Name: laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Forfatterne vil takke Foresee Biosystems for utlån av IntraCell-systemet under studiene. De vil også takke Hae In Chang for teknisk assistanse. Dette arbeidet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020s forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale nr. 964518 (ToxFree), fra EUs Horizon Europe European Innovation Council Programme, prosjekt SiMulTox (tilskuddsavtale nr. 101057769), og fra utenriksdepartementet Baden-Württemberg for økonomi, arbeid og turisme.

1. Indusert pluripotent stamcelle-avledet kardiomyocytter forberedelse
MERK: iCell kardiomyocytter2 (referert til som induserte pluripotente stamcelle [iPSCs]-avledede kardiomyocytter) ble utarbeidet i henhold til protokollen gitt av leverandøren. Protokollen vil bli kort oppsummert i følgende avsnitt.
<ol><li>Tøm plating og vedlikeholdsmedium ved 4 °C i 24 timer før bruk.</li>
	<li>Forbered fibronektinbelegg ved å oppløse sterilt fibronektin i sterilt vann i en konsentrasjon på 1 mg / ml. Frys lagre dette lageret i aliquots (f.eks. 25 μL per aliquot). Fortynn den aliquoted stamløsningen 1:20 i steril Dulbeccos balanserte saltløsning (dPBS).</li>
	<li>Belegg elektrodefeltene til de tidligere autoklaverte MEAene under den laminære strømningshetten, dråpemessig under sterile forhold med fibronektin ved hjelp av en 10 μL pipette. For dette, slipp 5 μL av fibronektinbeleggløsningen på elektrodefeltene og observer dannelsen av en dråpe på toppen av elektrodeområdet. Pass på at du ikke berører de følsomme elektrodene. MERK: For å opprettholde sterile forhold, overfør MEA-brikken til en steril petriskål før du fjerner den fra den laminære strømningshetten.</li>
	<li>Inkuber de belagte MEAene i 1 time ved 37 °C i en inkubator fortrinnsvis.</li>
	<li>Tine kryovialet som inneholder kardiomyocytter i et vannbad ved ca. 37 °C i 2 minutter til det bare er litt iskrystall igjen. Overfør celleoppløsningen forsiktig til et 50 ml rør.</li>
	<li>Tilsett 1 ml pletteringsmedium til den tomme kryovialen. Overfør løsningen dråpevis over en tidsperiode på 90 s til 50 ml røret for å redusere det osmotiske sjokket. Tilsett forsiktig ytterligere 8 ml pletteringsmedium i røret.</li>
	<li>Bland cellesuspensjonen forsiktig med en 10 ml pipette. Beregn totalt antall levedyktige celler ved hjelp av automatisert fluorescenscytometri. Tallet skal være nær nummeret i databladet fra produsenten.</li>
	<li>Spinn celleoppløsningen ned i 3 minutter ved 200 x g ved romtemperatur. Fjern supernatanten ved aspirasjon ved hjelp av en glasspipette festet til et pumpesystem. Juster celletallet mellom 6 000 og 15 000 levedyktige celler/μL. MERK: Antall celler er vanligvis i området gitt ovenfor, men kan variere avhengig av respektive leverandør.</li>
	<li>Fjern beleggløsningen som ble påført i trinn 1.3 fra MEA-elektrodeområdet ved hjelp av en 10 μL pipette rett før cellesåing. Frø cellene umiddelbart etter fjerningen for å unngå tørking av belegget. For dette, frø cellene dråpevis ved 4 μL for både 6-brønns MEA og 1-brønns MEA på elektrodefeltene på samme måte som gjort med belegget.</li>
	<li>La cellene feste seg i 1 time i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 før du fyller brønnene med det sterile pletteringsmediet oppvarmet til ca. 37 °C ved 200 μL for 6-brønns MEA og 1 ml for enkeltbrønn MEA under den laminære strømningshetten.</li>
	<li>Utfør en fullstendig mediumendring 48 timer etter plating under den laminære strømningshetten. For dette, fjern pletteringsmediet ved aspirasjon ved hjelp av en glasspipette festet til et pumpesystem. Tilsett deretter 200 μL sterilt vedlikeholdsmedium oppvarmet til 37 °C i brønnene.</li>
	<li>Utfør fullstendige middels endringer annenhver dag.</li>
	<li>Begynn å måle cellene 5-8 dager etter tining. Utfør en fullstendig mediumendring 2 timer før du starter eksperimentene.</li>
</ol>2. MEA-opptak
MERK: Enheten som brukes til å transformere FP-signalet til liAP, består av et oppreist mikroskop og en 1064 nm laser.
<ol><li>Plasser MEA-systemet på toppen av enheten med MEA-brikkeholderen sentrert over målhullet. Plasser MEA-oppsettet slik at målet er rett under hullet i MEA-systemet for å la laseren fokusere på elektrodene.</li>
	<li>Overfør MEA-brikken med de dyrkede cellene fra inkubatoren til MEA-oppsettet 15 minutter før opptak, slik at cellene kan komme seg fra den mekaniske forstyrrelsen.</li>
	<li>Rengjør kontaktputene og pinnene forsiktig med isopropanol og en bomullspinne for å redusere støynivået. Plasser MEA nøye i MEA-oppsettet. Plasser MEA-brikken med logoen nederst øverst til venstre (6-brønns MEA) eller med referanseelektroden til venstre (enkeltbrønns MEA).</li>
	<li>Sett den MEA-systemintegrerte oppvarmingen til 38 °C. Plasser et lite kammer på toppen av MEA-brikken for å konstant perfusere cellene med fuktet karbogen (5% CO 2 og 95% O2) for å gjenskape inkubatorforhold og forhindre fordampning.</li>
	<li>Lukk lokket på enheten. Den integrerte sikkerhetsbryteren gjør det bare mulig å aktivere laseren hvis lokket er lukket over MEA-brikken. Sett MEA-systemfilteret ved hjelp av MEA-konfigurasjonsprogrammet til 0,1 Hz eller mindre high-pass og 3 500 Hz low-pass.</li>
	<li>Bruk MC_Rack-programvaren (opptaksprogramvare) eller annen alternativ programvare for opptak. Juster inngangsområdet i henhold til dine behov, slik at signalet ikke metter forsterkeren og samplingsfrekvensen (f.eks. 20 kHz). Bruk programvarens langsiktige visningsfunksjon for å sjekke opptaket.</li>
</ol>3. Laser-indusert celleporering
<ol><li>Etter å ha satt MEA-brikken inn i MEA-oppsettet og satt opp programvaren, initialiser lasermekanikken ved hjelp av FB Alps-programvaren (initialiseringsprogramvare).</li>
	<li>Klikk først på Initialisering-knappen . På slutten av initialiseringen vil det virtuelle laserpunktet være i brønn D for henholdsvis en 6-brønns MEA og nederst til venstre for en enkeltbrønns MEA.</li>
	<li>Flytt det virtuelle laserpunktet med Ctrl + museklikk inn i midten av elektroden D5 og juster fokuset. Juster fokuset ved å Ctrl + rulle med musehjulet.</li>
