Name: laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Yazarlar, çalışmalar sırasında IntraCell sistemini ödünç verdikleri için Foresee Biosystems'e teşekkür eder. Ayrıca teknik yardım için Hae In Chang'a teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020'nin araştırma ve inovasyon programından 964518 numaralı hibe anlaşması (ToxFree), AB Ufuk Avrupa Avrupa İnovasyon Konseyi Programı, SiMulTox projesi (hibe anlaşması No 101057769) ve Baden-Württemberg Ekonomik İşler, Çalışma ve Turizm Devlet Bakanlığı'ndan fon almıştır.

1. İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin hazırlanması
NOT: iCell kardiyomiyositleri2 (indüklenmiş pluripotent kök hücre [iPSC'ler] kaynaklı kardiyomiyositler olarak adlandırılır) tedarikçi tarafından sağlanan protokole göre hazırlanmıştır. Protokol aşağıdaki bölümde kısaca özetlenecektir.
<ol><li>Kullanımdan önce 24 saat boyunca 4 °C'de dikiş kaplama ve bakım ortamı.</li>
	<li>Steril fibronektini steril suda 1 mg/mL konsantrasyonda çözerek fibronektin kaplama hazırlayın. Bu stoğu alikotlarda dondurarak saklayın (örneğin, alikot başına 25 μL). Aliquoted stok çözeltisini steril Dulbecco'nun dengeli tuz çözeltisinde (dPBS) 1:20 oranında seyreltin.</li>
	<li>Daha önce otoklavlanmış MEA'ların elektrot alanlarını laminer akış başlığı altında, steril koşullar altında damlacık yönünde 10 μL'lik bir pipet kullanarak fibronektin ile kaplayın. Bunun için, fibronektin kaplama çözeltisinin 5 μL'sini elektrot alanlarına bırakın ve elektrot alanının üstünde bir damlacık oluşumunu gözlemleyin. Hassas elektrotlara dokunmadığınızdan emin olun. NOT: Steril koşulları korumak için, MEA çipini laminer akış başlığından çıkarmadan önce steril bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Kaplanmış MEA'ları tercihen bir inkübatörde 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kardiyomiyositleri içeren kriyosiali yaklaşık 37 ° C'de bir su banyosunda sadece küçük bir buz kristali kalana kadar 2 dakika boyunca çözün. Hücre çözeltisini nazikçe 50 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Boş kriyovale 1 mL kaplama ortamı ekleyin. Ozmotik şoku azaltmak için çözeltiyi 90 sn'lik bir süre boyunca damla damla 50 mL tüpe aktarın. Tüpe yavaşça 8 mL daha fazla kaplama ortamı ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. Otomatik floresan sitometri kullanarak toplam canlı hücre sayısını hesaplayın. Numara, üretici tarafından sağlanan veri sayfasındaki numaraya yakın olmalıdır.</li>
	<li>Hücre çözeltisini oda sıcaklığında 200 x g'da 3 dakika aşağı doğru döndürün. Bir pompalama sistemine bağlı bir cam pipet kullanarak süpernatantı aspirasyon ile çıkarın. Hücre sayısını 6.000 ila 15.000 canlı hücre/μL arasında ayarlayın. NOT: Hücre sayısı genellikle yukarıda verilen aralıktadır, ancak ilgili tedarikçiye bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Adım 1.3'te uygulanan kaplama çözeltisini, hücre tohumlamadan hemen önce 10 μL'lik bir pipet kullanarak MEA elektrot alanından çıkarın. Kaplamanın kurumasını önlemek için söküldükten hemen sonra hücreleri tohumlayın. Bunun için, hücreleri hem 6 kuyucuklu MEA'lar hem de 1 delikli MEA'lar için 4 μL'de damla damla elektrot alanlarına kaplamayla aynı şekilde tohumlayın.</li>
	<li>Kuyucukları, 6 kuyucuklu MEA için200 μL'de yaklaşık 37 ° C'ye ısıtılmış steril kaplama ortamı ile doldurmadan önce hücrelerin inkübatörde 37 ° C'de 1 saat ve % 5 CO 2'de 1 saat boyunca yapışmasına izin verin ve laminer akış başlığı altındaki tek kuyucuklu MEA için 1 mL'dir.</li>
	<li>Laminer akış başlığının altına kaplandıktan 48 saat sonra tam bir ortam değişimi gerçekleştirin. Bunun için, bir pompalama sistemine bağlı bir cam pipet kullanarak kaplama ortamını aspirasyonla çıkarın. Daha sonra, kuyucuklara 37 ° C'ye ısıtılmış 200 μL steril bakım ortamı ekleyin.</li>
	<li>Her gün tam orta değişiklikler yapın.</li>
	<li>Çözülmeden 5-8 gün sonra hücreleri ölçmeye başlayın. Denemelere başlamadan 2 saat önce tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin.</li>
</ol>2. MEA kayıtları
NOT: FP sinyalini liAP'ye dönüştürmek için kullanılan cihaz dik bir mikroskop ve 1064 nm lazerden oluşur.
