Name: laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Foresee Biosystems за кредитование системы IntraCell во время исследований. Они также хотели бы поблагодарить Hae In Chang за техническую помощь. Эта работа получила финансирование от исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 964518 (ToxFree), от программы Европейского инновационного совета ЕС Horizon Europe, проекта SiMulTox (грантовое соглашение No 101057769) и от Государственного министерства Баден-Вюртемберга по экономическим вопросам, труду и туризму.

1. Препарат кардиомиоцитов на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Кардиомиоциты iCell2 (называемые индуцированными кардиомиоцитами, полученными из плюрипотентных стволовых клеток [iPSCs]) были получены в соответствии с протоколом, предоставленным поставщиком. Краткое изложение протокола будет кратко изложено в следующем разделе.
<ol><li>Оттаивание покрытия и среды для технического обслуживания при 4 °C в течение 24 ч перед использованием.</li>
	<li>Получают фибронектиновое покрытие путем растворения стерильного фибронектина в стерильной воде в концентрации 1 мг/мл. Заморозьте хранить этот запас в аликвотах (например, 25 мкл на аликвоту). Разбавить аликвотированный раствор 1:20 в стерильном сбалансированном солевом растворе Дульбекко (dPBS).</li>
	<li>Покрывайте электродные поля ранее автоклавированных MEA под ламинарным проточным капотом, по каплям в стерильных условиях фибронектином с использованием пипетки 10 мкл. Для этого опустите 5 мкл раствора фибронектина на электродные поля и наблюдайте за образованием капли поверх области электрода. Убедитесь, что вы не прикасаетесь к чувствительным электродам. ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильных условий переложите чип MEA в стерильную чашку Петри, прежде чем извлекать его из ламинарной вытяжки.</li>
	<li>Инкубировать покрытые МЭС в течение 1 ч при 37°С предпочтительно в инкубаторе.</li>
	<li>Разморозьте криовиал, содержащий кардиомиоциты, на водяной бане при температуре примерно 37 °C в течение 2 минут, пока не останется только немного кристалла льда. Аккуратно переложите клеточный раствор в пробирку объемом 50 мл.</li>
	<li>Добавьте 1 мл галь покрытой среды к пустой криовиальной. Перенесите раствор по каплям в течение 90 с в трубку объемом 50 мл, чтобы уменьшить осмотический шок. Осторожно добавьте в трубку дополнительные 8 мл галь покрытой среды.</li>
	<li>Тщательно перемешайте клеточную суспензию, используя пипетку объемом 10 мл. Рассчитайте общее количество жизнеспособных клеток с помощью автоматизированной флуоресцентной цитометрии. Номер должен быть близок к номеру в техническом описании, предоставленном заводом-изготовителем.</li>
	<li>Раскрутите клеточный раствор вниз в течение 3 мин при 200 х г при комнатной температуре. Удалите супернатант аспирацией с помощью стеклянной пипетки, прикрепленной к насосной системе. Отрегулируйте количество клеток от 6 000 до 15 000 жизнеспособных клеток/мкл. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек обычно находится в диапазоне, указанном выше, но может варьироваться в зависимости от соответствующего поставщика.</li>
	<li>Удалите раствор покрытия, нанесенный на этапе 1.3, из области электрода MEA с помощью пипетки объемом 10 мкл непосредственно перед посевом клеток. Засейте клетки сразу после удаления, чтобы избежать высыхания покрытия. Для этого засейте ячейки по каплям при 4 мкл как для 6-луночных MEA, так и для 1-луночных MEA на электродные поля таким же образом, как это делается с покрытием.</li>
	<li>Дайте ячейкам прилипнуть в течение 1 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 перед заполнением скважин стерильной гальванической средой, нагретой примерно до 37 °C при 200 мкл для 6-луночного МЭА и 1 мл для одной скважины MEA под ламинарной вытяжкой.</li>
	<li>Выполните полную смену среды через 48 ч после нанесения покрытия под ламинарным вытяжным кожухом. Для этого удалите гальваническую среду аспирацией с помощью стеклянной пипетки, прикрепленной к насосной системе. Затем добавьте в скважины 200 мкл стерильной поддерживающей среды, нагретой до 37 °C.</li>
	<li>Выполняйте полные изменения среды через день.</li>
	<li>Начинают измерять клетки через 5-8 дней после оттаивания. Выполните полную смену среды за 2 часа до начала экспериментов.</li>
</ol>2. Записи MEA
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство, используемое для преобразования сигнала FP в liAP, состоит из вертикального микроскопа и лазера 1064 нм.
<ol><li>Поместите систему MEA поверх устройства с держателем микросхемы MEA, центрированным над отверстием объектива. Расположите MEA так, чтобы объектив находился непосредственно под отверстием системы MEA, чтобы лазер мог фокусироваться на электродах.</li>
	<li>Перенесите чип MEA с культивируемыми клетками из инкубатора в установку MEA за 15 минут до записи, что позволит клеткам восстановиться после механического возмущения.</li>