	<li>Trykk på knappen Set P1. Det virtuelle laserpunktet flyttes automatisk inn i brønn F. Gjenta prosessen med elektroden F5 og velg Sett P2.</li>
	<li>Etter denne prosedyren vil laserpunktet bevege seg inn i brønn B. Gjenta den samme prosessen med elektrode B5 og trykk Sett P3 i programvaren. Systemet er nå justert.</li>
	<li>Juster lasereffekten og prosesstiden i henhold til cellenes behov. Her ble det brukt 40% strøm og 25% prosesstid.</li>
	<li>For å aktivere laseren, klikk på Laser Av-knappen , som deretter vises som laser på. Bytt til innspillingsprogramvaren, velg et filnavn, og klikk på Rød opptak-knappen etterfulgt av Spill-knappen øverst i vinduet for å registrere målingen.</li>
	<li>Ta opp en grunnlinje på 60 s før du åpner cellene med laseren. Bytt tilbake til initialiseringsprogramvaren.</li>
	<li>Deaktiver elektroder som skal utelukkes av laseren på det virtuelle kartet på høyre side ved hjelp av Ctrl + museklikk. Velg elektrodene av interesse ved å aktivere dem på matriserepresentasjonen på høyre side av programvarevinduet.</li>
	<li>For å starte laseren, bruk Alt + museklikk og velg senterelektroden til denne brønnen. Dette starter laseren for automatisk å åpne cellene på hver elektrode i denne brønnen. Gjenta for hver brønn. Laseren vil da åpne alle tidligere aktiverte elektroder av den valgte brønnen automatisk.</li>
</ol>4. Legemiddelhåndtering og anvendelse
<ol><li>Forbered alle stoffer som skal brukes til dopingtester ferskt på måledagen. Sørg for at den endelige påføringskonsentrasjonen er 10 ganger høyere i medium for å lage en 1:10 fortynning i brønnene.</li>
	<li>Oppløs Nifedipin, E4031 og Dofetilide først i DMSO i mM-konsentrasjon, og deretter videre i medium til 10x av ønsket konsentrasjon. Overskrid aldri en endelig DMSO-konsentrasjon på 0,1% i brønnen.</li>
	<li>Registrer basisaktiviteten for 60 s. Start den laserinduserte porasjonen som beskrevet i trinn 3 i protokollen, noe som resulterer i en transformasjon av FP til liAP-form.</li>
	<li>Påfør alle stoffene som enkeltkonsentrasjon per brønn. Fjern 20 μL medium per brønn for henholdsvis 6-brønns MEA og 100 μL for enkeltbrønns MEAer. Tilsett 20 μL eller 100 μL, avhengig av MEA-typen, av stamløsningen av legemidlet som skal måles til brønnen og forsiktig pipette opp og ned 2-3 ganger. Utfør minst tre replikasjoner av hvert legemiddel og konsentrasjon for å oppnå statistisk relevans.</li>
	<li>La forbindelsene vaske inn i 300 s. I løpet av denne tiden kan liAP-formen forvandle seg tilbake til FP-form. Igjen, indusere laserindusert porering og registrere mulige sammensatte induserte effekter på liAP i ytterligere 60 s.</li>
</ol>5. Eksport av data
<ol><li>Velg relevante elektroder ved å spille av opptaket i opptaksprogramvaren. Bruk MC_DataTool til å konvertere MC_Rack filer til ASCII-.txt filer.</li>
	<li>Klikk på Fil > Åpne MCD > Velg en MC_Rack fil. Klikk på txt-knappen (blå tekst).</li>
	<li>Velg en elektrode. Den valgte elektroden vises i listen på høyre side.</li>
	<li>Klikk på Bla gjennom for å velge mappen og endre navnet på den nye .txt filen. Klikk på Lagre.</li>
	<li>Fjern merket for den eksporterte elektroden, og velg den neste elektroden du vil eksportere. Gjenta prosedyren for alle elektroder av interesse.</li>
</ol>6. Datahåndtering og statistisk analyse
<ol><li>Importer konverterte binære spor til R19. Visualiser/analyser dataene ved hjelp av skreddersydde skript som inneholder følgende pakker: dplyr, tidyr og ggplot220,21,22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+arrhythmias.">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li><li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hERG+(KCNH2+or+Kv11.1)+K++channels:+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk.">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li><li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development.">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li><li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmia.">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).</li><li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+arrhythmias:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li><li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICE+models:+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes.">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100 (2013).</li><li>Rampe, D., Roy, M. -. L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+(Propulsid):+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG.">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li><li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes.">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li><li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents.">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).</li><li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart.">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li><li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-speed,+bright,+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity.">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Kovacs, G. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+sensors+with+living+cellular+components.">Electronic sensors with living cellular components.</a> Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).</li><li>Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+field+potentials+measured+on+a+multi+electrode+array+in+pharmacological+toxicity+screening+on+primary+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).</li><li>Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rapid+delayed+rectifier+K++current+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes.">Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.</a> Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).</li><li>Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+test+in+isolated+female+rabbit+heart+reliably+identifies+action+potential+duration+prolongation+and+proarrhythmic+drugs:+importance+of+triangulation,+reverse+use+dependence,+and+instability.">Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).