーブ処理したMEAの電極場のコーティングを開始するには、層流フードの下に10マイクロリットルのピペットを使用してフィブロネクチンを滴下します。浸透圧ショックを軽減するために、融解心筋細胞を入れた50ミリリットルのチューブにめっき液を90秒間滴下します。8ミリリットルのメッキ培地をチューブに静かに加え、細胞懸濁液を注意深く混合します。10ミリリットルのピペットを使用して上清を取り除き、ペレットを廃棄しないようにし、細胞数を最終濃度に調整します。セル着座前に、10マイクロリットルのピペットを使用して、塗布されたコーティング溶液をMEA電極領域から除去します。コーティングシードの乾燥を避けるために、6つのウェルMEAと1つのウェルMEAの両方の電極フィールドに4マイクロリットルのセルを滴下することにより、セルをすぐに乾燥させ、セルを摂氏37度で1時間接着させ、5%二酸化炭素。層流フードの下に、摂氏37度に加熱した200マイクロリットルと1ミリリットルの滅菌めっき媒体をそれぞれ6つのウェルMEAとシングルウェルMEAに追加します。MEA記録の場合は、MEAチップホルダーを対物レンズの穴の中央に配置して、MEAシステムをデバイスの上に配置します。次に、対物レンズがMEAシステムの穴の真下になるように、MEAセットアップを配置してレーザーを電極に焦点を合わせます。細胞が機械的障害から回復できるようにするには、記録の15分前に培養細胞を含むMEAチップをインキュベーターからMEAセットアップに移します。次に、イソプロパノール綿棒を使用してコンタクトパッドとピンを慎重に清掃し、ノイズレベルを下げます。MEAをMEAセットアップに慎重に配置し、右側にシリアル番号が見える6ウェルMEAチップ、または左側に参照電極が付いたシングルウェルMEAチップを配置します。次に、MEAシステム統合加熱を摂氏38度に設定します。統合された安全スイッチは、MEAチップの上で蓋が閉じられている場合にのみレーザーをアクティブにするため、デバイスの蓋を閉じます。MEA設定プログラムを使用して、ハイパスとローパスのMEAシステムフィルタをそれぞれ0.1ヘルツ以下と3, 500ヘルツに設定します。録音には、MCラックソフトウェアまたは代替ソフトウェアを使用してください。実験に応じて入力範囲を調整します。信号がアンプとサンプリングレートを飽和させないようにします。ソフトウェアの長期表示機能を使用して、記録を確認します。MEAチップをMEAセットアップに挿入し、ソフトウェアをセットアップした後、FBALPソフトウェアを使用してレーザー力学を初期化します。次に、初期化ボタンをクリックします。初期化の最後に、仮想レーザーポイントは、6ウェルMEAの場合はウェルDに、1ウェルMEAの場合は左下にあります。次に、マウスクリックでコントロールキーを使用して、仮想レーザーポイントをD 5電極の中央に移動し、コントロールキーを押しながらマウスホイールでスクロールしてフォーカスを調整します。または、オートフォーカス機能を使用します。ボタンを押すと、仮想レーザーポイントが自動的にウェルFに移動します。実験要件に応じてレーザー出力と処理時間を調整します。レーザーを有効にするには、レーザーオンとして表示されるレーザーオフボタンをクリックし、録音ソフトウェアに切り替えます。ファイル名を選択し、赤い録音ボタンをクリックしてから、ウィンドウ上部の再生ボタンをクリックして測定値を記録します。レーザーでセルを開く前に、60秒間ベースラインを記録します。初期化ソフトウェアに戻り、ソフトウェアウィンドウの右側にある仮想マップでレーザーによって除外される電極を無効にします。レーザーを開始するには、Altマウスクリックを使用して、このウェルの中心電極を選択します。これにより、このウェルの各電極上のセルを自動的に開くレーザーを開始し、この選択されたウェルの以前に活性化された電極をすべて開くために各ウェルについて繰り返す。ミリモル濃度のニフェジピンE-40 31、およびドフェチリドを最初にDMSOに溶解し、次に完全培地に所望の濃度の10倍に溶解する。ウェル内の最終DMSO濃度0.1%を超えないようにしてください。ベースラインアクティビティを60秒間記録します。前に示したようにレーザー誘起ペレーションを開始し、FPSをliAPに変換します。すべての薬をウェルあたりの単一濃度として適用します。6ウェルとシングルウェルのMEAからそれぞれウェルあたり20マイクロリットルと100マイクロリットルの培地を除去します。測定する原薬20マイクロリットルまたは100マイクロリットルをウェルに加えます。MEAの種類にもよりますが、慎重に上下に2〜3回ピペットで入れます。コンパウンドを300秒間洗い流します。この間、liAP形状がFP形状に変形することがあります。ここでも、誘導されたレーザー誘発ペレーションを行い、liAP上の可能性のある化合物誘発欠陥をさらに60秒間記録します。ニフェジピンの添加は、濃度依存的にliAPのプラトー相を減少させ、それによってliAP全体を短縮した。この短縮は、操作されていない電極からの心筋細胞の電界電位に匹敵しました。E-40 31は、関連するKV一点11カリウムチャネルの再分極を阻害し、増加した濃度で心筋細胞の不整脈挙動を引き起こした。また、E-40 31は濃度依存的にliAP持続時間を増加させた。LiAPの終わりには、0.1マイクロモルで小さな正の電圧偏向が観察され、これは高濃度でより顕著になり、EADと呼ばれる一時的な新しい脱分極を示しています。0.1マイクロモルの最高濃度では、これらのEADは時間の経過とともに異所性拍動にエスカレートしました。これは時期尚早の活動電位です。EADと異所性拍動は、不整脈活動の重要な指標です。そして結局、電気的活動は不整脈拍動をもたらします。濃度応答関係は、FPおよびliAP記録と相関した。さらに、ドフェチリドの存在下では、FPとliAPの両方が同じウェル内で約2秒の持続時間を示し、FP波形は規則的な再分極偏向を示した。liAPにいる間、EADは検出可能です。焦点が合っていない顕微鏡画像が細胞の開口部に影響を与える可能性があるため、各メロメンの前に焦点を調整することが重要です。また、活動電位は、オプターペレーションを分析に使用する必要がある直後に取得されます。この技術は、標準的なMEAと比較して、以前の不整脈効果の検出においてより感度が高く、有害な化合物効果をより正確に検出することができます。

Research

JoVE Journal

Medicine

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