	<li>Тщательно очистите контактные прокладки и штифты, используя изопропанол и ватный тампон, чтобы снизить уровень шума. Осторожно поместите MEA в MEA-установку. Расположите микросхему MEA с логотипом внизу с левой верхней стороны (6-луночный MEA) или с опорным электродом слева (однолуночный MEA).</li>
	<li>Установите нагрев, интегрированный в систему MEA, на 38 °C. Поместите небольшую камеру поверх чипа MEA, чтобы постоянно перфузировать клетки увлажненным карбогеном (5% CO2 и 95% O2), чтобы воссоздать условия инкубатора и предотвратить испарение.</li>
	<li>Закройте крышку устройства. Встроенный предохранительный выключатель позволяет активировать лазер только в том случае, если крышка закрыта над микросхемой MEA. Установите системный фильтр MEA с помощью программы конфигурации MEA на частоту 0,1 Гц или менее высоких частот и 3 500 Гц нижних частот.</li>
	<li>Используйте программное обеспечение MC_Rack (программное обеспечение для записи) или любое альтернативное программное обеспечение для записи. Отрегулируйте входной диапазон в соответствии с вашими потребностями, гарантируя, что сигнал не насыщает усилитель и частоту дискретизации (например, 20 кГц). Используйте функцию долгосрочного отображения программного обеспечения для проверки записи.</li>
</ol>3. Лазерно-индуцированная порация клеток
<ol><li>После вставки микросхемы MEA в настройку MEA и настройки программного обеспечения инициализируйте лазерную механику с помощью программного обеспечения FB Alps (программное обеспечение инициализации).</li>
	<li>Во-первых, нажмите на кнопку Инициализация . В конце инициализации виртуальная лазерная точка будет находиться в скважине D для 6-луночного МЭА и в левом нижнем углу для однолуночной МЭА соответственно.</li>
	<li>Переместите виртуальную лазерную точку с помощью Ctrl + щелчка мыши в середину электрода D5 и отрегулируйте фокус. Отрегулируйте фокус с помощью Ctrl + прокрутка с помощью колесика мыши.</li>
	<li>Нажмите кнопку Set P1. Виртуальная лазерная точка автоматически перейдет в скважину F. Повторите процесс с электродом F5 и выберите Set P2.</li>
	<li>После этой процедуры лазерная точка переместится в скважину B. Повторите тот же процесс с электродом B5 и нажмите Set P3 в программном обеспечении. Теперь система выровнена.</li>
	<li>Отрегулируйте мощность лазера и время обработки в соответствии с потребностями ваших клеток. Здесь было использовано 40% мощности и 25% технологического времени.</li>
	<li>Чтобы включить лазер, нажмите кнопку Laser Off , которая затем появится как laser on. Переключитесь на программное обеспечение для записи, выберите имя файла и нажмите кнопку Red Recording , а затем кнопку «Воспроизвести » в верхней части окна, чтобы записать измерение.</li>
	<li>Запишите базовую линию в 60 с перед открытием ячеек с помощью лазера. Вернитесь к программному обеспечению инициализации.</li>
	<li>Деактивируйте электроды, которые будут исключены лазером на виртуальной карте справа с помощью Ctrl + щелчка мышью. Выберите интересующие электроды, активировав их в представлении массива в правой части окна программного обеспечения.</li>
	<li>Чтобы запустить лазер, используйте Alt + щелчок мышью и выберите центральный электрод этой скважины. Это инициирует лазер для автоматического открытия ячеек на каждом электроде этой скважины. Повторите для каждой лунки. Затем лазер автоматически откроет все ранее активированные электроды выбранной скважины.</li>
</ol>4. Обращение с наркотиками и их применение
<ol><li>Подготовьте все вещества, которые будут использоваться для тестов на наркотики, заново в день измерений. Убедитесь, что конечная концентрация применения в среде в 10 раз выше, чтобы сделать разбавление 1:10 в скважинах.</li>
	<li>Растворяют нифедипин, Е4031 и дофетилид сначала в ДМСО в концентрации мМ, а затем далее в среде до 10x желаемой концентрации. Никогда не превышайте конечную концентрацию ДМСО 0,1% в скважине.</li>
	<li>Запишите базовую активность за 60 с. Запустите лазерно-индуцированную порацию, как описано на этапе 3 протокола, в результате чего FP превращается в форму liAP.</li>
	<li>Применяют все препараты в разовой концентрации на лунку. Удалите 20 мкл среды на скважину для 6-луночных МЭА и 100 мкл для МПС с одной скважиной, соответственно. Добавьте 20 мкл или 100 мкл, в зависимости от типа МЭА, исходного раствора препарата, подлежащего измерению, в лунку и аккуратно пипетку вверх и вниз 2-3 раза. Выполните, по крайней мере, три репликации каждого препарата и концентрации для достижения статистической значимости.</li>
	<li>Дайте соединениям промыться в течение 300 с. За это время форма liAP может превратиться обратно в форму FP. Опять же, индуцируйте порирование, индуцированное лазером, и регистрируйте возможные эффекты, индуцированные соединениями, на liAP в течение дополнительных 60 с.</li>
</ol>5. Экспорт данных