<ol><li>MEA sistemini, MEA çip tutucu objektif deliğin üzerine ortalanmış olarak cihazın üstüne yerleştirin. MEA'yı, lazerin elektrotlara odaklanmasına izin vermek için hedefin doğrudan MEA sisteminin deliğinin altında olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>MEA çipini, ekili hücrelerle birlikte inkübatörden kayıttan 15 dakika önce MEA kurulumuna aktarın ve hücrelerin mekanik rahatsızlıktan kurtulmasını sağlayın.</li>
	<li>Gürültü seviyelerini azaltmak için temas pedlerini ve pimlerini izopropanol ve pamuklu çubukla dikkatlice temizleyin. MEA'yı MEA kurulumuna dikkatlice yerleştirin. MEA çipini, sol üst tarafta altta logo (6 delikli MEA) veya sol tarafta referans elektrodu (tek kuyucuklu MEA) olacak şekilde konumlandırın.</li>
	<li>MEA sistemine entegre ısıtmayı 38 °C'ye ayarlayın. İnkübatör koşullarını yeniden yaratmak ve buharlaşmayı önlemek için hücreleri nemlendirilmiş karbojenle (% 5 CO2 ve% 95O2) sürekli olarak incelemek için MEA çipinin üzerine küçük bir oda yerleştirin.</li>
	<li>Cihazın kapağını kapatın. Entegre emniyet şalteri, lazerin yalnızca kapak MEA çipi üzerinden kapatıldığında etkinleştirilmesine izin verir. MEA yapılandırma programını kullanarak MEA sistem filtresini 0,1 Hz veya daha az yüksek geçişli ve 3.500 Hz düşük geçişli olarak ayarlayın.</li>
	<li>Kayıt için MC_Rack yazılımını (kayıt yazılımı) veya herhangi bir alternatif yazılımı kullanın. Giriş aralığını, sinyalin amplifikatörü ve örnekleme hızını (örneğin, 20 kHz) doyurmadığından emin olmak için ihtiyaçlarınıza göre ayarlayın. Kaydı kontrol etmek için yazılımın uzun vadeli görüntüleme işlevini kullanın.</li>
</ol>3. Lazerle indüklenen hücre porasyonu
<ol><li>MEA çipini MEA kurulumuna yerleştirdikten ve yazılımı kurduktan sonra, FB Alps yazılımını (başlatma yazılımı) kullanarak lazer mekaniğini başlatın.</li>
	<li>İlk olarak, Başlatma düğmesine tıklayın. Başlatmanın sonunda, sanal lazer noktası sırasıyla 6 kuyulu bir MEA için D kuyusunda ve tek kuyulu bir MEA için sol altta olacaktır.</li>
	<li>Sanal lazer noktasını Ctrl + fare tıklamasıyla elektrot D5'in ortasına taşıyın ve odağı ayarlayın. Fare tekerleği ile Ctrl + kaydırma ile odağı ayarlayın.</li>
	<li>P1 Ayarla düğmesine basın. Sanal lazer noktası otomatik olarak kuyuya doğru hareket edecektir F. İşlemi F5 elektrotu ile tekrarlayın ve P2 Ayarla'yı seçin.</li>
	<li>Bu işlemden sonra, lazer noktası B kuyusuna hareket edecektir. aynı işlemi B5 elektrodu ile tekrarlayın ve yazılımdaki Set P3'e basın. Sistem artık hizalanmıştır.</li>
	<li>Lazer gücünü ve işlem süresini hücrelerinizin ihtiyaçlarına göre ayarlayın. Burada %40 güç ve %25 işlem süresi kullanılmıştır.</li>
	<li>Lazeri etkinleştirmek için, daha sonra lazer açık olarak görünecek olan Lazer Kapatma düğmesine tıklayın. Kayıt yazılımına geçin, bir dosya adı seçin ve ölçümü kaydetmek için Kırmızı Kayıt düğmesine ve ardından pencerenin üstündeki Oynat düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Hücreleri lazerle açmadan önce 60 sn'lik bir taban çizgisi kaydedin. Başlatma yazılımına geri dönün.</li>
	<li>Ctrl + fare tıklamasını kullanarak sağ taraftaki sanal haritadaki lazer tarafından dışlanacak elektrotları devre dışı bırakın. İlgilendiğiniz elektrotları, yazılım penceresinin sağ tarafındaki dizi gösteriminde etkinleştirerek seçin.</li>
	<li>Lazeri başlatmak için Alt + fare tıklamasını kullanın ve bu kuyucuğun orta elektrodunu seçin. Bu, lazeri bu kuyunun her elektrodundaki hücreleri otomatik olarak açmaya başlatır. Her kuyucuk için tekrarlayın. Lazer daha sonra seçilen kuyunun önceden aktive edilmiş tüm elektrotlarını otomatik olarak açacaktır.</li>
</ol>4. İlaç kullanımı ve uygulaması
<ol><li>Uyuşturucu testleri için kullanılacak tüm maddeleri ölçüm gününde taze olarak hazırlayın. Kuyularda 1:10 seyreltme yapmak için son uygulama konsantrasyonunun ortamda 10 kat daha yüksek olduğundan emin olun.</li>
	<li>Nifedipin, E4031 ve Dofetilide, önce DMSO'da mM konsantrasyonunda, daha sonra da istenen konsantrasyonun orta ila 10 katında çözün. Kuyudaki %0,1'lik son DMSO konsantrasyonunu asla aşmayın.</li>
	<li>60 saniye için temel etkinliği kaydedin. Protokolün 3. adımında açıklandığı gibi lazer kaynaklı porasyonu başlatın, FP'nin liAP şekline dönüştürülmesiyle sonuçlanır.</li>
	<li>Tüm ilaçları kuyu başına tek konsantrasyon olarak uygulayın. 6 kuyucuklu MEA'lar için kuyu başına 20 μL ve tek kuyucuklu MEA'lar için sırasıyla 100 μL ortam çıkarın. MEA tipine bağlı olarak, kuyuya ölçülecek ilacın stok çözeltisinden 20 μL veya 100 μL ekleyin ve 2-3 kez dikkatlice yukarı ve aşağı pipet yapın. İstatistiksel alaka düzeyini elde etmek için her ilacın ve konsantrasyonun en az üç replikasyonunu gerçekleştirin.</li>
	<li>Bileşiklerin 300 s boyunca yıkanmasına izin verin. Bu süre zarfında, liAP şekli FP şekline geri dönüşebilir. Yine, lazer kaynaklı porasyonu indükleyin ve liAP üzerindeki olası bileşik kaynaklı etkileri ek 60 s için kaydedin.</li>
</ol>5. Veri dışa aktarma
<ol><li>Kaydı kayıt yazılımında tekrar oynatarak ilgili elektrotları seçin. MC_DataTool dosyalarını ASCII MC_Rack dosyalarına dönüştürmek için .txt'ı kullanın.</li>
	<li>Dosya > MCD'yi Aç > MC_Rack bir dosya seçin'e tıklayın. txt düğmesine tıklayın (mavi metin).</li>
	<li>Bir elektrot seçin. Seçilen elektrot sağ taraftaki listede gösterilecektir.</li>
	<li>Klasörü seçmek ve yeni .txt dosyasının adını değiştirmek için Gözat'a tıklayın. Kaydet'e tıklayın.</li>
	<li>Dışa aktarılan elektrotun seçimini kaldırın ve dışa aktarılacak bir sonraki elektrodu seçin. İlgilendiğiniz tüm elektrotlar için prosedürü tekrarlayın.</li>
</ol>6. Veri işleme ve istatistiksel analiz
<ol><li>Dönüştürülmüş ikili izlemeleri R19'a aktarın. Aşağıdaki paketleri içeren özel uyarlanmış komut dosyalarını kullanarak verileri görselleştirin/analiz edin: dplyr, tidyr ve ggplot220,21,22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+arrhythmias.">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li><li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hERG+(KCNH2+or+Kv11.1)+K++channels:+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk.">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li><li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development.">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li><li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmia.">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665 (2008).</li><li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+arrhythmias:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li><li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MICE+models:+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes.">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100 (2013).</li><li>Rampe, D., Roy, M. -. L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+(Propulsid):+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG.">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li><li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes.">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li><li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents.">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344 (2014).</li><li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart.">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li><li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-speed,+bright,+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity.">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878 (2019).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Kovacs, G. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+sensors+with+living+cellular+components.">Electronic sensors with living cellular components.</a> Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).</li><li>Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+field+potentials+measured+on+a+multi+electrode+array+in+pharmacological+toxicity+screening+on+primary+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).</li><li>Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+rapid+delayed+rectifier+K++current+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes.">Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.</a> Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).</li><li>Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+test+in+isolated+female+rabbit+heart+reliably+identifies+action+potential+duration+prolongation+and+proarrhythmic+drugs:+importance+of+triangulation,+reverse+use+dependence,+and+instability.">Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).</li><li>Dipalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+action+potential+recordings+from+cardiomyocytes+by+ultrafast+pulsed+laser+irradiation+of+fuzzy+graphene+microelectrodes.">Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li><li>. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2021)</li><li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , (2009).</li><li>. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2022)</li><li>. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6 Available from: <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2021)</li><li>Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+calcium+channel+blockers.">Discovery and development of calcium channel blockers.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 286 (2017).</li><li>Vater, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacology+of+4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic+acid+dimethyl+ester+(Nifedipine,+BAY+a+1040).">Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040).</a> Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).</li><li>Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+E-4031-sensitive+potassium+current+in+rat+carotid+chemoreceptor+cells.">Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiwell+cardiac+&#181;GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs.">A multiwell cardiac &#181;GMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li><li>Fendyur, A., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+on-chip,+in-cell+recordings+from+cultured+cardiomyocytes+by+arrays+of+gold+mushroom-shaped+microelectrodes.">Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes.</a> Frontiers in Neuroengineering. 5, 21 (2012).</li><li>Hayes, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+action+potential+measurements+from+intact+cardiac+monolayers+with+multiwell+microelectrode+array+technology.">Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11893 (2019).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu yenilikçi yöntem, kardiyoaktif farmakolojik alet bileşiklerinin uygulanması sırasında kardiyak aksiyon potansiyelinin farmakolojik modülasyonunu in vitro olarak araştırmanın yeni bir yolunu göstermektedir.
Klasik MEA kayıtları, kardiyak AP14'ün türevi olan FP kayıtlarına izin verir. Bu dolaylı kayıt, de- ve repolarizasyonun zaman seyrini içerir ve böylece AP'nin temel özelliklerini ortadan kaldırır. Ayrıca, bir AP'nin hücreler arası voltaj değişimi tipik olarak yaklaşık 100 mV değerlere ulaşsa da, genel FP genliği, birkaç 100 μV ve düşük tek haneli mV değerleri arasındaki tepe genlikleri ile nispeten düşük kalır. Kayıt prensibi nedeniyle, repolarize faz küçüktür; çoğu durumda, sadece tespit edilebilir ve çoğu zaman belirsiz bir şekle sahiptir, bu da FP'nin sonunu tanımlamayı zorlaştırır. Hücre zarının açılması, hücre içi voltaja erişmemizi sağlar, böylece kardiyak AP'nin zaman seyrini ortaya çıkarır. Bu kayıt yönteminin FP kayıtlarına kıyasla birçok avantajı vardır. İlk olarak, sinyal genliği daha belirgindir ve üstün bir sinyal-gürültü oranı sağlar. İkincisi, dalga formu repolarizasyonun daha iyi algılanmasıyla sonuçlanır. Üçüncüsü, repolarizasyon fazının şekli, sinyal gevşemesinin dikliği tarafından sağlanan test bileşiğinin etki tarzına ilişkin içgörülere katkıda bulunur. Ve son olarak, bu yöntem, liAP'de EAD'lerin ortaya çıkması için Şekil 6'da görüntülenen kayıt örneği ile gösterilen, ancak FP'de olmayan kritik advers ilaç etkilerini tespit etmek için gelişmiş bir duyarlılık sunar.
Şimdiye kadar, hücre içi AP'ye erişmenin iki yolu vardır. Birincisi elektroporasyon26,27 ile elde edilir. Burada elektrotların kayıt altına alınması yoluyla uygulanan kısa ve güçlü gerilim darbeleri hücre zarını28 açabilir. İkinci olasılık, burada gösterildiği gibi, yüzey plazmon rezonansı adı verilen fiziksel bir fenomenden yararlanan bir lazer darbesi yoluyla membranın açılmasıdır. Elektroporasyona kıyasla avantajlardan biri, ardışık açıklıkların olasılığının artmasıdır. Yüksek oranda odaklanmış lazer noktası (1-3 μm) nedeniyle bu etki, ilgilenilen elektrot ile çok lokal olarak sınırlıdır. İlginçtir ki, liAP'nin başlatılması, ekili sinsityumun sinyal yayılımını değiştirmedi. Bu, hücre bütünlüğünün zarar görmesine rağmen, kardiyomiyositlerin zardaki delikten depolarize olmadığını gösterir.
Bu yöntemin sınırlamaları vardır. Elektroporasyonda olduğu gibi, membran açıklığı çoğu durumda tüm deney süreci boyunca sürmez. İlgilenilen spesifik hücre tipinin kararlı bir şekilde açılması için gereken lazer darbesinin minimum güç ve süre ayarları, deneylerden önce bağımsız olarak tanımlanmalıdır. Parametrelerin farklı hücre tipleri arasında büyük ölçüde değiştiğini bulduk (gösterilmedi) (bizim durumumuzda, birkaç hiPS türevi ve primer kardiyomiyosit). Bu, bileşik test deneyi sırasında hücreler üzerinde gereksiz stresi önler ve daha güvenilir ve tekrarlanabilir verilerle sonuçlanır. Z eksenini, hücrelere ve elektrotlara net bir odaklanma sağlayacak şekilde ayarlamak kritik öneme sahiptir. Odaklanmamış bir kamera görüntüsü, optimal olmayan bir seviyede bulunan bir lazer noktasında ortaya çıkar ve potansiyel olarak hücre zarının açılamamasına neden olur. En iyi ayarlanmış parametrelerle bile, liAP etkisi geçicidir ve genlik zamanla azalır. Ayrıca, hücrelerin hücre içi boşluğuna erişim, hem aynı elektrottaki ardışık açıklıklar içinde hem de elektrotlar arasında liAP indüksiyonları arasında değişir. Bu, liAP genliğinin yüksek değişkenliğine neden olur. Nedeni henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Olası açıklamalar, lazer odağının sürüklenmesi veya membran açıklığının farklı hücre altı lokalizasyonu gibi mekanik sorunları içerir. Bu, test bileşiklerinin genlik etkilerinin analizini zamanın bu noktasında karmaşık hale getirir. Ayrıca, elektriksel aktivitenin bir MEA sistemi tarafından kaydedilmesi, kaçınılmaz taban çizgisi sapmasını telafi etmek için yüksek geçişli filtreleme gerektirir. Burada kullanılan sistemde, bu filtreleme 0,1 Hz'e (bu sistem için mevcut en düşük filtre ayarı) ayarlanmış olmasına rağmen, plato fazı sırasında filtreleme etkileri hala görülebiliyordu ve bu da kardiyak AP'nin plato fazı sırasında taban çizgisine doğru voltaj sapmasının yavaş bir eğilimine neden oldu. Bu, özellikle burada kullanılan iPSC türevi iCell kardiyomiyositleri2 gibi kapsamlı bir şekilde altta yatan AP'ler için sorunludur ve bunlar zaten kontrol koşulları altında AP >700 ms üretir. Daha düşük filtreli sistemlerin kullanılması, AP'nin şeklini daha iyi koruyabilir ve repolarizasyon aşamasının zaman akışına daha iyi erişim sağlayabilir.

