Name: laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Författarna vill tacka Foresee Biosystems för utlåningen av IntraCell-systemet under studierna. De vill också tacka Hae In Chang för tekniskt stöd. Detta arbete har fått finansiering från Europeiska unionens Horizon 2020: s forsknings- och innovationsprogram enligt bidragsavtalet nr 964518 (ToxFree), från EU: s Horizon Europe European Innovation Council Programme, projekt SiMulTox (bidragsavtal nr 101057769) och från statsministeriet i Baden-Wuerttemberg för ekonomiska frågor, arbete och turism.

1. Inducerad pluripotent stamcellsderiverad kardiomyocytberedning
OBS: iCell kardiomyocyter2 (kallad inducerad pluripotent stamcell [iPSCs] -härledda kardiomyocyter) framställdes enligt protokollet från leverantören. Protokollet sammanfattas kortfattat i följande avsnitt.
<ol><li>Tina pläterings- och underhållsmedium vid 4 °C i 24 timmar före användning.</li>
	<li>Bered fibronektinbeläggning genom att lösa upp sterilt fibronektin i sterilt vatten i en koncentration av 1 mg/ml. Frys lagra detta lager i alikvoter (t.ex. 25 μL per alikvot). Späd den aliciterade stamlösningen 1:20 i steril Dulbeccos balanserade saltlösning (dPBS).</li>
	<li>Täck elektrodfälten för de tidigare autoklaverade MEA: erna under den laminära flödeshuven, droppvis under sterila förhållanden med fibronektin med en 10 μL pipett. För detta, släpp 5 μL av fibronektinbeläggningslösningen på elektrodfälten och observera bildandet av en droppe ovanpå elektrodområdet. Se till att inte vidröra de känsliga elektroderna. OBS: För att upprätthålla sterila förhållanden, överför MEA-chipet till en steril petriskål innan du tar bort det från den laminära flödeshuven.</li>
	<li>Inkubera de belagda monoetanolaminerna i 1 timme vid 37 °C i en inkubator.</li>
	<li>Tina kryovialen som innehåller kardiomyocyterna i ett vattenbad vid cirka 37 °C i 2 minuter tills bara en liten iskristall finns kvar. Överför celllösningen försiktigt till ett 50 ml rör.</li>
	<li>Tillsätt 1 ml pläteringsmedium till den tomma kryovialen. Överför lösningen droppvis under en tidsperiod på 90 s till 50 ml röret för att minska den osmotiska chocken. Tillsätt försiktigt ytterligare 8 ml pläteringsmedium i röret.</li>
	<li>Blanda cellsuspensionen försiktigt med en 10 ml pipett. Beräkna det totala antalet livskraftiga celler med hjälp av automatiserad fluorescenscytometri. Numret ska ligga nära numret i databladet från tillverkaren.</li>
	<li>Snurra ner celllösningen i 3 minuter vid 200 x g vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten genom aspiration med en glaspipett fäst vid ett pumpsystem. Justera cellnumret mellan 6 000 och 15 000 viabla celler/μl. OBS: Antalet celler ligger vanligtvis i intervallet ovan men kan variera beroende på respektive leverantör.</li>
	<li>Ta bort beläggningslösningen som applicerades i steg 1.3 från MEA-elektrodområdet med en 10 μl-pipett direkt före cellsådd. Frö cellerna omedelbart efter avlägsnandet för att undvika torkning av beläggningen. För detta, frö cellerna droppvis vid 4 μL för både 6-brunns MEA och 1-brunns MEA på elektrodfälten på samma sätt som görs med beläggningen.</li>
	<li>Låt cellerna fästa i 1 timme i inkubatorn vid 37 °C och 5 %CO2 innan brunnarna fylls med det sterila pläteringsmediet uppvärmt till cirka 37 °C vid 200 μl för 6-brunns MEA och 1 ml för MEA med en enda brunn under den laminära flödeshuven.</li>
	<li>Utför en fullständig mediumbyte 48 timmar efter plätering under den laminära flödeshuven. För detta, ta bort pläteringsmediet genom aspiration med hjälp av en glaspipett fäst vid ett pumpsystem. Tillsätt sedan 200 μl sterilt underhållsmedium uppvärmt till 37 °C i brunnarna.</li>
	<li>Utför fullständiga medelstora förändringar varannan dag.</li>
	<li>Börja mäta cellerna 5-8 dagar efter upptining. Utför en fullständig mediumförändring 2 h innan experimenten påbörjas.</li>
</ol>2. MEA-inspelningar
OBS: Enheten som används för att omvandla FP-signalen till liAP består av ett upprätt mikroskop och en 1064 nm laser.
<ol><li>Placera MEA-systemet ovanpå enheten med MEA-chiphållaren centrerad över målhålet. Placera MEA-inställningen så att målet ligger direkt under hålet i MEA-systemet så att lasern kan fokusera på elektroderna.</li>
	<li>Överför MEA-chipet med de odlade cellerna från inkubatorn till MEA-installationen 15 minuter före inspelning, så att cellerna kan återhämta sig från den mekaniska störningen.</li>
	<li>Rengör kontaktdynorna och stiften försiktigt med isopropanol och en bomullspinne för att minska ljudnivån. Placera MEA försiktigt i MEA-installationen. Placera MEA-chipet med logotypen längst ner på den övre vänstra sidan (6-brunns MEA) eller med referenselektroden till vänster (MEA med en brunn).</li>
	<li>Ställ in den systemintegrerade MEA-uppvärmningen på 38 °C. Placera en liten kammare ovanpå MEA-chipet för att ständigt perfusera cellerna med fuktad karbogen (5% CO2 och 95%O2) för att återskapa inkubatorförhållanden och förhindra avdunstning.</li>
	<li>Stäng locket på enheten. Den integrerade säkerhetsbrytaren gör att lasern endast kan aktiveras om locket är stängt över MEA-chipet. Ställ in MEA-systemfiltret med MEA-konfigurationsprogrammet på 0,1 Hz eller mindre högpass och 3 500 Hz lågpass.</li>
	<li>Använd MC_Rack programvara (inspelningsprogramvara) eller någon alternativ programvara för inspelning. Justera ingångsområdet efter dina behov så att signalen inte mättar förstärkaren och samplingsfrekvensen (t.ex. 20 kHz). Använd programvarans långsiktiga visningsfunktion för att kontrollera inspelningen.</li>
</ol>3. Laserinducerad cellporation
<ol><li>Efter att ha satt in MEA-chipet i MEA-installationen och konfigurerat programvaran, initiera lasermekaniken med hjälp av FB Alps-programvaran (initialiseringsprogramvara).</li>
	<li>Klicka först på knappen Initialisering . I slutet av initialiseringen kommer den virtuella laserpunkten att vara i brunn D för en 6-brunns MEA respektive längst ner till vänster för en MEA med en brunn.</li>
	<li>Flytta den virtuella laserpunkten med Ctrl + musklick in i mitten av elektroden D5 och justera fokus. Justera fokus genom att Ctrl + rulla med mushjulet.</li>