</li><li>Dipalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+action+potential+recordings+from+cardiomyocytes+by+ultrafast+pulsed+laser+irradiation+of+fuzzy+graphene+microelectrodes.">Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2021)</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2022)</li><li>. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2021)</li><li>Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+calcium+channel+blockers.">Discovery and development of calcium channel blockers.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).</li><li>Vater, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic+acid+dimethyl+ester+(Nifedipine,+BAY+a+1040).">Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040).</a> Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).</li><li>Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+E-4031-sensitive+potassium+current+in+rat+carotid+chemoreceptor+cells.">Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Fendyur, A., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+on-chip,+in-cell+recordings+from+cultured+cardiomyocytes+by+arrays+of+gold+mushroom-shaped+microelectrodes.">Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes.</a> Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).</li><li>Hayes, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+action+potential+measurements+from+intact+cardiac+monolayers+with+multiwell+microelectrode+array+technology.">Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne innovative metoden demonstrerer en ny måte å undersøke in vitro den farmakologiske moduleringen av hjertets virkningspotensial under anvendelse av kardioaktive farmakologiske verktøyforbindelser.
Klassiske MEA-opptak tillater FP-opptak, som er derivatet av hjerte-AP14. Denne indirekte registreringen forvrenger tidsforløpet for de- og repolariseringen og eliminerer dermed viktige egenskaper ved AP. Videre, selv om den transcellulære spenningsendringen til en AP vanligvis når verdier på omtrent 100 mV, forblir den totale FP-amplituden sammenlignbart lav, med toppamplituder mellom flere 100 μV og lave ensifrede mV-verdier. På grunn av opptaksprinsippet er repolariseringsfasen liten; i mange tilfeller er det bare påviselig og ofte av uklar form, noe som gjør det vanskelig å definere slutten av FP. Åpningen av cellemembranen gjør at vi kan få tilgang til den intracellulære spenningen, og dermed avdekke tidsforløpet til hjerte-AP. Det er flere fordeler med denne opptaksmetoden sammenlignet med FP-opptak. For det første er signalamplituden mer fremtredende, noe som gir et overlegent signal-til-støy-forhold. For det andre resulterer bølgeformen i bedre påvisning av repolariseringen. For det tredje bidrar formen på repolariseringsfasen innsikt i virkemåten til testforbindelsen, gitt av brattheten til signalavslappingen. Og til slutt gir denne metoden en forbedret følsomhet for å oppdage kritiske bivirkninger, demonstrert av opptakseksemplet vist i figur 6 for forekomsten av EADer i liAP, men ikke i FP.
Så langt er det to måter å få tilgang til den intracellulære AP. Den første oppnås ved elektroporering26,27. Her kan korte og sterke spenningspulser påført via opptakselektrodene åpne cellemembranen28. Den andre muligheten er membranåpningen via en laserpuls, ved hjelp av et fysisk fenomen kalt overflateplasmonresonans, som vist her. En av fordelene sammenlignet med elektroporering er den økte sannsynligheten for påfølgende åpninger. På grunn av det svært fokuserte laserpunktet (1-3 μm) er denne effekten svært lokalt begrenset til elektroden av interesse. Interessant nok endret initieringen av liAP ikke signalutbredelsen av det kultiverte syncytiumet. Dette indikerer at selv om celleintegriteten er skadet, ser kardiomyocytter ikke ut til å depolarisere via hullet i membranen.
Det er begrensninger for denne metoden. Som ved elektroporering varer membranåpningen i de fleste tilfeller ikke over hele forsøkskurset. De minimale effekt- og varighetsinnstillingene til laserpulsen som kreves for stabil åpning av den spesifikke celletypen av interesse, må defineres uavhengig før forsøkene. Vi fant (ikke vist) at parametrene varierer drastisk mellom ulike celletyper (i vårt tilfelle flere hiPS-avledede og primære kardiomyocytter). Dette unngår unødvendig stress på cellene under det sammensatte testeksperimentet og resulterer i mer pålitelige og reproduserbare data. Det er av avgjørende betydning å justere z-aksen for å gi et klart fokus på cellene og elektrodene. Et ufokusert kamerabilde gir i et laserpunkt plassert på et suboptimalt nivå, noe som potensielt resulterer i manglende evne til å åpne cellemembranen. Selv med best justerte parametere er liAP-effekten forbigående, og amplituden reduseres over tid. Videre varierer tilgangen til det intracellulære rommet til cellene mellom liAP-induksjoner, både innenfor påfølgende åpninger ved samme elektrode og mellom elektroder. Dette resulterer i høy variabilitet av liAP-amplituden. Årsaken er ennå ikke fullt ut forstått. Mulige forklaringer inkluderer mekaniske problemer som en drift av laserfokuset eller annen subcellulær lokalisering av membranåpningen. Dette gjør analysen av amplitudeeffekter av testforbindelser komplisert på dette tidspunktet. Registrering av elektrisk aktivitet av et MEA-system krever også høypassfiltrering for å kompensere for uunngåelig grunnlinjedrift. Selv om denne filtreringen i systemet som ble brukt her, ble satt til 0,1 Hz (den laveste filterinnstillingen som er tilgjengelig for dette systemet), var filtreringseffekter under platåfasen fortsatt synlige, noe som resulterte i en langsom trend av spenningsavbøyningen mot grunnlinjen under platåfasen av hjertets AP. Dette er spesielt problematisk med omfattende lange underliggende AP-er som de iPSC-avledede iCell-kardiomyocytter2 som brukes her, som allerede genererer AP >700 ms under kontrollforhold. Bruk av systemer med lavere filtrering kan bedre bevare formen på AP og gi enda bedre tilgang til tidsforløpet for repolariseringsfasen.