<ol><li>Выберите соответствующие электроды, воспроизведя запись в программном обеспечении для записи. Используйте MC_DataTool для конвертирования файлов MC_Rack в файлы .txt ASCII.</li>
	<li>Нажмите на Файл > Открыть MCD > Выберите файл MC_Rack. Нажмите на кнопку txt (синий текст).</li>
	<li>Выберите электрод. Выбранный электрод будет показан в списке с правой стороны.</li>
	<li>Нажмите кнопку Обзор , чтобы выбрать папку и изменить имя нового файла .txt. Нажмите кнопку Сохранить.</li>
	<li>Снимите флажок экспортируемого электрода и выберите следующий электрод для экспорта. Повторите процедуру для всех интересующих электродов.</li>
</ol>6. Обработка данных и статистический анализ
<ol><li>Импорт преобразованных двоичных трассировок в R19. Визуализируйте/анализируйте данные с помощью пользовательских скриптов, содержащих следующие пакеты: dplyr, tidyr и ggplot2 20,21,22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+arrhythmias.">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li><li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hERG+(KCNH2+or+Kv11.1)+K++channels:+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk.">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li><li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development.">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li><li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmia.">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).</li><li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+arrhythmias:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li><li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICE+models:+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes.">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100 (2013).</li><li>Rampe, D., Roy, M. -. L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+(Propulsid):+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG.">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li><li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes.">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li><li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents.">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).</li><li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart.">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li><li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-speed,+bright,+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity.">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Kovacs, G. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+sensors+with+living+cellular+components.">Electronic sensors with living cellular components.</a> Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).</li><li>Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+field+potentials+measured+on+a+multi+electrode+array+in+pharmacological+toxicity+screening+on+primary+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).</li><li>Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rapid+delayed+rectifier+K++current+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes.">Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.</a> Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).</li><li>Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+test+in+isolated+female+rabbit+heart+reliably+identifies+action+potential+duration+prolongation+and+proarrhythmic+drugs:+importance+of+triangulation,+reverse+use+dependence,+and+instability.">Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).</li><li>Dipalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+action+potential+recordings+from+cardiomyocytes+by+ultrafast+pulsed+laser+irradiation+of+fuzzy+graphene+microelectrodes.">Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2021)</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2022)</li><li>. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2021)</li><li>Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+calcium+channel+blockers.">Discovery and development of calcium channel blockers.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).</li><li>Vater, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic+acid+dimethyl+ester+(Nifedipine,+BAY+a+1040).">Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040).</a> Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).</li><li>Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+E-4031-sensitive+potassium+current+in+rat+carotid+chemoreceptor+cells.">Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Fendyur, A., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+on-chip,+in-cell+recordings+from+cultured+cardiomyocytes+by+arrays+of+gold+mushroom-shaped+microelectrodes.">Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes.</a> Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).</li><li>Hayes, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+action+potential+measurements+from+intact+cardiac+monolayers+with+multiwell+microelectrode+array+technology.">Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Этот инновационный метод демонстрирует новый способ исследования in vitro фармакологической модуляции потенциала сердечного действия при применении кардиоактивных фармакологических инструментальных соединений.