	<li>Tryck på knappen Set P1. Den virtuella laserpunkten flyttas automatiskt in i brunnen F. Upprepa processen med elektroden F5 och välj Ställ in P2.</li>
	<li>Efter denna procedur kommer laserpunkten att flytta in i brunn B. Upprepa samma process med elektrod B5 och tryck på Set P3 i programvaran. Systemet är nu anpassat.</li>
	<li>Justera lasereffekten och processtiden efter dina cellers behov. Här användes 40% effekt och 25% processtid.</li>
	<li>För att aktivera lasern, klicka på Laser Off-knappen , som sedan visas som laser på. Byt till inspelningsprogramvaran, välj ett filnamn och klicka på Röd inspelning knappen följt av Spela knappen ovanpå fönstret för att spela in mätningen.</li>
	<li>Registrera en baslinje på 60 s innan du öppnar cellerna med lasern. Byt tillbaka till initieringsprogramvaran.</li>
	<li>Inaktivera elektroder som ska uteslutas av lasern på den virtuella kartan till höger med Ctrl + musklick. Välj elektroderna av intresse genom att aktivera dem på matrisrepresentationen till höger om programvarufönstret.</li>
	<li>För att starta lasern, använd Alt + musklick och välj mittelektroden för denna brunn. Detta initierar lasern för att automatiskt öppna cellerna på varje elektrod i denna brunn. Upprepa för varje brunn. Lasern öppnar sedan automatiskt alla tidigare aktiverade elektroder i den valda brunnen.</li>
</ol>4. Läkemedelshantering och applicering
<ol><li>Bered alla ämnen som ska användas för drogtester nyligen på mätdagen. Se till att den slutliga appliceringskoncentrationen är 10 gånger högre i medium för att göra en utspädning på 1:10 i brunnarna.</li>
	<li>Lös upp Nifedipin, E4031 och Dofetilide först i DMSO i mM-koncentration och sedan vidare i medium till 10x av önskad koncentration. Överskrid aldrig en slutlig DMSO-koncentration på 0,1% i brunnen.</li>
	<li>Registrera baslinjeaktiviteten för 60 s. Starta den laserinducerade porationen enligt beskrivningen i steg 3 i protokollet, vilket resulterar i en omvandling av FP till liAP-form.</li>
	<li>Applicera alla droger som enkelkoncentration-per-brunn. Ta bort 20 μL medium per brunn för 6-brunns MEA respektive 100 μL för MEA med en brunn. Tillsätt 20 μL eller 100 μl, beroende på MEA-typ, av stamlösningen av läkemedlet som ska mätas till brunnen och pipettera försiktigt upp och ner 2-3 gånger. Utför minst tre replikationer av varje läkemedel och koncentration för att uppnå statistisk relevans.</li>
	<li>Låt föreningarna tvättas i 300 s. Under denna tid kan liAP-formen omvandlas tillbaka till FP-form. Återigen, inducera laserinducerad poration och registrera möjliga föreningsinducerade effekter på liAP för ytterligare 60 s.</li>
</ol>5. Export av data
<ol><li>Välj relevanta elektroder genom att spela upp inspelningen i inspelningsprogramvaran. Använd MC_DataTool för att konvertera MC_Rack filer till ASCII-.txt filer.</li>
	<li>Klicka på Arkiv > Öppna MCD > Välj en MC_Rack fil. Klicka på txt-knappen (blå text).</li>
	<li>Välj en elektrod. Den valda elektroden visas i listan på höger sida.</li>
	<li>Klicka på Bläddra för att välja mappen och ändra namnet på den nya .txt filen. Klicka på Spara.</li>
	<li>Avmarkera den exporterade elektroden och välj nästa elektrod som ska exporteras. Upprepa proceduren för alla elektroder av intresse.</li>
</ol>6. Datahantering och statistisk analys
<ol><li>Importera konverterade binära spårningar till R19. Visualisera/analysera data med hjälp av skräddarsydda skript som innehåller följande paket: dplyr, tidyr och ggplot220,21,22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+arrhythmias.">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li><li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hERG+(KCNH2+or+Kv11.1)+K++channels:+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk.">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li><li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development.">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li><li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmia.">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).</li><li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+arrhythmias:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li><li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICE+models:+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes.">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100 (2013).</li><li>Rampe, D., Roy, M. -. L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+(Propulsid):+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG.">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li><li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes.">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li><li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents.">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).</li><li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart.">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li><li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-speed,+bright,+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity.">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Kovacs, G. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+sensors+with+living+cellular+components.">Electronic sensors with living cellular components.</a> Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).</li><li>Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+field+potentials+measured+on+a+multi+electrode+array+in+pharmacological+toxicity+screening+on+primary+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).</li><li>Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rapid+delayed+rectifier+K++current+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes.">Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.</a> Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).</li><li>Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+test+in+isolated+female+rabbit+heart+reliably+identifies+action+potential+duration+prolongation+and+proarrhythmic+drugs:+importance+of+triangulation,+reverse+use+dependence,+and+instability.">Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).