Det elektriske bidraget til et hjerteslag skyldes et komplekst og nøyaktig tidsbestemt samspill mellom mange hjertekanaler og transportører, samt nøyaktig innstilt forplantning av elektriske signaler gjennom myokardiet1. Endring av disse tett koordinerte mekanismene (f.eks. bruk av legemidler) kan føre til alvorlige konsekvenser for hjertefunksjonen (dvs. livstruende arytmi)2,3. Arytmier er definert som uregelmessige hjerteslag som endrer normal rytme i hjertet, noe som kan ha livstruende konsekvenser. De kan være forårsaket enten av nedsatt initiering av en bølge av hjerteeksitasjon eller ved unormal forplantning av hjerteeksitasjon4, noe som igjen resulterer i en dysfunksjon av hjertets pumpemekanisme.
Mange svært potente legemiddelkandidater må utelukkes fra videre undersøkelser i den tidlige legemiddelutviklingsfasen på grunn av deres (pro-) arytmiske potensial 2,3. De modulerer viktige hjertekanaler (f.eks. den humane eter-en-go-go-relaterte genkanalen [hERG]) som er ansvarlige for normal dannelse og avslutning av hjertevirkningspotensial, samt påfølgende signalutbredelse5.
Farmasøytiske selskaper bruker rutinemessig patch-clamp-målinger eller mikroelektrodearrayer (MEA) for å undersøke potensielle kardiotoksiske off-target-effekter indusert av legemiddelkandidater. Patch-klemmeopptak gjør det mulig å dechiffrere virkningen av stoffer på hjerteionkanaler og å analysere det transcellulære hjertehandlingspotensialet med høy spatio-temporal oppløsning 6,7. Ulemper ved denne teknikken inkluderer imidlertid lav gjennomstrømning med manuell patch-klemme og begrenset anvendelighet av automatisering på grunn av avhengigheten av denne metoden på celler i suspensjon. Videre kan kroniske effekter ikke undersøkes på grunn av metodens invasivitet. Til slutt studeres vanligvis bare enkeltceller samtidig i stedet for hele hjertesyncytiumet, noe som gjør det umulig å adressere informasjon om signalutbredelse.
Spenningsfølsomme fargestoffer er verdifulle for ikke-invasiv undersøkelse av hjertehandlingspotensialer og legemiddelinduserte arytmier8. De tillater undersøkelse av både enkeltcelle- og syncytiumaktivitet. Ulemper ved denne metoden er cytotoksiske effekter av enten fargestoffene i seg selv eller av reaksjonsproduktet under belysning. De brukes til akutte eksperimenter og er neppe anvendelige for langtidsstudier 9,10,11. Spenningsfølsomme proteiner som alternativer har gjort betydelige fremskritt de siste par årene når det gjelder brukervennlighet og følsomhet, men krever genetisk modifisering av cellene av interesse og mangler høy tidsmessig oppløsning sammenlignet med elektrofysiologiske teknikker12.
Informasjon fra det nyeste CiPA-initiativet13 sier at MEAer er mye brukt i hjertesikkerhetsundersøkelser som en alternativ elektrofysiologisk tilnærming, da de representerer et kraftig og veletablert verktøy for å undersøke hjertefunksjon og sikkerhetsfarmakologi. Kardiomyocytter dyrkes som et syncytium direkte på toppen av brikkene, og ekstracellulære feltpotensialer (FPs) registreres ikke-invasivt via substratintegrerte mikroelektroder. Dette opptaksprinsippet gjør det mulig å gjennomføre økte gjennomstrømningsscreeninger over flere dager, noe som gjør dem egnet for farmasøytisk forskning på kroniske effekter. Den resulterende FP-bølgeformen er et derivat av den intracellulære AP14. Parametere som takthastighet, amplituden til den første delen av FP og FP-varigheten er lett tilgjengelige15. Andre viktige kriterier som differensiering mellom forlengelse og triangulering av FP (en viktig markør for proarytmi16,17) er utilgjengelige på grunn av teknikkens AC-filtreringseffekt. Videre er det ofte lett å oppdage andre små proarytmiske hendelser som tidlige og forsinkede etterdepolariseringer (henholdsvis EAD og DAD) på grunn av deres lille amplitude.
Her beskriver vi en metode for å få tilgang til det intracellulære membranpotensialet ved å åpne membranen til kardiomyocytter. IntraCell-enheten (heretter kalt intracellulær opptaksenhet) tillater gjentatte membranåpninger av kardiomyocytter dyrket på toppen av MEA-elektrodene ved hjelp av en svært fokusert nanosekund laserstråle via et spesifikt fysisk fenomen (overflateplasmonresonans)18. Som et resultat går opptaket fra en vanlig FP til en intracellulær AP (laserindusert AP, liAP). Protokollen viser hvordan dette gir tilgang til kinetiske aspekter ved bølgeformen som ikke lett kan fanges opp ved å analysere FPer. Denne metoden representerer en bro mellom tradisjonelle intracellulære patchklemmer og MEA-opptak. Teknologien er derfor en kraftig utvidelse av dagens metoder for vurdering av hjertesikkerhet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>7600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>20-139 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>D-100</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>12037539</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>E-500</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB Alps version 0.5.005</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>11051407001</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell cardiomyocytes</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CN09.1</td>
			<td>For cleaning of MEA contact pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>#M1003</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Data Tool</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Rack</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>MEA recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 - 2x60 - system</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890485</td>
			<td>For MEA-recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>N7634 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>M1001</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergazyme</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>1304-1</td>
			<td>cleaning of MEAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology

Livstruende legemiddelindusert hjertearytmi innledes ofte av langvarige hjertevirkningspotensialer (AP), ofte ledsaget av små proarytmiske membranpotensialfluktuasjoner. Formen og tidsforløpet til den repolariserende fraksjonen av AP kan være avgjørende for tilstedeværelse eller fravær av arytmi.
Mikroelektrodearrayer (MEA) gir enkel tilgang til kardiotoksiske forbindelseseffekter via ekstracellulære feltpotensialer (FP). Selv om det er et kraftig og veletablert verktøy innen forskning og hjertesikkerhetsfarmakologi, tillater ikke FP-bølgeformen å utlede den opprinnelige AP-formen på grunn av det ekstracellulære opptaksprinsippet og den resulterende intrinsiske vekselstrømfiltreringen (AC).
En ny enhet, beskrevet her, kan gjentatte ganger åpne membranen til kardiomyocytter dyrket på toppen av MEA-elektrodene ved flere dyrkingstidspunkter, ved hjelp av en svært fokusert nanosekund laserstråle. Laserporasjonen resulterer i å transformere det elektrofysiologiske signalet fra FP til intracellulære lignende AP-er (laserindusert AP, liAP) og muliggjør registrering av transcellulære spenningsavbøyninger. Denne intracellulære tilgangen gir en bedre beskrivelse av AP-formen og en bedre og mer sensitiv klassifisering av proarytmiske potensialer enn vanlige MEA-opptak. Dette systemet er en revolusjonerende utvidelse av de eksisterende elektrofysiologiske metodene, og tillater nøyaktig evaluering av kardiotoksisk effekt med alle fordeler med MEA-baserte opptak (enkle, akutte og kroniske eksperimenter, signalutbredelsesanalyse, etc.).