Bir kalp atışının elektriksel katkısı, birçok kalp kanalının ve taşıyıcının karmaşık ve hassas bir şekilde zamanlanmış etkileşiminden ve ayrıca elektrik sinyallerinin miyokard1 yoluyla hassas bir şekilde ayarlanmış yayılmasından kaynaklanır. Yakından koordine edilen bu mekanizmaların değiştirilmesi (örneğin, uyuşturucu kullanmak), kalbin işlevi için ciddi sonuçlara yol açabilir (yani, hayatı tehdit eden aritmi)2,3. Aritmiler, kalbin normal ritmini değiştiren ve hayatı tehdit edici sonuçlar doğurabilecek düzensiz kalp atışları olarak tanımlanır. Bir kardiyak uyarılma dalgasının bozulmuş başlatılmasından veya kardiyak uyarma4'ün anormal yayılımından kaynaklanabilir, bu da kalbin pompalama mekanizmasının işlev bozukluğuna neden olur.
Birçok yüksek etkili ilaç adayı, (pro-) aritmik potansiyelleri nedeniyle erken ilaç geliştirme aşamasında daha ileri araştırmalardan dışlanmalıdır 2,3. Normal kardiyak aksiyon potansiyeli oluşumu ve sonlandırılmasının yanı sıra müteakip sinyal yayılımından sorumlu olan anahtar kalp kanallarını (örneğin, insan eteri-a-go-go-go ile ilişkili gen kanalı [hERG]) modüle ederler5.
İlaç şirketleri, ilaç adayları tarafından indüklenen potansiyel kardiyotoksik hedef dışı etkileri araştırmak için rutin olarak yama-kelepçe ölçümlerini veya mikroelektrot dizilerini (MEA) kullanır. Yama-kelepçe kayıtları, maddelerin kardiyak iyon kanalları üzerindeki etkisini deşifre etmeye ve yüksek uzaysal-zamansal çözünürlük 6,7 ile hücre ötesi kardiyak aksiyon potansiyelini analiz etmeye izin verir. Bununla birlikte, bu tekniğin dezavantajları, manuel yama kelepçesi ile düşük verim ve bu yöntemin süspansiyondaki hücrelere bağımlılığı nedeniyle otomasyonun sınırlı uygulanabilirliğini içerir. Ayrıca, yöntemin invazivliği nedeniyle kronik etkiler araştırılamamaktadır. Son olarak, tipik olarak, tüm kardiyak sinsityum yerine sadece tek hücreler aynı anda incelenir ve bu da sinyal yayılımı hakkındaki bilgileri ele almayı imkansız kılar.
Voltaja duyarlı boyalar, kardiyak aksiyon potansiyellerini ve ilaca bağlı aritmilerin noninvaziv olarak araştırılması için değerlidir8. Hem tek hücreli hem de sinsityum aktivitesinin araştırılmasına izin verirler. Bu yöntemin dezavantajları, aydınlatma sırasında boyaların veya reaksiyon ürününün sitotoksik etkileridir. Akut deneyler için kullanılırlar ve uzun süreli çalışmalar için pek uygulanabilir değildirler 9,10,11. Alternatif olarak voltaja duyarlı proteinler, kullanılabilirlik ve duyarlılık açısından son birkaç yılda önemli ilerlemeler kaydetmiştir, ancak ilgilenilen hücrelerin genetik modifikasyonunu gerektirir ve elektrofizyolojik tekniklere kıyasla yüksek zamansal çözünürlükten yoksundur12.
En son CiPA girişimi13'ten elde edilen bilgiler, MEA'ların kardiyak güvenlik taramalarında alternatif bir elektrofizyolojik yaklaşım olarak yaygın olarak kullanıldığını, çünkü kardiyak fonksiyonu ve güvenlik farmakolojisini araştırmak için güçlü ve köklü bir aracı temsil ettiklerini belirtmektedir. Kardiyomiyositler doğrudan çiplerin üzerine bir sinsityum olarak yetiştirilir ve hücre dışı alan potansiyelleri (FP'ler) substrat entegre mikroelektrotlar aracılığıyla invaziv olmayan bir şekilde kaydedilir. Bu kayıt prensibi, birkaç gün boyunca artan verim taramalarının yapılmasına izin verir, bu da onları kronik etkiler üzerine farmasötik araştırmalar için uygun hale getirir. Ortaya çıkan FP dalga formu, hücre içi AP14'ün bir türevidir. Vuruş hızı, FP'nin başlangıç kısmının genliği ve FP süresi gibi parametrelere kolayca erişilebilir15. FP'nin uzaması ve üçgenleşmesi arasındaki ayrım gibi diğer temel kriterlere (proaritmi 16,17'nin önemli bir belirteci) tekniğin AC filtreleme etkisi nedeniyle erişilemez. Ayrıca, erken ve gecikmiş afterdepolarizasyonlar (sırasıyla EAD ve DAD) gibi diğer küçük proaritmik olayların saptanması, küçük genlikleri nedeniyle genellikle kolayca göz ardı edilir.