</li><li>Dipalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+action+potential+recordings+from+cardiomyocytes+by+ultrafast+pulsed+laser+irradiation+of+fuzzy+graphene+microelectrodes.">Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2021)</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2022)</li><li>. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2021)</li><li>Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+calcium+channel+blockers.">Discovery and development of calcium channel blockers.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).</li><li>Vater, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic+acid+dimethyl+ester+(Nifedipine,+BAY+a+1040).">Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040).</a> Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).</li><li>Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+E-4031-sensitive+potassium+current+in+rat+carotid+chemoreceptor+cells.">Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Fendyur, A., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+on-chip,+in-cell+recordings+from+cultured+cardiomyocytes+by+arrays+of+gold+mushroom-shaped+microelectrodes.">Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes.</a> Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).</li><li>Hayes, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+action+potential+measurements+from+intact+cardiac+monolayers+with+multiwell+microelectrode+array+technology.">Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Denna innovativa metod visar ett nytt sätt att undersöka in vitro den farmakologiska moduleringen av hjärtåtgärdspotentialen under appliceringen av kardioaktiva farmakologiska verktygsföreningar.
Klassiska MEA-inspelningar tillåter FP-inspelningar, som är derivatet av hjärt-AP14. Denna indirekta registrering konvolverar tidsförloppet för de- och repolariseringen och eliminerar därmed väsentliga egenskaper hos AP. Dessutom, även om den transcellulära spänningsförändringen för en AP vanligtvis når värden på cirka 100 mV, förblir den totala FP-amplituden jämförelsevis låg, med toppamplituder mellan flera 100 μV och låga ensiffriga mV-värden. På grund av inspelningsprincipen är repolariseringsfasen liten; I många fall är den endast detekterbar och ofta av oklar form, vilket gör det svårt att definiera slutet på ramprogrammet. Öppningen av cellmembranet gör att vi kan få tillgång till den intracellulära spänningen och därigenom avslöja tidsförloppet för hjärt-AP. Det finns flera fördelar med denna inspelningsmetod jämfört med FP-inspelningar. För det första är signalamplituden mer framträdande, vilket ger ett överlägset signal-brusförhållande. För det andra resulterar vågformen i bättre detektion av repolariseringen. För det tredje bidrar formen på repolariseringsfasen med insikter om testföreningens verkningssätt, som tillhandahålls av brantheten i signalavslappningen. Och slutligen erbjuder denna metod en förbättrad känslighet för att upptäcka kritiska negativa läkemedelseffekter, vilket framgår av inspelningsexemplet som visas i figur 6 för förekomsten av EAD i liAP men inte i FP.
Hittills finns det två sätt att få tillgång till intracellulär AP. Den första uppnås genom elektroporering26,27. Här kan korta och starka spänningspulser som appliceras via inspelningselektroderna öppna cellmembranet28. Den andra möjligheten är membranöppningen via en laserpuls, med hjälp av ett fysiskt fenomen som kallas ytplasmonresonans, vilket visas här. En av fördelarna jämfört med elektroporering är den ökade sannolikheten för på varandra följande öppningar. På grund av den mycket fokuserade laserfläcken (1-3 μm) är denna effekt mycket lokalt begränsad till elektroden av intresse. Intressant nog förändrade initieringen av liAP inte signalutbredningen av det odlade syncytiumet. Detta indikerar att även om cellintegriteten är skadad verkar kardiomyocyterna inte depolarisera via hålet i membranet.
Det finns begränsningar för denna metod. Precis som med elektroporering håller membranöppningen i de flesta fall inte över hela experimentförloppet. De minimala effekt- och varaktighetsinställningarna för laserpulsen som krävs för stabil öppning av den specifika celltypen av intresse måste definieras oberoende före experimenten. Vi fann (inte visat) att parametrarna drastiskt varierar mellan olika celltyper (i vårt fall flera hiPS-härledda och primära kardiomyocyter). Detta undviker onödig stress på cellerna under det sammansatta testexperimentet och resulterar i mer tillförlitliga och reproducerbara data. Det är av avgörande betydelse att justera z-axeln för att ge ett tydligt fokus på cellerna och elektroderna. En ofokuserad kamerabild ger efter i en laserfläck som ligger på en suboptimal nivå, vilket kan resultera i oförmåga att öppna cellmembranet. Även med bäst justerade parametrar är liAP-effekten övergående och amplituden minskar med tiden. Dessutom varierar tillgången till cellernas intracellulära utrymme mellan liAP-induktioner, både inom på varandra följande öppningar vid samma elektrod och mellan elektroder. Detta resulterar i hög variabilitet av liAP-amplituden. Anledningen är ännu inte helt klarlagd. Möjliga förklaringar inkluderar mekaniska problem som en drift av laserfokus eller olika subcellulär lokalisering av membranöppningen. Detta gör analysen av amplitudeffekter av testföreningar komplicerad vid denna tidpunkt. Registrering av elektrisk aktivitet av ett MEA-system kräver också högpassfiltrering för att kompensera för oundviklig baslinjeavdrift. Även om denna filtrering i det system som används här var inställd på 0,1 Hz (den lägsta filterinställningen som är tillgänglig för detta system), var filtreringseffekter under platåfasen fortfarande synliga, vilket resulterade i en långsam trend av spänningsavböjningen mot baslinjen under platåfasen av hjärt-AP. Detta är särskilt problematiskt med omfattande långa underliggande AP: er som iPSC-härledda iCell-kardiomyocyter2 som används här, som redan genererar AP > 700 ms under kontrollförhållanden. Användningen av system med lägre filtrering kan bättre bevara AP: s form och ge ännu bättre tillgång till tidsförloppet för repolariseringsfasen.