Registreringssystemet som ble brukt til å registrere elektrisk aktivitet fra dyrkede kardiomyocytter besto av et standard MEA-system utstyrt med en varmeapparat og et kammer for karbogen festet til en datamaskin. Systemet ble satt på toppen av den intracellulære opptaksenheten, som igjen ble montert på toppen av en liten antivibrasjonsenhet (figur 1A-B).
iPSC-avledede kardiomyocytter 2 begynte å slå spontant innen 2-3 dager etter tining (dager in vitro, DIV) og var synlige under et mikroskop. Fra DIV 4 og fremover ble slagfrekvensen vanlig, og ekstracellulære feltpotensialer (FP) med topp-til-topp-amplituder av den depolariserende komponenten mellom 1 og 5 mV kunne detekteres på de fleste elektrodene i de respektive brønnene til MEA-brikkene. Den elektriske aktiviteten kunne oppdages i mer enn 95% av brønnene som ble undersøkt. Fra DIV 7 og utover økte sannsynligheten for celleløsning, noe som gjorde videre bruk av disse brønnene umulig.
Programvaren for å kontrollere den laserinduserte membranåpningen gjør det mulig å justere både kraften og prosesstiden til laseren som formidler åpningen av cellemembranen bare på elektroden som undersøkes (figur 1C), mens andre elektroder i den respektive brønnen er upåvirket. Mens for konservative innstillinger ikke endret bølgeformen til FP, resulterte for høye innstillinger i den antatte skaden av kardiomyocytter, indikert ved kraftig, men forbigående juling eller tap av signalet. Når justert til en innstilling på 40% effekt og 25% prosesstid godt tolerert av cellene, resulterte utløsning av laserpulsen i flere endringer i den registrerte bølgeformen (se figur 1D for et eksemplarisk opptak). Under disse forholdene ble det ikke observert noen endring av elektrodematerialet makroskopisk. Den registrerte signalamplituden økte massivt med 4,1 ± 0,41 (n = 20, område 1,34-8,83) ganger, analysert fra en tilfeldig valgt delmengde av opptak, noe som resulterte i amplituder mellom 7 og 22 mV. Videre transformerte bølgeformen fra en standard FP-form med rask, bifasisk og forbigående spenningsavbøyning i begynnelsen, etterfulgt av en platåfase tilbake ved baseline og en liten avbøyning som indikerer slutten av FP til en form som var nærmere en intracellulært registrert AP med en rask stigning, utvidet depolarisert platåfase og en repolariseringsfase med en undershoot under baseline (figur 1E ). Vi definerte disse spenningsavbøyningene som laserindusert AP (liAP). I de fleste tilfeller var overgangen forbigående og i det minste delvis invertert innen 5 minutter. Signalforplantning i hjertets syncytium forble uendret etter liAP-induksjon (figur 2), noe som indikerer at gjenværende syncytium ikke ble påvirket av potensiell skade fra laserpulsen.
Likheter med intracellulært registrerte AP-er som er tillatt for å trekke ut parametere for liAP som ikke er tilgjengelige for FPs (for eksemplariske parametere, se f.eks. Figur 3A), mest fremtredende måling av varigheten av liAP ved bestemte tidspunkter (f.eks. ved 20%, 50% og 90%) (figur 3B), analogt med APD20/50/90 som vanligvis brukes til beskrivelse av AP-er.
Vi testet deretter responsen til de laseråpnede kardiomyocytter til vanlige kardioaktive farmakologiske verktøyforbindelser. Et eksemplarisk protokolldesign finnes i figur 3C. Siden transformasjonen av liAP ikke alltid vedvarte gjennom hele eksperimentet, ble den sammensatte applikasjonen utført som en enkeltkonsentrasjon per brønn i stedet for på en kumulativ måte for å redusere den totale opptakstiden. Likevel var det nødvendig å enten gjenåpne cellene eller åpne et annet elektrodeområde før påføring av testforbindelsen.
Tilsetningen av den spesifikke L-type Ca 2+ kanalblokkeren, Nifedipin23,24, reduserte platåfasen av liAP på en konsentrasjonsavhengig måte og forkortet dermed hele liAP (figur 4A, B). Denne forkortelsen var sammenlignbar med analysen fra FPs av kardiomyocytter fra umanipulerte elektroder (figur 4C), noe som indikerer at denne registreringsmetoden ikke hadde bivirkninger sammenlignet med klassiske FP-registreringer.
E4031 hemmer repolariseringen av relevant Kv1.11 (hERG) kaliumkanal25 og fører til arytmisk oppførsel av kardiomyocytter ved økte konsentrasjoner. I likhet med analysen fra FP-opptak økte E4031 liAP-varigheten på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 5). I tillegg, ved konsentrasjoner på 0,01 μM og høyere, var små positive spenningsavbøyninger på slutten av liAP synlige. Disse avbøyningene ble mer fremtredende med høyere konsentrasjoner, noe som indikerer en forbigående ny depolarisering, i motsetning til i FPs, hvor disse avbøyningene var praktisk talt usynlige (se figur 5B-C, øvre (FP) vs nedre (liAP) spor). Denne oppførselen er kjent som tidlig etterdepolarisering (EAD). Ved den høyeste konsentrasjonen på 0,1 μM eskalerte disse EADene over tid til ektopiske beats, som er for tidlige handlingspotensialer (figur 5C). Både EAD og ektopiske beats er nøkkelindikatorer for proarytmisk aktivitet. På slutten av eksemplet vist i figur 5D resulterte den elektriske aktiviteten i arytmisk juling. Også konsentrasjon-respons-relasjoner vist mellom FP- og liAP-opptak stemte overens (figur 5E). Det er imidlertid større variasjon i FP-dataene som følge av den svake repolariseringskomponenten i FPene ved høyere konsentrasjoner av testforbindelsen. Det ser ut til å være den karakteristiske naturen til iPSC-avledede kardiomyocytter2 for å ha en tendens til å generere ufysiologisk lange AP-er under kontrollforhold også (AP-varigheter > 700 ms). MEA-systemet brukte en iboende 0,1 Hz AC-filtrering, noe som igjen resulterte i en delvis filtrert form av liAP, men uten å okkludere den kvalitative informasjonen om utbruddet og avslutningen av den underliggende AP.