Классические записи MEA позволяют записывать FP, которые являются производными сердечного AP14. Эта косвенная запись запутывает временной ход де- и реполяризации и тем самым устраняет существенные характеристики АП. Кроме того, хотя трансклеточное изменение напряжения точки доступа обычно достигает значений приблизительно 100 мВ, общая амплитуда FP остается сравнительно низкой, с пиковыми амплитудами между несколькими 100 мкВ и низкими однозначными значениями мВ. Из-за принципа записи фаза реполяризации невелика; во многих случаях он просто обнаруживается и часто имеет нечеткую форму, что затрудняет определение конца FP. Открытие клеточной мембраны позволяет получить доступ к внутриклеточному напряжению, тем самым раскрывая временной ход сердечной АП. Существует множество преимуществ этого метода записи по сравнению с записями FP. Во-первых, амплитуда сигнала более заметна, обеспечивая превосходное отношение сигнал/шум. Во-вторых, форма сигнала приводит к лучшему обнаружению реполяризации. В-третьих, форма фазы реполяризации способствует пониманию способа действия исследуемого соединения, обеспечиваемого крутизной сигнала релаксации. И, наконец, этот метод обеспечивает улучшенную чувствительность для обнаружения критических побочных эффектов лекарств, что демонстрируется примером записи, показанным на рисунке 6 для возникновения EAD в liAP, но не в FP.
Пока существует два способа получения доступа к внутриклеточной АП. Первый достигается электропорацией26,27. Здесь короткие и сильные импульсы напряжения, подаваемые через регистрирующие электроды, могут открыть клеточную мембрану28. Второй возможностью является открытие мембраны с помощью лазерного импульса, использующего физическое явление, называемое поверхностным плазмонным резонансом, как показано здесь. Одним из преимуществ по сравнению с электропорацией является повышенная вероятность последовательных открытий. Из-за высокосфокусированного лазерного пятна (1-3 мкм) этот эффект очень локально ограничен интересующим электродом. Интересно, что инициация liAP не изменила распространение сигнала культивируемого синциция. Это указывает на то, что, хотя целостность клеток повреждена, кардиомиоциты, по-видимому, не деполяризуются через отверстие в мембране.
У этого метода есть ограничения. Как и в случае с электропорацией, отверстие мембраны в большинстве случаев не длится в течение всего экспериментального курса. Минимальные настройки мощности и длительности лазерного импульса, необходимые для стабильного открытия конкретного типа интересующей ячейки, должны быть определены независимо до начала экспериментов. Мы обнаружили (не показали), что параметры резко различаются между различными типами клеток (в нашем случае несколько hiPS-производных и первичных кардиомиоцитов). Это позволяет избежать ненужной нагрузки на клетки во время эксперимента с составным тестом и приводит к более надежным и воспроизводимым данным. Крайне важно отрегулировать ось Z, чтобы обеспечить четкую фокусировку на ячейках и электродах. Несфокусированное изображение камеры дает лазерное пятно, расположенное на неоптимальном уровне, что потенциально приводит к невозможности открыть клеточную мембрану. Даже при наиболее скорректированных параметрах эффект liAP является преходящим, а амплитуда со временем уменьшается. Кроме того, доступ к внутриклеточному пространству клеток варьируется между индукциями liAP, как в последовательных отверстиях на одном и том же электроде, так и между электродами. Это приводит к высокой изменчивости амплитуды liAP. Причина еще не до конца понятна. Возможные объяснения включают механические проблемы, такие как дрейф лазерного фокуса или другая субклеточная локализация отверстия мембраны. Это усложняет анализ амплитудных эффектов исследуемых соединений на данный момент времени. Кроме того, регистрация электрической активности системой MEA требует фильтрации высоких частот для компенсации неизбежного дрейфа исходной линии. Хотя в системе, используемой здесь, эта фильтрация была установлена на 0,1 Гц (самая низкая настройка фильтра, доступная для этой системы), эффекты фильтрации во время фазы плато все еще были видны, что привело к медленной тенденции отклонения напряжения к базовой линии во время фазы плато сердечной точки доступа. Это особенно проблематично с широко длинными базовыми AP, такими как кардиомиоциты iCELL2 , полученные из iPSC, используемые здесь, которые уже генерируют AP >700 мс в контролируемых условиях. Использование систем с более низкой фильтрацией может лучше сохранить форму точки доступа и обеспечить еще лучший доступ к временному ходу фазы реполяризации.