Det elektriska bidraget från ett hjärtslag härrör från ett komplext och exakt tidsbestämt samspel mellan många hjärtkanaler och transportörer, liksom den exakt inställda utbredningen av elektriska signaler genom myokardiet1. Förändring av dessa nära samordnade mekanismer (t.ex. användning av läkemedel) kan leda till allvarliga konsekvenser för hjärtats funktion (dvs. livshotande arytmi)2,3. Arytmier definieras som oregelbundna hjärtslag som förändrar hjärtans normala rytm, vilket kan få livshotande konsekvenser. De kan orsakas antingen av nedsatt initiering av en våg av hjärtexcitation eller av onormal förökning av hjärtexcitation4, vilket i sin tur resulterar i en dysfunktion i hjärtats pumpmekanism.
Många mycket potenta läkemedelskandidater måste uteslutas från ytterligare undersökningar under den tidiga läkemedelsutvecklingsfasen på grund av deras (pro-) arytmiska potential 2,3. De modulerar viktiga hjärtkanaler (t.ex. den mänskliga eter-a-go-go-relaterade genkanalen [hERG]) som är ansvariga för normal hjärtåtgärdspotentialbildning och avslutning samt efterföljande signalutbredning5.
Läkemedelsföretag använder rutinmässigt patch-clamp-mätningar eller mikroelektrodmatriser (MEA) för att undersöka potentiella kardiotoxiska off-target-effekter inducerade av läkemedelskandidater. Patch-clamp-inspelningar gör det möjligt att dechiffrera effekterna av ämnen på hjärtjonkanaler och att analysera den transcellulära hjärtåtgärdspotentialen med hög spatio-temporal upplösning 6,7. Nackdelarna med denna teknik innefattar emellertid låg genomströmning med manuell patch-klämma och begränsad tillämplighet av automatisering på grund av beroendet av denna metod på celler i suspension. Dessutom kan kroniska effekter inte undersökas på grund av metodens invasivitet. Slutligen studeras vanligtvis bara enstaka celler samtidigt snarare än hela hjärtsynkynet, vilket gör det omöjligt att ta itu med information om signalutbredning.
Spänningskänsliga färgämnen är värdefulla för att icke-invasivt undersöka hjärtåtgärdspotentialer och läkemedelsinducerade arytmier8. De tillåter undersökning av både encells- och syncytiumaktivitet. Nackdelar med denna metod är cytotoxiska effekter av antingen färgämnena i sig eller av reaktionsprodukten under belysning. De används för akuta experiment och är knappast tillämpliga för långtidsstudier 9,10,11. Spänningskänsliga proteiner som alternativ har gjort betydande framsteg under de senaste åren när det gäller användbarhet och känslighet men kräver genetisk modifiering av cellerna av intresse och saknar hög tidsupplösning jämfört med elektrofysiologiska tekniker12.
Information från det senaste CiPA-initiativet13 säger att MEA används i stor utsträckning vid hjärtsäkerhetsundersökningar som ett alternativt elektrofysiologiskt tillvägagångssätt eftersom de representerar ett kraftfullt och väletablerat verktyg för att undersöka hjärtfunktion och säkerhetsfarmakologi. Kardiomyocyter odlas som ett syncytium direkt ovanpå chipsen, och extracellulära fältpotentialer (FP) registreras icke-invasivt via substratintegrerade mikroelektroder. Denna inspelningsprincip gör det möjligt att genomföra screening med ökad genomströmning under flera dagar, vilket gör dem lämpliga för farmaceutisk forskning om kroniska effekter. Den resulterande FP-vågformen är ett derivat av den intracellulära AP14. Parametrar som takthastighet, amplituden för den första delen av FP och FP-varaktighet är lättillgängliga15. Andra väsentliga kriterier såsom differentieringen mellan förlängning och triangulering av ramprogrammet (en viktig markör för proarytmi16,17) är otillgängliga på grund av teknikens AC-filtreringseffekt. Dessutom är detektion av andra små proarytmiska händelser som tidiga och fördröjda efterdepolariseringar (EAD respektive DAD) ofta lätt förbisedda på grund av deras lilla amplitud.
Här beskriver vi en metod för att få tillgång till den intracellulära membranpotentialen genom att öppna membranet av kardiomyocyter. IntraCell-enheten (nedan kallad intracellulär inspelningsenhet) möjliggör upprepade membranöppningar av kardiomyocyter odlade ovanpå MEA-elektroderna med hjälp av en mycket fokuserad nanosekundlaserstråle via ett specifikt fysikaliskt fenomen (ytplasmonresonans)18. Som ett resultat övergår inspelningen från en vanlig FP till en intracellulärliknande AP (laserinducerad AP, liAP). Protokollet visar hur detta gör det möjligt att få tillgång till kinetiska aspekter av vågformen som inte lätt kan fångas genom att analysera FP: er. Denna metod representerar en bro mellan traditionella intracellulära patch-clamp och MEA-inspelningar. Tekniken är därför en kraftfull förlängning av nuvarande metoder för hjärtsäkerhetsbedömning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>7600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>20-139 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>D-100</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>12037539</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>E-500</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB Alps version 0.5.005</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>11051407001</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell cardiomyocytes</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CN09.1</td>
			<td>For cleaning of MEA contact pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>#M1003</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Data Tool</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Rack</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>MEA recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 - 2x60 - system</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890485</td>
			<td>For MEA-recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>N7634 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>M1001</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergazyme</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>1304-1</td>
			<td>cleaning of MEAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology

Livshotande läkemedelsinducerad hjärtarytmi föregås ofta av långvariga hjärtåtgärdspotentialer (AP), vanligtvis åtföljd av små proarytmiska membranpotentialfluktuationer. Formen och tidsförloppet för den repolariserande fraktionen av AP kan vara avgörande för närvaron eller frånvaron av arytmi.
Mikroelektrodmatriser (MEA) ger enkel åtkomst till kardiotoxiska föreningseffekter via extracellulära fältpotentialer (FP). Även om det är ett kraftfullt och väletablerat verktyg inom forskning och hjärtsäkerhetsfarmakologi, tillåter FP-vågformen inte att härleda den ursprungliga AP-formen på grund av den extracellulära inspelningsprincipen och den resulterande inneboende växelströmsfiltreringen (AC).
En ny anordning, som beskrivs här, kan repetitivt öppna membranet av kardiomyocyter som odlas ovanpå MEA-elektroderna vid flera odlingstidpunkter med hjälp av en mycket fokuserad nanosekundlaserstråle. Laserporationen resulterar i att den elektrofysiologiska signalen omvandlas från FP till intracellulära-liknande AP (laserinducerad AP, liAP) och möjliggör inspelning av transcellulära spänningsavböjningar. Denna intracellulära åtkomst möjliggör en bättre beskrivning av AP-formen och en bättre och känsligare klassificering av proarytmiska potentialer än vanliga MEA-inspelningar. Detta system är en revolutionerande förlängning av de befintliga elektrofysiologiska metoderna, vilket möjliggör noggrann utvärdering av kardiotoxisk effekt med alla fördelar med MEA-baserade inspelningar (enkla, akuta och kroniska experiment, signalutbredningsanalys etc.).