Det viste seg at den første forekomsten av proarytmiske spenningsavbøyninger kunne påvises ved lavere konsentrasjoner i liAP-er sammenlignet med FP-opptak. Vist i figur 6 er registrering av elektrisk aktivitet under påføring av Dofetilide i en konsentrasjon på 3 μM. Opptaket ble gjort i samme brønn. Selv om både FP og liAP viste varigheter på omtrent 2 s, var FP-bølgeformen diskret, og presenterte regelmessige repolariserende avbøyninger. Samtidig, på slutten av liAP-er, ble EADer i forskjellige størrelser synlige. Denne økningen i relevant sikkerhetsfarmakologisk følsomhet støtter videre funnet at liAP-er indusert av overflateplasmonresonans tillater forbedret kvalifisering av repolariseringsfasen og dermed bidrar til å lære mer om virkemåten til testforbindelsene som undersøkes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> Figur 1: Det intracellulære opptaksoppsettet og eksemplariske opptak . (A) Oversikt over oppsett. (B) Toppvisning av opptakssystemet med åpen MEA-opptaksforsterker. (C) Initialiseringsprogramvare med det virtuelle MEA-kartet på høyre side. 1: antivibrasjonsbord, 2: intracellulært opptakssystem, 3: laserbeskyttelseslokk, 4: fuktet karbogenkammer, 5: MEA varmesystem, 6: MEA-grensesnittkort, 7: 1-brønns MEA-brikke inne i opptaksforsterkeren. (D) Opptak av eksempler fra en elektrode før og etter induksjon av liAP-er. Øverst: opptak på ca. 6 min. Stiplede linjer markerer de utvidede områdene som vises nederst. (E) Forstørret FP (øverst) og liAP (nederst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> Figur 2: Signalutbredelsesmønsteret er fortsatt bevart etter liAP-induksjon. Falsk fargekoding av signalutbredelsen av eksitasjonsbølgen i syncytiumet. Blå indikerer tidlig (starter på -4 ms); rød indikerer sene tidspunkter (+3 ms) fra signalet oppnådd ved referanseelektrode E54 som angitt av fargelinjen. Signalet beveger seg fra øverst til høyre til nederst til venstre i elektrodematrisen. (A) Før liAP-induksjon, (B) 1 min etter liAP-induksjon. (C) 4 minutter etter liAP-induksjon. Blitssymbolet indikerer laserinduksjonspunktet ved elektrode 64. Merk at ingen forskjell i den generelle forplantningsretningen er synlig. Svarte rektangler indikerer ugyldige data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> Figur 3: FP/liAP parameterdefinisjon og opptaksprotokoll . (A) Parametere som kan trekkes ut fra den klassiske FP. (B) Ytterligere parametere som kan fås fra liAPs. (C) Tidslinje for narkotikamåling. Fra venstre til høyre: kontrollregistrering i 60 s, induksjon av liAP, registrering av liAP i 60 s, legemiddelapplikasjon, innvaskingstid 300 s, reinduksjon av liAP, registrering av liAP i 60 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> Figur 4: Nifedipin forkorter hjerte-liAP på en konsentrasjonsavhengig måte. (A) Øverst: FP-spor ved kontroll (blå) og i nærvær av 0,3 μM Nifedipin (rød). Spor vises med en y-akseforskyvning for bedre visualisering. Nederst: liAP-spor fra samme MEA-opptak, noe som resulterer i en forkortelse av liAP kombinert med en økning i taktraten. (B) Superposisjon av enkle liAP-er under kontroll (blå) og påføring av forskjellige konsentrasjoner av nifedipin (rød). a: 0,01 μM, b: 0,1 μM og c: 0,3 μM. Legg merke til forkortelsen av liAP-varigheten med økende konsentrasjoner. (C) Konsentrasjon-responsforholdet mellom signalbredde oppnådd fra FP (svart) og liAP (rød) opptak. Data er fra n = 3 eksperimenter og normalisert til kontroll. Feilfelt angir standardfeilen for gjennomsnittet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> Figur 5: E4031 induserer (pro-) arytmisk oppførsel. (A) FP (øverst) og liAP (nederst) ved kontrollforhold. (BC) FPs og liAPs ble registrert på forskjellige tidspunkter etter påføring av E4031 (0,1 μM). Etter 80 s er de første EAD-ene synlige på slutten av liAP (B; merket med en rød pil). EAD konverteres til ektopiske beats etter 320 s i nærvær av testforbindelsen (C). (D) Etter 530 s går hjertesyncytiet inn i takykardtilstand. Spor avbildet fra liAP-opptak. (E) Konsentrasjon-respons forholdet mellom FP (svart) og liAP (rød) bredde. Data fra n = 4 eksperimenter, normalisert for å kontrollere. Feilfelt angir standardfeilen for gjennomsnittet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> Figur 6: Påvisning av proarytmiske hendelser er mer sensitiv i liAP-er enn FPs . (A) FP-opptak og (B) liAP-opptak i samme brønn under påføring av 3 μM Dofetilide. Mens på slutten av noen liAP-er er EAD-er detekterbare, forblir de uoppdagelige i FP-opptak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