Электрический вклад сердцебиения является результатом сложного и точно синхронизированного взаимодействия многих сердечных каналов и транспортеров, а также точно настроенного распространения электрических сигналов через миокард1. Изменение этих тесно скоординированных механизмов (например, использование лекарств) может привести к тяжелым последствиям для функции сердца (т.е. угрожающей жизни аритмии)2,3. Аритмии определяются как нерегулярное сердцебиение, которое изменяет нормальный ритм сердца, что может иметь опасные для жизни последствия. Они могут быть вызваны либо нарушением инициации волны сердечного возбуждения, либо аномальным распространением сердечного возбуждения4, что, в свою очередь, приводит к дисфункции насосного механизма сердца.
Многие высокоактивные кандидаты на лекарства должны быть исключены из дальнейших исследований на ранней стадии разработки лекарств из-за их (про-) аритмического потенциала 2,3. Они модулируют ключевые сердечные каналы (например, канал гена, связанный с человеческим эфиром и уходом [hERG]), которые отвечают за формирование и прекращение нормального потенциала сердечного действия, а также последующее распространение сигнала5.
Фармацевтические компании регулярно используют измерения зажимов пластырей или микроэлектродные массивы (MEA) для изучения потенциальных кардиотоксических нецелевых эффектов, индуцированных кандидатами на лекарства. Патч-зажимные записи позволяют расшифровать воздействие веществ на сердечные ионные каналы и проанализировать трансклеточный потенциал сердечного действия с высоким пространственно-временным разрешением 6,7. Однако к недостаткам данной методики можно отнести низкую пропускную способность при ручном патч-зажиме и ограниченную применимость автоматики из-за зависимости этого метода от ячеек в суспензии. Кроме того, хронические эффекты не могут быть исследованы из-за инвазивности метода. Наконец, обычно одновременно изучаются только одиночные клетки, а не весь сердечный синцитий, что делает невозможным обращение к информации о распространении сигнала.
Чувствительные к напряжению красители ценны для неинвазивного исследования потенциалов сердечного действия и медикаментозных аритмий8. Они позволяют исследовать как одноклеточную, так и синцитиевую активность. Недостатками этого метода являются цитотоксические эффекты либо красителей как таковых, либо продукта реакции при освещении. Они используются для острых экспериментов и вряд ли применимы для долгосрочных исследований 9,10,11. Чувствительные к напряжению белки в качестве альтернативы достигли значительного прогресса за последние пару лет с точки зрения удобства использования и чувствительности, но требуют генетической модификации интересующих клеток и не имеют высокого временного разрешения по сравнению с электрофизиологическими методами12.
Информация из последней инициативы CiPA13 гласит, что MEA широко используются в скринингах сердечной безопасности в качестве альтернативного электрофизиологического подхода, поскольку они представляют собой мощный и хорошо зарекомендовавший себя инструмент для исследования сердечной функции и фармакологии безопасности. Кардиомиоциты культивируются в виде синцития непосредственно поверх чипов, а внеклеточные полевые потенциалы (FP) регистрируются неинвазивно через субстрат-интегрированные микроэлектроды. Этот принцип записи позволяет проводить скрининги с повышенной пропускной способностью в течение нескольких дней, что делает их пригодными для фармацевтических исследований хронических эффектов. Полученная форма сигнала FP является производной от внутриклеточного AP14. Такие параметры, как частота биения, амплитуда начальной части FP и длительность FP, легко доступны15. Другие существенные критерии, такие как дифференциация между удлинением и триангуляцией ФП (важный маркер проаритмии16,17), недоступны из-за эффекта фильтрации переменного тока метода. Кроме того, обнаружение других небольших проаритмических событий, таких как ранняя и отсроченная последеполяризация (EAD и DAD, соответственно), часто легко упускается из виду из-за их небольшой амплитуды.
Здесь описан способ получения доступа к внутриклеточному мембранному потенциалу путем вскрытия мембраны кардиомиоцитов. Устройство IntraCell (далее именуемое внутриклеточным регистрирующим устройством) позволяет повторно открывать мембраны кардиомиоцитов, культивируемых поверх электродов MEA с использованием высокосфокусированного наносекундного лазерного луча с помощью определенного физического явления (поверхностный плазмонный резонанс)18. В результате запись переходит из обычного ФП во внутриклеточную АП (лазероиндуцированная АП, лиАП). Протокол показывает, как это позволяет получить доступ к кинетическим аспектам формы сигнала, которые не могут быть легко захвачены путем анализа FP. Этот метод представляет собой мост между традиционным внутриклеточным зажимом и записями MEA. Таким образом, технология является мощным расширением современных методов оценки сердечной безопасности.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>7600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>20-139 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>D-100</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>12037539</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>E-500</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB Alps version 0.5.005</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>11051407001</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell cardiomyocytes</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CN09.1</td>
			<td>For cleaning of MEA contact pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>#M1003</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Data Tool</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Rack</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>MEA recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 - 2x60 - system</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890485</td>
			<td>For MEA-recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>N7634 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>M1001</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergazyme</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>1304-1</td>
			<td>cleaning of MEAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology

Опасной для жизни медикаментозной сердечной аритмии часто предшествуют длительные потенциалы сердечного действия (АП), обычно сопровождающиеся небольшими колебаниями проаритмического мембранного потенциала. Форма и временной ход реполяризующей фракции АП могут иметь решающее значение для наличия или отсутствия аритмии.
Микроэлектродные массивы (MEA) обеспечивают легкий доступ к эффектам кардиотоксических соединений через потенциалы внеклеточного поля (FP). Несмотря на то, что форма сигнала FP является мощным и хорошо зарекомендовавшим себя инструментом в исследованиях и фармакологии сердечной безопасности, она не позволяет вывести первоначальную форму AP из-за принципа внеклеточной записи и результирующей внутренней фильтрации переменного тока (AC).
Новое устройство, описанное здесь, может многократно открывать мембрану кардиомиоцитов, культивируемых поверх электродов MEA в нескольких точках времени культивирования, используя высокосфокусированный наносекундный лазерный луч. Лазерная порация приводит к преобразованию электрофизиологического сигнала из FP во внутриклеточные точки доступа (лазерно-индуцированная ТОЧКА доступа, liAP) и позволяет регистрировать отклонения трансклеточного напряжения. Этот внутриклеточный доступ позволяет лучше описать форму АП и лучше и более чувствительно классифицировать проаритмические потенциалы, чем обычные записи MEA. Эта система является революционным расширением существующих электрофизиологических методов, позволяющим точно оценивать кардиотоксический эффект со всеми преимуществами записей на основе MEA (легкие, острые и хронические эксперименты, анализ распространения сигнала и т. Д.).