Inspelningssystemet som användes för att registrera elektrisk aktivitet från odlade kardiomyocyter bestod av ett standard MEA-system utrustat med en värmare och en kammare för karbogen ansluten till en dator. Systemet ställdes ovanpå den intracellulära inspelningsenheten, som i sin tur monterades ovanpå en liten antivibrationsenhet (figur 1A-B).
iPSC-härledda kardiomyocyter 2 började slå spontant inom 2-3 dagar efter upptining (dagar in vitro, DIV) och var synliga under ett mikroskop. Från DIV 4 och framåt blev slagfrekvensen regelbunden, och extracellulära fältpotentialer (FP) med topp-till-topp-amplituder för den depolariserande komponenten mellan 1 och 5 mV kunde detekteras på de flesta elektroderna i respektive brunnar i MEA-chipsen. Den elektriska aktiviteten kan detekteras i mer än 95% av de undersökta brunnarna. Från och med DIV 7 ökade sannolikheten för cellavskiljning, vilket gjorde det omöjligt att använda dessa brunnar ytterligare.
Programvaran för att styra den laserinducerade membranöppningen gör det möjligt att justera både effekten och processtiden för lasern som förmedlar öppningen av cellmembranet endast på elektroden som undersöks (figur 1C), medan andra elektroder i respektive brunn inte påverkas. Medan för konservativa inställningar inte förändrade FP: s vågform, resulterade för höga inställningar i den förmodade skadan hos kardiomyocyterna, indikerad av kraftig men övergående slag eller förlust av signalen. När den justerades till en inställning på 40% effekt och 25% processtid tolererades väl av cellerna, resulterade utlösning av laserpulsen i flera förändringar av den inspelade vågformen (se figur 1D för en exemplarisk inspelning). Under dessa förhållanden observerades ingen förändring av elektrodmaterialet makroskopiskt. Den inspelade signalamplituden ökade massivt med 4,1 ± 0,41 (n = 20, intervall 1,34-8,83) gånger, analyserade från en slumpmässigt vald delmängd av inspelningar, vilket resulterade i amplituder mellan 7 och 22 mV. Vidare transformerades vågformen från en standard FP-form med snabb, bifasisk och övergående spänningsavböjning i början, följt av en platåfas tillbaka vid baslinjen och en liten avböjning som indikerar slutet på FP till en form som var närmare en intracellulärt registrerad AP med en snabb ökning, förlängd depolariserad platåfas och en repolariseringsfas med ett underskridande under baslinjen (figur 1E ). Vi definierade dessa spänningsavböjningar som laserinducerad AP (liAP). I de flesta fall var övergången övergående och åtminstone delvis inverterad inom 5 minuter. Signalutbredningen i hjärtsynkynet förblev oförändrad efter liAP-induktion (figur 2), vilket indikerar att det återstående syncytiumet inte påverkades av potentiell skada från laserpulsen.
Likheter med intracellulärt registrerade AP:er gjorde det möjligt att extrahera parametrar för liAP som inte är tillgängliga för FP:er (för exemplifierande parametrar, se t.ex. figur 3A), framför allt mätningen av liAP:s varaktighet vid specifika tidpunkter (t.ex. vid 20 %, 50 % och 90 %) (figur 3B), analogt med APD20/50/90 som vanligtvis används för att beskriva AP.
Därefter testade vi svaret från de laseröppnade kardiomyocyterna på vanliga kardioaktiva farmakologiska verktygsföreningar. En exemplarisk protokolldesign finns i figur 3C. Eftersom omvandlingen av liAP inte alltid kvarstod under hela experimentet utfördes den sammansatta applikationen som en enda koncentration per brunn snarare än på ett kumulativt sätt för att minska den totala inspelningstiden. Det var dock nödvändigt att antingen öppna cellerna igen eller öppna ett annat elektrodområde innan testföreningen applicerades.
Tillsatsen av den specifika L-typ Ca 2+ kanalblockeraren, Nifedipin23,24, reducerade platåfasen av liAP på ett koncentrationsberoende sätt och förkortade därmed hela liAP (figur 4A,B). Denna förkortning var jämförbar med den analys som erhölls från FPs av kardiomyocyter från omanipulerade elektroder (figur 4C), vilket indikerar att denna inspelningsmetod inte hade negativa effekter jämfört med klassiska FP-inspelningar.
E4031 hämmar repolariseringen av relevant Kv1.11 (hERG) kaliumkanal25 och leder till arytmiskt beteende hos kardiomyocyter vid ökade koncentrationer. I likhet med den analys som erhållits från FP-registreringar ökade E4031 liAP-varaktigheten på ett koncentrationsberoende sätt (figur 5). Vid koncentrationer på 0,01 μM och högre var dessutom små positiva spänningsavböjningar i slutet av liAP synliga. Dessa avböjningar blev mer framträdande med högre koncentrationer, vilket indikerar en övergående ny depolarisering, till skillnad från i FP: erna, där dessa avböjningar var praktiskt taget osynliga (se figur 5B-C, övre (FP) vs nedre (liAP) spår). Detta beteende är känt som tidig efterdepolarisering (EAD). Vid den högsta koncentrationen på 0,1 μM eskalerade dessa EAD med tiden till ektopiska slag, som är för tidiga åtgärdspotentialer (figur 5C). Både EAD och ektopiska slag är viktiga indikatorer på proarytmisk aktivitet. I slutet av exemplet som visas i figur 5D resulterade den elektriska aktiviteten i arytmisk misshandel. Dessutom matchade koncentration-respons-relationer som visades mellan FP- och liAP-inspelningar (figur 5E). Det finns emellertid en mer betydande variation i FP-data till följd av den svaga repolariseringskomponenten i FP: erna vid högre koncentrationer av testföreningen. Det verkar vara den karakteristiska karaktären hos iPSC-härledda kardiomyocyter2 att tendera att generera ofysiologiskt långa AP under kontrollförhållanden också (AP-varaktigheter > 700 ms). MEA-systemet tillämpade en inneboende 0,1 Hz AC-filtrering, vilket i sin tur resulterade i en delvis filtrerad form av liAP, men utan att dölja den kvalitativa informationen om början och avslutningen av den underliggande AP.