Kombinasjonen av laserporering og mikroelektrodearrayer (MEA) tillater handlingspotensiallignende opptak av dyrkede primære og stamcelleavledede kardiomyocytter. Bølgeformformen gir overlegen innsikt i testforbindelsenes virkemåte enn standardopptak. Den kobler patch-clamp og MEA-avlesning for å optimalisere kardiosikkerhetsforskningen ytterligere i fremtiden.

Laserinduserte virkningspotensiallignende målinger av kardiomyocytter på mikroelektrodearrayer for økt prediktivitet for sikkerhetsfarmakologi

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

Denne metoden gjør det mulig å registrere intracellulære like handlingspotensialer på tradisjonell MEA, og dermed tillate en bedre beskrivelse av AP-formen og en mer sensitiv klassifisering av proarytmiske potensialer. Sammenlignet med typiske feltpotensialopptak gir den intracellulære faktiske potensielle formen mer innsikt i den nøyaktige autorisasjonen av de underliggende ionekanalene. Når den brukes på kardiomyocytter avledet fra kliniske pasienter gjennom stamcelleteknologi, kan metoden bidra til årsaksdiagnose og personalisering av C R P og hjertesykdommer som arytmier Vår tekniker, Karin Gebhardt, vil demonstrere kardiomyocytdyrking.For å begynne å belegge elektrodefeltene til de tidligere autoklaverte MEA-ene, Dropwise med fibronektin ved hjelp av en 10 mikroliter pipette under den laminære strømningshetten. For å redusere det osmotiske sjokket, overfør pletteringsløsningen dråpevis i 90 sekunder inn i 50 milliliter røret som inneholder tinte kardiomyocytter. Tilsett forsiktig åtte milliliter pletteringsmedium i røret og bland cellesuspensjonen forsiktig.Bruk en 10 milliliter pipette, fjern supernatanten, sørg for ikke å kaste pelleten og juster cellenummeret til endelig konsentrasjon. Før celleseter, fjern den påførte beleggløsningen fra MEA-elektrodeområdet ved hjelp av en 10 mikroliter pipette. For å unngå tørking av beleggfrøet cellene umiddelbart ved å legge fire mikroliter av cellene dråpevis på elektrodefeltene for begge, seks brønn MEA og en brønn M E A.Nå, la cellene feste seg til brønnene i en time ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Under den laminære strømningshetten, tilsett 200 mikroliter og en milliliter sterilt platingmedium oppvarmet til 37 grader Celsius for henholdsvis seks Well MEA og single well MEA. For MEA-opptak, plasser MEA-systemet på toppen av enheten med MEA-brikkeholderen sentrert over målhullet. La deretter laseren fokusere på elektrodene ved å plassere MEA-oppsettet, slik at målet er direkte under hullet i MEA-systemet.For å la cellene komme seg fra den mekaniske forstyrrelsen, overfør MEA-brikken med de dyrkede cellene fra inkubatoren til MEA-oppsettet 15 minutter før opptaket. Rengjør deretter kontaktputene og pinnene forsiktig, ved hjelp av en isopropanolpinne for å redusere støynivået. Plasser MEA forsiktig i MEA-oppsettet, og plasser MEA-brikken med serienummeret synlig på høyre side eller en enkelt brønn MEA-brikke med referanseelektroden til venstre.Sett nå MEA-systemets integrerte oppvarming til 38 grader Celsius. Lukk lokket på enheten, da den integrerte sikkerhetsbryteren bare tillater at laseren aktiveres Hvis lokket er lukket over MEA-brikken. Ved hjelp av MEA-konfigurasjonsprogrammet settes MEA-systemfilteret med høyt pass og lavt pass til henholdsvis 0,1 hertz eller mindre og 3 500 hertz.Bruk MC-rackprogramvaren eller annen alternativ programvare for opptak. Juster inndataområdet i henhold til eksperimentet. Sikre at signalet ikke metter forsterkeren og samplingsfrekvensen.Bruk programvarens langsiktige visningsfunksjon for å sjekke opptaket. Etter å ha satt MEA-brikken inn i MEA-oppsettet, og satt opp programvaren, initialiserer lasermekanikken ved hjelp av FB ALP-programvaren. Klikk nå på initialiseringsknappen.På slutten av initialiseringen vil det virtuelle laserpunktet være i brønn D for henholdsvis en seks brønn MEA og nederst til venstre for en enkelt brønn MEA. Bruk deretter kontrolltasten med et museklikk, flytt det virtuelle laserpunktet inn i midten av D fem-elektroden og juster fokuset ved å holde kontrolltasten og bla med musehjulet. Alternativt kan du bruke autofokusfunksjonen.Trykk på knappen sett P en, og det virtuelle laserpunktet vil automatisk flytte inn i brønnen F.Systemet er nå justert. Juster lasereffekten og prosesstiden i henhold til eksperimentelle krav. For å aktivere laseren, klikk på laser av-knappen som vises som laser på, Bytt til opptaksprogramvaren.Velg et filnavn og klikk på den røde opptaksknappen etterfulgt av avspillingsknappen øverst i vinduet for å registrere målingen. Før du åpner cellene med laseren, registrerer du en grunnlinje i 60 sekunder. Bytt tilbake til initialiseringsprogramvaren og deaktiver elektroder som skal utelukkes av laseren på det virtuelle kartet på høyre side av programvarevinduet.For å starte laseren, bruk Alt-museklikk, og velg senterelektroden til denne brønnen. Dette initierer laseren for å åpne cellene på hver elektrode av denne brønnen automatisk, gjenta for hver brønn for å åpne alle tidligere aktiverte elektroder i denne valgte brønnen. Løs opp millimolær konsentrasjon av Nifedipin E-40 31, og Dofetilide i DMSO først, og deretter i komplett medium til 10 ganger ønsket konsentrasjon.Overskrid aldri en endelig DMSO-konsentrasjon på 0,1 % i brønnen. Registrer grunnlinjeaktiviteten i 60 sekunder. Start den laserinduserte perasjonen som vist tidligere, noe som resulterer i en transformasjon av FPS til liAP-er.Påfør alle stoffene som enkeltkonsentrasjon per brønn. Fjern 20 mikroliter og 100 mikroliter medium per brønn fra henholdsvis seks brønner og enkeltbrønner MEA. Tilsett 20 mikroliter eller 100 mikroliter av legemiddelbeholdningsløsningen som skal måles til brønnen.Avhengig av MEA-type, og forsiktig pipette opp og ned to til tre ganger. La forbindelsene vaske inn i 300 sekunder. I løpet av denne tiden kan liAP-formen forvandle seg til FP-formen.Igjen, indusert laser indusert perasjon og registrere mulige sammensatte induserte defekter på liAP i ytterligere 60 sekunder. Tilsetningen av nifedipin reduserte platåfasen av liAP-ene på en konsentrasjonsavhengig måte, og forkortet dermed hele liAP. Denne forkortelsen var sammenlignbar med feltpotensialene til kardiomyocytter fra umanipulerte elektroder.E-40 31 hemmet repolariseringen av relevante KV ett punkt 11 kaliumkanaler og førte til arytmisk oppførsel av kardiomyocytter ved økte konsentrasjoner. E-40 31 økte også liAP-varigheten på en konsentrasjonsavhengig måte. På slutten av liAP ble det observert små positive spenningsavbøyninger ved 0,1 mikromolar som ble mer fremtredende med høyere konsentrasjoner, noe som indikerer en forbigående ny depolarisering kalt EAD.Ved den høyeste konsentrasjonen på 0,1 mikromolar eskalerte disse EAD-ene over tid til ektopiske beats. Som er for tidlige handlingspotensialer. EAD og ektopiske beats er nøkkelindikatorer for proarytmisk aktivitet.Og til slutt resulterer den elektriske aktiviteten i arytmisk juling. Konsentrasjonsresponsrelasjonene korrelerte med FPs og liAP-opptak. Videre, i nærvær av dofetilid, viste både FP og liAP varigheter på omtrent to sekunder i samme brønn, FP-bølgeformen presenterte regelmessige repolariseringsavbøyninger.Mens i liAP EAD's er detekterbare. Det er viktig å justere fokuset før hvert melomen, da et ufokusert mikroskopbilde kan påvirke åpningen av cellene. Tiltakspotensialet iverksettes også kort tid etter at opterperasjon skal brukes til analyse.Denne teknikken er mer følsom når det gjelder å oppdage tidligere arytmiske effekter sammenlignet med standard MEA, noe som muliggjør mer presis påvisning av uønskede sammensatte effekter.

Research

JoVE Journal

Medicine

Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements

Femoral arterielle og venøse Kateterisering for blodprøvetaking, Drug Administration og bevisst blodtrykk og hjertefrekvens målinger

In multiple fields of study, access to the circulatory system in laboratory studies is necessary. Pharmacological studies in rats using chronically ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

En laser-indusert Mouse Modell av kronisk okulær hypertensjon å karakterisere Visuelle defekter

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolasjon og Funksjonell karakterisering av menneskelig Ventrikulær Cardiomyocytes fra Fresh Kirurgiske Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

Påvisning av sykdomsassosierte α-synuclein med utvidet ELISA i hjernen hos transgene mus som overuttrykker humant A53T Mutert α-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

En musemodell for Laser-indusert Koroidal neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Kirurgisk opplæring for implantering av Neocortical Microelectrode matriser med formaldehyd-fast menneskelige Cadaver modell

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolasjon og dyrking av voksen rotte Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Contractility målinger av menneskelig livmor glatt muskel Aid narkotika utvikling

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Microelectrode Impalement metode for å Record membran potensial fra en Kanylert Middle cerebral arterie

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

Direkte legemiddellevering til nyre via nyrearterien

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...