Burada kardiyomiyositlerin membranını açarak hücre içi membran potansiyeline erişim sağlamak için bir yöntem tarif ediyoruz. IntraCell cihazı (bundan böyle hücre içi kayıt cihazı olarak anılacaktır), belirli bir fiziksel fenomen (yüzey plazmon rezonansı) yoluyla yüksek oranda odaklanmış bir nanosaniye lazer ışını kullanılarak MEA elektrotlarının üstünde yetiştirilen kardiyomiyositlerin tekrarlanan membran açıklıklarına izin verir18. Sonuç olarak, kayıt normal bir FP'den hücre içi benzeri bir AP'ye (lazer kaynaklı AP, liAP) geçer. Protokol, bunun FP'leri analiz ederek kolayca yakalanamayan dalga formunun kinetik yönlerine erişmeye nasıl izin verdiğini gösterir. Bu yöntem, geleneksel hücre içi yama kelepçesi ve MEA kayıtları arasında bir köprüyü temsil eder. Bu nedenle teknoloji, mevcut kardiyak güvenlik değerlendirme yöntemlerinin güçlü bir uzantısıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well MEA chip</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>7600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>20-139 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>solvent for drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>D-100</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>12037539</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>ALOMONE LABS 
			ISRAEL HEADQUARTERS</td>
			<td>E-500</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific GmbH</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FB Alps version 0.5.005</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>11051407001</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell cardiomyocytes</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntraCell</td>
			<td>Foresee Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CN09.1</td>
			<td>For cleaning of MEA contact pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maintenance Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>#M1003</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Data Tool</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Data export</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC_Rack</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td></td>
			<td>MEA recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA 2100 - 2x60 - system</td>
			<td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td>
			<td>890485</td>
			<td>For MEA-recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>N7634 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>Drug-Measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plating Medium</td>
			<td>FUJIFILM Cellular 
			Dynamics, Inc. (FCDI)</td>
			<td>M1001</td>
			<td>For cell-culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tergazyme</td>
			<td>VWR International, LLC</td>
			<td>1304-1</td>
			<td>cleaning of MEAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-induced action potential-like measurements of cardiomyocytes on microelectrode arrays for increased predictivity of safety pharmacology

Hayatı tehdit eden ilaca bağlı kardiyak aritmiden önce, genellikle küçük proaritmik membran potansiyel dalgalanmalarının eşlik ettiği uzamış kardiyak aksiyon potansiyelleri (AP) görülür. AP'nin repolarize edici fraksiyonunun şekli ve zaman seyri, aritmi varlığı veya yokluğu için çok önemli olabilir.
Mikroelektrot dizileri (MEA), hücre dışı alan potansiyelleri (FP) yoluyla kardiyotoksik bileşik etkilere kolay erişim sağlar. Araştırma ve kardiyak güvenlik farmakolojisinde güçlü ve köklü bir araç olmasına rağmen, FP dalga formu, hücre dışı kayıt prensibi ve bunun sonucunda ortaya çıkan içsel alternatif akım (AC) filtrelemesi nedeniyle orijinal AP şeklini çıkarmaya izin vermez.
Burada tarif edilen yeni bir cihaz, MEA elektrotlarının üstünde yetiştirilen kardiyomiyositlerin zarını, yüksek oranda odaklanmış bir nanosaniye lazer ışını kullanarak, birden fazla yetiştirme zaman noktasında tekrar tekrar açabilir. Lazer porasyon, elektrofizyolojik sinyalin FP'den hücre içi benzeri AP'lere (lazerle indüklenen AP, liAP) dönüştürülmesiyle sonuçlanır ve hücre ötesi voltaj sapmalarının kaydedilmesini sağlar. Bu hücre içi erişim, AP şeklinin daha iyi tanımlanmasını ve proaritmik potansiyellerin normal MEA kayıtlarından daha iyi ve daha hassas bir şekilde sınıflandırılmasını sağlar. Bu sistem, mevcut elektrofizyolojik yöntemlerin devrim niteliğinde bir uzantısıdır ve MEA tabanlı kayıtların tüm avantajlarıyla (kolay, akut ve kronik deneyler, sinyal yayılım analizi vb.) kardiyotoksik etkinin doğru bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

Ekili kardiyomiyositlerden elektriksel aktiviteyi kaydetmek için kullanılan kayıt sistemi, bir ısıtıcı ve bir bilgisayara bağlı karbojen için bir oda ile donatılmış standart bir MEA sisteminden oluşuyordu. Sistem, hücre içi kayıt cihazının üzerine kuruldu ve bu da küçük bir titreşim önleyici ünitenin üzerine monte edildi (Şekil 1A-B).
iPSC kaynaklı kardiyomiyositler 2, çözülmeden sonraki 2-3 gün içinde kendiliğinden atmaya başladı (in vitro, DIV günleri) ve mikroskop altında görülebiliyordu. DIV 4'ten itibaren, atma frekansı düzenli hale geldi ve depolarize edici bileşenin tepeden tepeye genliklerine sahip hücre dışı alan potansiyelleri (FP), MEA yongalarının ilgili kuyucuklarındaki elektrotların çoğunda tespit edilebildi. Elektriksel aktivite, incelenen kuyuların% 95'inden fazlasında tespit edilebilir. DIV 7'den itibaren, hücre ayrılma olasılığı arttı ve bu kuyucukların daha fazla kullanılması imkansız hale geldi.
Lazer kaynaklı membran açıklığını kontrol etmek için kullanılan yazılım, hücre zarının açılmasına aracılık eden lazerin hem gücünü hem de işlem süresini yalnızca incelenen elektrot üzerinde ayarlamaya izin verir (Şekil 1C), oysa ilgili kuyudaki diğer elektrotlar etkilenmez. Çok konservatif ayarlar FP'nin dalga formunu değiştirmezken, çok yüksek ayarlar, kardiyomiyositlerin kuvvetli fakat geçici vuruş veya sinyal kaybı ile belirtilen varsayılan yaralanmasına neden oldu. Hücreler tarafından iyi tolere edilen% 40 güç ve% 25 işlem süresi ayarına ayarlandığında, lazer darbesinin tetiklenmesi, kaydedilen dalga formunda birden fazla değişikliğe neden oldu (örnek bir kayıt için Şekil 1D'ye bakınız). Bu koşullar altında, elektrot malzemesinde makroskopik olarak herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Kaydedilen sinyal genliği büyük ölçüde 4.1 ± 0.41 (n = 20, aralık 1.34-8.83) kez artmış, rastgele seçilmiş bir kayıt alt kümesinden analiz edilmiş ve 7 ila 22 mV arasında genliklerle sonuçlanmıştır. Ayrıca, dalga formu, başlangıçta hızlı, bifazik ve geçici voltaj sapması ile standart bir FP şeklinden, ardından taban çizgisinde bir plato fazı ve FP'nin sonunu gösteren küçük bir sapmadan, hızlı bir yükseliş, genişletilmiş depolarize plato fazı ve taban çizgisinin altında bir alt uç ile hücre içi olarak kaydedilmiş bir AP'ye daha yakın olan bir şekle dönüştü (Şekil 1E ). Bu voltaj sapmalarını lazer kaynaklı AP (liAP) olarak tanımladık. Çoğu durumda, geçiş geçiciydi ve en azından 5 dakika içinde kısmen tersine çevrildi. Kardiyak sinsityum içindeki sinyal yayılımı, liAP indüksiyonundan sonra değişmeden kalmıştır (Şekil 2), kalan sinsityumun lazer darbesinden kaynaklanan potansiyel hasardan etkilenmediğini göstermektedir.