Det visade sig att den initiala förekomsten av proarytmiska spänningsavböjningar kunde detekteras vid lägre koncentrationer i liAP jämfört med FP-inspelningar. I figur 6 visas registreringen av elektrisk aktivitet under appliceringen av Dofetilide i en koncentration av 3 μM. Inspelningen erhölls i samma brunn. Även om både FP och liAP visade varaktigheter på cirka 2 s, var FP-vågformen diskret och presenterade regelbundna repolariserande avböjningar. Samtidigt, i slutet av liAPs, blev EADs i olika storlekar synliga. Denna ökning av relevant säkerhets-farmakologisk känslighet stöder ytterligare slutsatsen att liAPs inducerade av ytplasmonresonans möjliggör förbättrad kvalificering av den repolariserande fasen och därigenom hjälper till att lära sig mer om verkningssättet för de testföreningar som undersöks.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> Bild 1: Inställning av intracellulär inspelning och exemplariska inspelningar . (A) Översikt över installationen. (B) Ovanifrån av inspelningssystemet med öppen MEA-inspelningsförstärkare. (C) Initieringsprogramvara med den virtuella MEA-kartan på höger sida. 1: antivibrationsbord, 2: intracellulärt inspelningssystem, 3: laserskyddslock, 4: fuktad karbodelkammare, 5: MEA-värmesystem, 6: MEA-gränssnittskort, 7: 1-brunns MEA-chip inuti inspelningsförstärkaren. (D) Registrering av exempel från en elektrod före och efter induktion av liAPs. Överst: inspelning på ca 6 min. Prickade linjer markerar de expanderade områdena som visas längst ner. (E) Förstorad FP (överst) och liAP (nederst). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> Figur 2: Signalutbredningsmönstret förblir bevarat efter liAP-induktion. Falsk färgkodning av signalutbredningen av excitationsvågen i syncytium. Blå indikerar tidigt (börjar vid -4 ms); rött indikerar sena tidpunkter (+3 ms) från signalen erhållen vid referenselektroden E54 som indikeras av färgfältet. Signalen färdas från övre högra till nedre vänstra delen av elektroduppsättningen. (A) Före liAP-induktion, (B) 1 min efter liAP-induktion. (C) 4 min efter liAP-induktion. Flash-symbolen indikerar laserinduktionspunkten vid elektrod 64. Observera att ingen skillnad i den övergripande utbredningsriktningen är synlig. Svarta rektanglar indikerar ogiltiga data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> Figur 3: Definition av FP/liAP-parametrar och inspelningsprotokoll . (A) Parametrar som kan extraheras från den klassiska FP. (B) Ytterligare parametrar som kan erhållas från liAPs. (C) Tidslinje för läkemedelsmätning. Från vänster till höger: kontrollinspelning för 60 s, induktion av liAP, inspelning av liAP för 60 s, läkemedelsapplikation, tvätttid 300 s, återinduktion av liAP, inspelning av liAP för 60 s. Klicka <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> Figur 4: Nifedipin förkortar hjärt-liAP på ett koncentrationsberoende sätt. (A) Överst: FP-spår vid kontroll (blå) och i närvaro av 0,3 μM Nifedipin (röd). Spårningar visas med en y-axelförskjutning för bättre visualisering. Botten: liAP-spår från samma MEA-inspelning, vilket resulterar i en förkortning av liAP i kombination med en ökning av takthastigheten. B) Extra placering av enstaka liAP under kontroll (blå) och applicering av olika koncentrationer av nifedipin (röd). a: 0,01 μM, b: 0,1 μM och c: 0,3 μM. Observera förkortningen av liAP-varaktigheten med ökande koncentrationer. (C) Förhållandet mellan koncentration och respons för signalbredd erhållen från FP (svart) och liAP (röd) registreringar. Data är från n = 3 experiment och normaliseras för att kontrollera. Felstaplar anger medelvärdets standardfel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> Figur 5: E4031 inducerar (pro-) arytmiskt beteende . (A) FP (överst) och liAP (nederst) vid kontrollförhållanden. (B–C) FP och liAP registrerades vid olika tidpunkter efter applicering av E4031 (0,1 μM). Efter 80 s är de första EAD: erna synliga i slutet av liAP (B; markerade med en röd pil). EAD omvandlas till ektopiska slag efter 320 s i närvaro av testföreningen (C). (D) Efter 530 s går hjärtsynkytiet in i ett takykardiskt tillstånd. Spår avbildat från liAP-inspelning. (E) Förhållandet mellan koncentration och respons mellan FP (svart) och liAP (röd) bredd. Data från n = 4 experiment, normaliserade för att kontrollera. Felstaplar anger medelvärdets standardfel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> Figur 6: Detektion av proarytmiska händelser är känsligare i liAP än FPs . (A) FP-inspelning och (B) liAP-inspelning i samma brunn under applicering av 3 μM Dofetilide. Medan EAD: er i slutet av vissa liAP: er kan detekteras, förblir de oupptäckbara i FP-inspelningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