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

Комбинация лазерной порации и микроэлектродных массивов (MEA) позволяет регистрировать потенциал действия культивируемых первичных и производных из стволовых клеток кардиомиоцитов. Форма сигнала обеспечивает превосходное понимание способа действия тестируемых соединений, чем стандартные записи. Он связывает патч-зажим и считывание MEA для дальнейшей оптимизации исследований безопасности кардио в будущем.

Лазерно-индуцированные измерения потенциала действия кардиомиоцитов на микроэлектродных массивах для повышения предсказуемости фармакологии безопасности

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

Этот метод позволяет регистрировать внутриклеточные подобные потенциалы действия на традиционных MEA'S, тем самым позволяя лучше описать форму AP и более чувствительную классификацию проаритмических потенциалов. По сравнению с типичными записями потенциала поля внутриклеточные фактические потенциальные формы обеспечивают более глубокое понимание точной авторизации нижележащих ионных каналов. При применении к кардиомиоцитам, полученным от клинических пациентов с помощью технологии стволовых клеток, метод может способствовать причинно-следственной диагностике и персонализации C R P и сердечных заболеваний, таких как аритмии Наш техник Карин Гебхардт продемонстрирует культивирование кардиомиоцитов.Чтобы начать покрытие электродных полей ранее автоклавных МЭА, Dropwise фибронектином использует пипетку объемом 10 микролитров под ламинарной вытяжкой. Чтобы уменьшить осмотический шок, переведите по каплям раствор по каплям в течение 90 секунд в 50-миллилитровую трубку, содержащую отягощенные кардиомиоциты. Аккуратно добавьте восемь миллилитров гальванической среды в трубку и тщательно перемешайте клеточную суспензию.Используя 10-миллилитровую пипетку, удалите супернатант, убедившись, что гранула не выбросит и отрегулируйте номер ячейки до конечной концентрации. Перед посадкой ячейки удалите нанесенный раствор покрытия из области электрода MEA с помощью пипетки 10 микролитров. Чтобы избежать высыхания покрытия, засейте ячейки немедленно, добавив четыре микролитра ячеек по каплям на электродные поля для обоих, шести скважин MEA и одной лунки M E A. Теперь позвольте ячейкам прилипать к скважинам в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Под ламинарный проточный капот добавьте 200 микролитров и один миллилитр стерильной гальванической среды, нагретой до 37 градусов Цельсия для шести скважин MEA и одной скважины MEA соответственно. Для записи MEA поместите систему MEA поверх устройства с держателем микросхемы MEA, центрированным над отверстием объектива. Затем позвольте лазеру сфокусироваться на электродах, расположив установку MEA таким образом, чтобы цель находилась непосредственно под отверстием системы MEA.Чтобы позволить клеткам восстановиться после механического возмущения, перенесите чип MEA с культивируемыми клетками из инкубатора в установку MEA за 15 минут до записи. Затем тщательно очистите контактные прокладки и штифты, используя мазок изопропанола, чтобы снизить уровень шума. Осторожно поместите MEA в установку MEA и расположите шестилуночный микросхему MEA с серийным номером, видимым с правой стороны, или микросхему MEA с однолуночным MEA-чипом с опорным электродом слева.Теперь установите интегрированную систему MEA на 38 градусов по Цельсию. Закройте крышку устройства, так как встроенный предохранительный выключатель позволяет активировать лазер только в том случае, если крышка закрыта над микросхемой MEA. С помощью программы конфигурирования MEA установите системный фильтр MEA высоких и нижних частот на 0,1 герц или менее и 3 500 герц соответственно.Используйте программное обеспечение стойки MC или любое альтернативное программное обеспечение для записи. Отрегулируйте входной диапазон в соответствии с экспериментом. Обеспечение того, чтобы сигнал не насыщал усилитель и частоту дискретизации.Используйте функцию долгосрочного отображения программного обеспечения для проверки записи. После вставки микросхемы MEA в настройку MEA и настройки программного обеспечения инициализируйте лазерную механику с помощью программного обеспечения FB ALP. Теперь нажмите на кнопку инициализации.В конце инициализации виртуальная лазерная точка будет находиться в скважине D для шести скважин MEA и в левом нижнем углу для одной скважины MEA соответственно. Затем с помощью клавиши управления щелчком мыши переместите виртуальную лазерную точку в середину D пяти электрода и отрегулируйте фокус, удерживая клавишу управления и прокручивая колесом мыши. Кроме того, можно использовать функцию автофокусировки.Нажмите кнопку набора P one, и виртуальная лазерная точка автоматически переместится в скважину F.Система теперь выровнена. Отрегулируйте мощность лазера и время обработки в соответствии с экспериментальными требованиями. Чтобы включить лазер, нажмите на кнопку выключения лазера, которая будет отображаться как лазер включен, Переключитесь на программное обеспечение для записи.