Hücre içi olarak kaydedilen AP'lere benzerlikler, FP'ler tarafından erişilemeyen liAP parametrelerinin çıkarılmasına izin verdi (örnek parametreler için bkz. örneğin, Şekil 3A), en belirgin şekilde liAP'nin süresinin belirli zaman noktalarında ölçülmesine (örneğin,% 20,% 50 ve% 90'da) (Şekil 3B), AP'lerin tanımı için yaygın olarak kullanılan APD20/50/90'a benzer.
Daha sonra lazerle açılan kardiyomiyositlerin yaygın olarak kullanılan kardiyoaktif farmakolojik alet bileşiklerine tepkisini test ettik. Örnek bir protokol tasarımı Şekil 3C'de bulunabilir. LiAP'nin dönüşümü tüm deney boyunca her zaman devam etmediğinden, bileşik uygulaması, toplam kayıt süresini azaltmak için kümülatif bir şekilde değil, kuyu başına tek bir konsantrasyon olarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, test bileşiğini uygulamadan önce hücreleri yeniden açmak veya başka bir elektrot alanı açmak gerekiyordu.
Spesifik L-tipi Ca 2+ kanal blokeri Nifedipin23,24'ün eklenmesi, liAP'nin plato fazını konsantrasyona bağlı bir şekilde azaltmış ve böylece tüm liAP'yi kısaltmıştır (Şekil 4A, B). Bu kısaltma, manipüle edilmemiş elektrotlardan kardiyomiyositlerin FP'lerinden elde edilen analizle karşılaştırılabilir (Şekil 4C), bu kayıt yönteminin klasik FP kayıtlarına kıyasla olumsuz etkileri olmadığını göstermiştir.
E4031, ilgili Kv1.11 (hERG) potasyum kanalı25'in repolarizasyonunu inhibe eder ve artan konsantrasyonlarda kardiyomiyositlerin aritmik davranışına yol açar. FP kayıtlarından elde edilen analize benzer şekilde, E4031 liAP süresini konsantrasyona bağlı bir şekilde arttırmıştır (Şekil 5). Ek olarak, 0.01 μM ve daha yüksek konsantrasyonlarda, liAP'nin sonundaki küçük pozitif voltaj sapmaları görülebiliyordu. Bu sapmalar, FP'lerin aksine, daha yüksek konsantrasyonlarla daha belirgin hale geldi ve bu sapmaların neredeyse görünmez olduğu geçici yeni bir depolarizasyona işaret etti (bkz. Şekil 5B-C, üst (FP) ve alt (liAP) izler). Bu davranış erken afterdepolarizasyon (EAD) olarak bilinir. 0.1 μM'lik en yüksek konsantrasyonda, bu EAD'ler zamanla erken aksiyon potansiyelleri olan ektopik atımlara yükseldi (Şekil 5C). Hem EAD hem de ektopik atımlar proaritmik aktivitenin anahtar göstergeleridir. Şekil 5D'de gösterilen örneğin sonunda, elektriksel aktivite aritmik dayak ile sonuçlandı. Ayrıca, FP ve liAP kayıtları arasında görüntülenen konsantrasyon-tepki-ilişkileri eşleşiyordu (Şekil 5E). Bununla birlikte, FP verilerinde, test bileşiğinin daha yüksek konsantrasyonlarında FP'lerin zayıf repolarizasyon bileşeninden kaynaklanan daha önemli bir değişkenlik vardır. İPSC türevi kardiyomiyositlerin2'nin karakteristik doğasının, kontrol koşulları altında da fizyolojik olmayan uzun AP'ler üretme eğiliminde olduğu görülmektedir (AP süreleri 700 ms'>). MEA sistemi, içsel bir 0.1 Hz AC filtreleme uyguladı, bu da liAP'nin kısmen filtrelenmiş bir şekliyle sonuçlandı, ancak altta yatan AP'nin başlangıcı ve sona ermesi hakkındaki nitel bilgileri engellemeden.