Kombinationen av laserporation och mikroelektrodmatriser (MEA) möjliggör åtgärdspotentialliknande inspelningar av odlade primära och stamcellsderiverade kardiomyocyter. Vågformsformen ger överlägsen inblick i testföreningarnas verkningssätt än standardinspelningar. Den länkar patch-clamp och MEA-avläsning för att ytterligare optimera hjärtsäkerhetsforskning i framtiden.

Laserinducerad åtgärdspotentialliknande mätningar av kardiomyocyter på mikroelektrodmatriser för ökad prediktivitet för säkerhetsfarmakologi

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

Denna metod gör det möjligt att registrera intracellulära lika åtgärdspotentialer på traditionella MEA: er, vilket möjliggör en bättre beskrivning av AP-formen och en mer känslig klassificering av pro-arytmiska potentialer. Jämfört med typiska fältpotentialinspelningar ger den intracellulära lika faktiska potentiella formen mer insikt i den exakta auktoriseringen av de underliggande jonkanalerna. När metoden tillämpas på kardiomyocyter som härrör från kliniska patienter genom stamcellsteknik kan den bidra till kausal diagnos och personalisering av C R P och hjärtsjukdomar som arytmier Vår tekniker, Karin Gebhardt, kommer att demonstrera kardiomyocytodlingen.För att börja belägga elektrodfälten för de tidigare autoklaverade MEA: erna, Dropwise med fibronektin med en 10 mikroliter pipett under den laminära flödeshuven. För att minska den osmotiska chocken, överför pläteringslösningen droppvis i 90 sekunder till 50 ml röret som innehåller tina kardiomyocyter. Tillsätt försiktigt åtta milliliter pläteringsmedium i röret och blanda cellsuspensionen försiktigt.Använd en 10 ml pipett, ta bort supernatanten, se till att inte kassera pelleten och justera cellnumret till slutlig koncentration. Innan cellsittning ta bort den applicerade beläggningslösningen från MEA-elektrodområdet med en 10 mikroliter pipett. För att undvika torkning av beläggningen frö cellerna omedelbart genom att tillsätta fyra mikroliter av cellerna droppvis på elektrodfälten för båda, sex brunnar MEA och en brunn M E A.Låt nu cellerna hålla fast vid brunnarna i en timme vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Under den laminära flödeshuven, tillsätt 200 mikroliter och en milliliter sterilt pläteringsmedium uppvärmt till 37 grader Celsius för sex Well MEA respektive single well MEA. För MEA-inspelningar, placera MEA-systemet ovanpå enheten med MEA-chiphållaren centrerad över målhålet. Låt sedan lasern fokusera på elektroderna genom att placera MEA-inställningen, så att målet ligger direkt under hålet i MEA-systemet.För att låta cellerna återhämta sig från den mekaniska störningen, överför MEA-chipet med de odlade cellerna från inkubatorn till MEA-installationen 15 minuter före inspelningen. Rengör sedan kontaktdynorna och stiften försiktigt med en isopropanolpinne för att minska ljudnivåerna. Placera MEA försiktigt i MEA-installationen och placera MEA-chipet med sex brunnar med serienumret synligt på höger sida eller ett enda brunns-MEA-chip med referenselektroden till vänster.Ställ nu in MEA-systemets integrerade uppvärmning till 38 grader Celsius. Stäng locket på enheten eftersom den integrerade säkerhetsbrytaren endast tillåter att lasern aktiveras om locket är stängt över MEA-chipet. Med hjälp av MEA-konfigurationsprogrammet ställer du in MEA-systemfiltret med högt pass och lågt pass till 0,1 hertz eller mindre respektive 3 500 hertz.Använd MC-rackprogramvaran eller någon alternativ programvara för inspelning. Justera ingångsområdet enligt experimentet. Se till att signalen inte mättar förstärkaren och samplingsfrekvensen.Använd programvarans långsiktiga visningsfunktion för att kontrollera inspelningen. Efter att ha satt in MEA-chipet i MEA-installationen och konfigurerat programvaran initierar du lasermekaniken med FB ALP-programvaran. Klicka nu på initialiseringsknappen.I slutet av initialiseringen kommer den virtuella laserpunkten att vara i brunn D för en sex brunn MEA respektive längst ner till vänster för en enda brunn MEA. Använd sedan kontrolltangenten med ett musklick för att flytta den virtuella laserpunkten till mitten av D fem-elektroden och justera fokus genom att hålla kontrolltangenten intryckt och rulla med mushjulet. Du kan också använda autofokusfunktionen.Tryck på knappen set P one, och den virtuella laserpunkten flyttas automatiskt in i brunnen F.Systemet är nu inställt. Justera lasereffekten och processtiden enligt de experimentella kraven. För att aktivera lasern, klicka på laseravstängningsknappen som kommer att visas som laser på, Byt till inspelningsprogramvaran.Välj ett filnamn och klicka på den röda inspelningsknappen följt av uppspelningsknappen ovanpå fönstret för att spela in mätningen. Innan du öppnar cellerna med lasern registrerar du en baslinje i 60 sekunder. Byt tillbaka till initieringsprogramvaran och inaktivera elektroder som ska uteslutas av lasern på den virtuella kartan till höger om programvarufönstret.För att starta lasern använd Alt-musklick och välj mittelektroden för denna brunn. Detta initierar lasern för att öppna cellerna på varje elektrod i denna brunn automatiskt, upprepa för varje brunn för att öppna alla tidigare aktiverade elektroder i denna valda brunn. Lös upp millimolär koncentration av Nifedipin E-40 31 och Dofetilide i DMSO först och sedan i fullständigt medium till 10 gånger den önskade koncentrationen.Överskrid aldrig en slutlig DMSO-koncentration på 0,1% i brunnen. Registrera baslinjeaktiviteten i 60 sekunder. Starta den laserinducerade perationen som visats tidigare, vilket resulterar i en omvandling av FPS till liAPs.Applicera alla droger som en enda koncentration per brunn. Ta bort 20 mikroliter och 100 mikroliter medium per brunn från sex brunnar respektive enstaka brunn MEA. Tillsätt 20 mikroliter eller 100 mikroliter av läkemedelsstamlösningen som ska mätas till brunnen.Beroende på MEA-typ, och pipettera försiktigt upp och ner två till tre gånger. Låt föreningarna tvättas i 300 sekunder. Under denna tid kan liAP-formen omvandlas till FP-formen.Återigen, inducerad laserinducerad peration och registrera möjliga föreningsinducerade defekter på liAP i ytterligare 60 sekunder. Tillsatsen av nifedipin minskade platåfasen av liAP på ett koncentrationsberoende sätt och förkortade därmed hela liAP. Denna förkortning var jämförbar med fältpotentialerna hos kardiomyocyter från omanipulerade elektroder.E-40 31 hämmade repolariseringen av relevanta KV en punkt 11 kaliumkanaler och ledde till det arytmiska beteendet hos kardiomyocyter vid ökade koncentrationer. Dessutom ökade E-40 31 liAP-varaktigheten på ett koncentrationsberoende sätt. I slutet av liAP observerades små positiva spänningsavböjningar vid 0,1 mikromolar som blev mer framträdande med högre koncentrationer, vilket indikerar en övergående ny depolarisering som kallas EAD: s.Vid den högsta koncentrationen på 0,1 mikromolar eskalerade dessa EAD: er med tiden till ektopiska slag. Vilka är för tidiga åtgärdspotentialer. EAD och ektopiska beats är nyckelindikatorer på proarytmisk aktivitet.Och i slutändan resulterar den elektriska aktiviteten i arytmisk misshandel. Koncentrationsresponsrelationerna korrelerade med FP:s och liAP:s inspelningar. Vidare, i närvaro av dofetilid, visade både FP och liAP varaktigheter på cirka två sekunder inom samma brunn, FP-vågformen presenterade regelbundna repolariseringsavböjningar.Medan i liAP EAD: er är detekterbara. Det är viktigt att justera fokus före varje melom eftersom en mikroskopbild utan fokus kan påverka cellernas öppning. Dessutom vidtas åtgärdspotential strax efter det att opterperation bör användas för analys.Denna teknik är känsligare för att upptäcka tidigare arytmiska effekter jämfört med standard MEA, vilket möjliggör mer exakt detektering av negativa sammansatta effekter.

Research

JoVE Journal

Medicine

Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements

Femoral arteriell och venös Kateterisering för Blodprovstagning, Drug Administration och medvetna Blodtryck och hjärta Mått Rate

In multiple fields of study, access to the circulatory system in laboratory studies is necessary. Pharmacological studies in rats using chronically ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

En Laser-inducerad musmodell av kronisk okulär hypertension för att karaktärisera synfel

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolering och funktionell karakterisering av Human Ventrikulär Cardiomyocytes från Fresh Kirurgiska prover

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

Upptäckt av sjukdomsassocierade α-synuklein genom förbättrade ELISA i hjärnan hos transgena möss som överuttrycker Human A53T Mutated α-synuklein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

En musmodell för Laser-inducerad chorioidal kärlnybildning

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Kirurgisk träning för Implantation av hjärnbarkens mikroelektrod matriser använder en modell med formaldehyd-fast mänskliga Cadaver

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolering och odling av vuxen råtta hjärtmuskelcellerna

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Kontraktilitet mätningar av glatt muskulatur i mänskliga livmodern till stöd läkemedelsutveckling

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Microelektrod impalement metod för att spela in membran potential från en kanylerade mellersta cerebral artär

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

Direkt läkemedelsleverans till njure via njurartären

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...