Выберите имя файла и нажмите на красную кнопку записи, а затем кнопку воспроизведения в верхней части окна, чтобы записать измерение. Перед открытием ячеек лазером записывают базовую линию в течение 60 секунд. Вернитесь к программному обеспечению инициализации и деактивируйте электроды, которые будут исключены лазером на виртуальной карте в правой части окна программного обеспечения.Для запуска лазера используйте Alt щелчок мышью, и выберите центральный электрод этого колодца. Это инициирует лазер для автоматического открытия ячеек на каждом электроде этой скважины, повторите для каждой скважины, чтобы открыть все ранее активированные электроды этой выбранной скважины. Растворяют миллимолярную концентрацию нифедипина Е-40 31 и дофетилида сначала в ДМСО, а затем в полной среде до 10-кратной желаемой концентрации.Никогда не превышайте конечную концентрацию ДМСО 0,1% в скважине. Запишите базовую активность в течение 60 секунд. Запустите лазерную индуцированную перацию, как показано ранее, что приведет к преобразованию FPS в liAP.Применяют все препараты в разовой концентрации на лунку. Удалите 20 микролитров и 100 микролитров среды на скважину из шести скважин и одной скважины MEA соответственно. Добавьте 20 микролитров или 100 микролитров исходного раствора препарата для измерения в лунку.В зависимости от типа MEA и осторожно пипеткой вверх и вниз два-три раза. Дайте соединениям промыться в течение 300 секунд. За это время форма liAP может трансформироваться в форму FP.Опять же, индуцированная лазерно-индуцированная перация и запись возможных дефектов, индуцированных соединениями, на liAP в течение дополнительных 60 секунд. Добавление нифедипина уменьшало фазу плато liAP в зависимости от концентрации и, таким образом, укорачивало весь liAP. Это укорочение было сопоставимо с полевыми потенциалами кардиомиоцитов от неманипулированных электродов.Е-40 31 ингибировал реполяризацию соответствующих КВ в одной точке 11 калиевых каналов и приводил к аритмическому поведению кардиомиоцитов при повышенных концентрациях. Кроме того, E-40 31 увеличивал продолжительность liAP в зависимости от концентрации. В конце liAP наблюдались небольшие положительные отклонения напряжения на 0,1 микромоляра, которые стали более заметными с более высокими концентрациями, что указывает на переходную новую деполяризацию, называемую EAD.При самой высокой концентрации 0,1 микромоляра эти EAD со временем переросли в эктопические удары. Которые являются потенциалами преждевременного действия. EAD и эктопические удары являются ключевыми показателями проаритмической активности.И в конце концов, электрическая активность приводит к аритмическому биению. Отношения реакции концентрации коррелировали с записями FP и liAP. Кроме того, в присутствии дофетилида как FP, так и liAP отображали продолжительность примерно двух секунд в пределах одной и той же скважины, форма сигнала FP представляла регулярные отклонения реполяризации.В то время как в liAP EAD обнаруживаются. Важно настроить фокус перед каждым меломеном, так как изображение вне фокуса микроскопа может повлиять на открытие клеток. Кроме того, потенциал действия принимается вскоре после того, как оптэрперация должна быть использована для анализа.Этот метод более чувствителен при обнаружении предшествующих аритмических эффектов по сравнению со стандартным МЭА, что позволяет более точно выявлять неблагоприятные составные эффекты.

Research

JoVE Journal

Medicine

Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements

Бедренная артериального и венозного Катетеризация для забора крови, медикаментов и сознавая, кровяное давление и измерения пульса

In multiple fields of study, access to the circulatory system in laboratory studies is necessary. Pharmacological studies in rats using chronically ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Лазерное мышиной модели хронической гипертонией Глазные для характеристики визуальных дефектов

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

Выявление заболевания, связанного α-синуклеина-повышенной ELISA в мозге трансгенных мышей с гиперэкспрессией Human A53T Мутация α-синуклеина

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Модель мышь для лазерно-индуцированной неоваскуляризации хориоидеи

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Хирургической подготовки для имплантации кортикальное микроэлектродные массивов с использованием модели формальдегида Исправлена человеческий труп

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Изоляция и выращивания взрослых крыс кардиомиоцитов

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Сократительную способность измерения человеческого гладких мышц матки для разработки лекарственных средств помощи

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Метод микроэлектрода Impalement для записи Мембраны Потенциал из канналедированной средней мозговой артерии

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

Прямая доставка лекарств в почки через почечную артерию

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...