Proaritmik voltaj sapmalarının ilk oluşumunun, FP kayıtlarına kıyasla liAP'lerde daha düşük konsantrasyonlarda tespit edilebileceği ortaya çıktı. Şekil 6'da gösterilen, Dofetilide uygulaması sırasında elektriksel aktivitenin 3 μM'lik bir konsantrasyonda kaydedilmesidir. Kayıt aynı kuyuda elde edildi. Hem FP hem de liAP yaklaşık 2 sn süre göstermesine rağmen, FP dalga formu göze çarpmayan bir yapıya sahipti ve düzenli olarak yeniden polarize edici sapmalar sunuyordu. Aynı zamanda, liAP'lerin sonunda, farklı büyüklüklerde EAD'ler görünür hale geldi. İlgili güvenlik-farmakolojik duyarlılıktaki bu artış, yüzey plazmon rezonansı tarafından indüklenen liAP'lerin repolarize fazın kalifikasyonunun iyileştirilmesine izin verdiği ve böylece incelenen test bileşiklerinin etki şekli hakkında daha fazla bilgi edinilmesine yardımcı olduğu bulgusunu daha da desteklemektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> Şekil 1: Hücre içi kayıt kurulumu ve örnek kayıtlar . (A) Kuruluma genel bakış. (B) Açık MEA kayıt amplifikatörü ile kayıt sisteminin üstten görünümü. (C) Sağ tarafta sanal MEA haritası bulunan başlatma yazılımı. 1: titreşim önleyici tablo, 2: hücre içi kayıt sistemi, 3: lazer koruma kapağı, 4: nemlendirilmiş karbonhidrat odası, 5: MEA ısıtma sistemi, 6: MEA arayüz kartı, 7: Kayıt amplifikatörünün içindeki 1 kuyucuklu MEA çipi. (D) LiAP'lerin indüksiyonundan önce ve sonra bir elektrottan örneklerin kaydedilmesi. Üst: yaklaşık 6 dakikalık kayıt. Noktalı çizgiler, altta gösterilen genişletilmiş alanları işaretler. (E) Büyütülmüş FP (üstte) ve liAP (altta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> Şekil 2: Sinyal yayılım paterni liAP indüksiyonundan sonra korunmuş olarak kalır. Sinsityum içindeki uyarma dalgasının sinyal yayılımının yanlış renk kodlaması. Mavi erken gösterir (-4 ms'den başlayarak); kırmızı, renk çubuğuyla gösterildiği gibi E54 referans elektrodunda elde edilen sinyalden gelen geç zaman noktalarını (+3 ms) gösterir. Sinyal, elektrot dizisinin sağ üst köşesinden sol alt kısmına doğru hareket eder. (A) LiAP indüksiyonundan önce, (B) liAP indüksiyonundan 1 dakika sonra. (C) liAP indüksiyonundan 4 dakika sonra. Flaş sembolü, elektrot 64'teki lazer indüksiyon noktasını gösterir. Genel yayılma yönünde hiçbir fark görünmediğini unutmayın. Siyah dikdörtgenler geçersiz verileri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> Şekil 3: FP/liAP parametre tanımı ve kayıt protokolü . (A) Klasik FP'den çıkarılabilen parametreler. (B) LiAP'lerden elde edilebilecek ek parametreler. (C) İlaç ölçümünün zaman çizelgesi. Soldan sağa: 60 s için kontrol kaydı, liAP indüksiyonu, 60 s için liAP kaydı, ilaç uygulaması, yıkama süresi 300 s, liAP'nin yeniden indüklenmesi, 60 s için liAP <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">kaydı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> Şekil 4: Nifedipin, kardiyak liAP'yi konsantrasyona bağlı bir şekilde kısaltır. (A) Üst: FP kontrollerde (mavi) ve 0.3 μM Nifedipin varlığında (kırmızı) izler. İzler, daha iyi görselleştirme için y ekseni ofseti ile görüntülenir. Alt: liAP, aynı MEA kaydından izler ve bu da liAP'nin kısalmasına ve vuruş hızındaki artışa neden olur. (B) Kontrol sırasında tek liAP'lerin süperpozisyonu (mavi) ve farklı konsantrasyonlarda Nifedipin (kırmızı) uygulanması. a: 0.01 μM, b: 0.1 μM ve c: 0.3 μM. LiAP süresinin artan konsantrasyonlarla kısalmasına dikkat edin. (C) FP (siyah) ve liAP (kırmızı) kayıtlarından elde edilen sinyal genişliğinin konsantrasyon-tepki ilişkisi. Veriler n = 3 deneyden alınmıştır ve kontrol etmek için normalleştirilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> Şekil 5: E4031 (pro-) aritmik davranışı indükler. (A) FP (üstte) ve liAP (altta) kontrol koşullarında. (B-C) FP'ler ve liAP'ler, E4031 (0.1 μM) uygulandıktan sonra farklı zaman noktalarında kaydedildi. 80 saniyeden sonra, ilk EAD'ler liAP'nin sonunda görünür (B; kırmızı okla işaretlenmiştir). EAD'ler, test bileşiğinin (C) varlığında 320 s'den sonra ektopik atımlara dönüşür. (D) 530 sn sonra, kardiyak sinsityum taşikardik bir duruma girer. LiAP kaydından tasvir edilen iz. (E) FP (siyah) ve liAP (kırmızı) genişliğinin konsantrasyon-tepki ilişkisi. n = 4 deneyden elde edilen veriler, kontrol için normalleştirilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> Şekil 6: Proaritmik olayların tespiti liAP'lerde FP'lerden daha hassastır . (A) FP kaydı ve (B) 3 μM Dofetilide uygulaması sırasında aynı kuyu içinde liAP kaydı. Bazı liAP'lerin sonunda, EAD'ler algılanabilir olsa da, FP kayıtlarında keşfedilemez kalırlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology at JoVE.com

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

Lazer porasyon ve mikroelektrot dizilerinin (MEA) kombinasyonu, ekili birincil ve kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin aksiyon potansiyeli benzeri kayıtlarına izin verir. Dalga formu şekli, test bileşiklerinin hareket tarzı hakkında standart kayıtlardan daha üstün bir fikir verir. Gelecekte kardiyo güvenliği araştırmalarını daha da optimize etmek için yama kelepçesi ve MEA okumasını birbirine bağlar.

Güvenlik Farmakolojisinin Artan Predivititesi için Mikroelektrot Dizileri Üzerindeki Kardiyomiyositlerin Lazerle İndüklenen Aksiyon Potansiyeli Benzeri Ölçümleri

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

Bu yöntem, geleneksel MEA'lara hücre içi benzer aksiyon potansiyellerinin kaydedilmesini sağlar, böylece AP şeklinin daha iyi tanımlanmasına ve pro-aritmik potansiyellerin daha hassas bir sınıflandırmasına izin verir. Tipik alan potansiyeli kayıtlarıyla karşılaştırıldığında, hücre içi benzer gerçek potansiyel şekil, altta yatan iyon kanallarının kesin olarak yetkilendirilmesi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Kök hücre teknolojisi ile klinik hastalardan elde edilen kardiyomiyositlere uygulandığında, yöntem nedensel tanıya ve C RRP'nin kişiselleştirilmesine katkıda bulunabilir ve aritmiler gibi kalp hastalıklarını teknisyenimiz Karin Gebhardt kardiyomiyosit yetiştiriciliğini gösterecektir.Daha önce otoklavlanmış MEA'ların elektrot alanlarını kaplamaya başlamak için, laminer akış başlığının altında 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak fibronektin ile Dropwise. Ozmotik şoku azaltmak için, kaplama çözeltisini 90 saniye boyunca damla damla dökülerek thawd kardiyomiyositler içeren 50 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpe yavaşça sekiz mililitre kaplama ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu dikkatlice karıştırın.10 mililitrelik bir pipet kullanarak, peleti atmadığınızdan ve hücre numarasını son konsantrasyona ayarladığınızdan emin olarak süpernatanı çıkarın. Hücre oturmadan önce, uygulanan kaplama çözeltisini 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak MEA elektrot alanından çıkarın. Kaplama tohumunun kurumasını önlemek için, her ikisi için elektrot alanlarına damla damla dört mikrolitre hücre ekleyerek hücreleri derhal ekler, altı kuyu MEA ve bir kuyu M E A.Now, hücrelerin 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuyucuklara yapışmasına izin verir ve% 5 karbondioksit.Laminer akış başlığının altında, sırasıyla altı Kuyu MEA ve tek kuyu MEA için 37 santigrat dereceye ısıtılmış 200 mikrolitre ve bir mililitre steril kaplama ortamı ekleyin. MEA kayıtları için, MEA sistemini, MEA çip tutucusu objektif deliğin üzerine ortalanmış olarak cihazın üzerine yerleştirin. Ardından, MEA kurulumunu konumlandırarak lazerin elektrotlara odaklanmasına izin verin, böylece hedef doğrudan MEA sisteminin deliğinin altında olur.Hücrelerin mekanik rahatsızlıktan kurtulmasına izin vermek için, MEA çipini ekili hücrelerle birlikte inkübatörden kayıttan 15 dakika önce MEA kurulumuna aktarın. Daha sonra, gürültü seviyelerini azaltmak için bir izopropanol çubuk kullanarak temas pedlerini ve pimlerini dikkatlice temizleyin. MEA'yı MEA kurulumuna dikkatlice yerleştirin ve altı kuyucuklu MEA çipini seri numarası sağ tarafta görünecek şekilde veya referans elektrodu solda olacak şekilde tek bir kuyucuklu MEA yongasını konumlandırın.Şimdi, MEA sistemi entegre ısıtmasını 38 santigrat dereceye ayarlayın. Entegre emniyet şalteri lazerin etkinleştirilmesine izin verdiği için cihazın kapağını kapatın, kapak MEA çipi üzerinden kapalıysa. MEA yapılandırma programını kullanarak, yüksek geçişli ve düşük geçişli MEA sistem filtresini sırasıyla 0,1 hertz veya daha az ve 3.500 hertz'e ayarlayın.Kayıt için MC raf yazılımını veya herhangi bir alternatif yazılımı kullanın. Giriş aralığını denemeye göre ayarlayın. Sinyalin amplifikatörü ve örnekleme hızını doyurmadığından emin olmak.Kaydı kontrol etmek için yazılımın uzun vadeli görüntüleme işlevini kullanın. MEA çipini MEA kurulumuna yerleştirdikten ve yazılımı kurduktan sonra FB ALP yazılımını kullanarak lazer mekaniğini başlatın. Şimdi, başlatma düğmesine tıklayın.Başlatmanın sonunda, sanal lazer noktası sırasıyla altı kuyulu bir MEA için D kuyusunda ve tek bir kuyu MEA için sol altta olacaktır. Ardından, kontrol tuşunu bir fare tıklamasıyla kullanarak sanal lazer noktasını D beş elektrodunun ortasına taşıyın ve kontrol tuşunu basılı tutarak ve fare tekerleği ile kaydırarak odağı ayarlayın. Alternatif olarak, otomatik odaklama işlevini kullanın.P one düğmesine basın ve sanal lazer noktası otomatik olarak kuyuya doğru hareket edecektir F.Sistem şimdi hizalanmış. Lazer gücünü ve işlem süresini deneysel gereksinimlere göre ayarlayın. Lazeri etkinleştirmek için, lazer açık olarak görünecek olan lazer kapatma düğmesine tıklayın, Kayıt yazılımına geçin.Bir dosya adı seçin ve ölçümü kaydetmek için kırmızı kayıt düğmesine ve ardından pencerenin üstündeki oynat düğmesine tıklayın. Hücreleri lazerle açmadan önce 60 saniye boyunca bir taban çizgisi kaydedin. Başlatma yazılımına geri dönün ve yazılım penceresinin sağ tarafındaki sanal haritada lazer tarafından dışlanacak elektrotları devre dışı bırakın.Lazeri başlatmak için Alt fare tıklamasını kullanın ve bu kuyucuğun orta elektrodunu seçin. Bu, lazeri bu kuyunun her elektrodundaki hücreleri otomatik olarak açmaya başlatır, seçilen bu kuyunun daha önce aktive edilmiş tüm elektrotlarını açmak için her kuyucuk için tekrarlayın. Nifedipin E-40 31'in milimolar konsantrasyonunu ve Dofetilid'i önce DMSO'da çözün, sonra da istenen konsantrasyonun 10 katına kadar tam bir ortamda çözün.Kuyuda% 0.1'lik son DMSO konsantrasyonunu asla aşmayın. Temel etkinliği 60 saniye boyunca kaydedin. Lazer kaynaklı perasyonu daha önce gösterildiği gibi başlatın, bu da FPS'nin liAP'lere dönüşmesiyle sonuçlanır.Tüm ilaçları kuyu başına tek konsantrasyon olarak uygulayın. Sırasıyla altı kuyu ve tek kuyu MEA'larından kuyu başına 20 mikrolitre ve 100 mikrolitre ortam çıkarın. Kuyuya ölçülecek ilaç stok çözeltisinden 20 mikrolitre veya 100 mikrolitre ekleyin.MEA tipine bağlı olarak ve iki ila üç kez yukarı ve aşağı dikkatlice pipetleyin. Bileşiklerin 300 saniye boyunca yıkanmasına izin verin. Bu süre zarfında, liAP şekli FP şekline dönüşebilir.Yine, indüklenen lazer kaynaklı perasyon ve liAP üzerinde olası bileşik kaynaklı kusurları 60 saniye daha kaydedin. Nifedipin ilavesi, liAP'lerin plato fazını konsantrasyona bağlı bir şekilde azalttı ve böylece tüm liAP'yi kısalttı. Bu kısaltma, manipüle edilmemiş elektrotlardan kardiyomiyositlerin alan potansiyelleriyle karşılaştırılabilirdi.E-40 31, ilgili KV bir nokta 11 potasyum kanalının repolarizasyonunu inhibe etti ve kardiyomiyositlerin artan konsantrasyonlarda aritmik davranışına yol açtı. Ayrıca, E-40 31 liAP süresini konsantrasyona bağlı olarak arttırdı. LiAP'nin sonunda, 0.1 mikromolar'da küçük pozitif voltaj sapmaları gözlendi ve bu da EAD'ler adı verilen geçici yeni bir depolarizasyona işaret eden daha yüksek konsantrasyonlarla daha belirgin hale geldi.0.1 mikromolar'ın en yüksek konsantrasyonunda, bu EAD'ler zamanla ektopik atımlara yükseldi. Bunlar erken aksiyon potansiyelleridir. EAD ve ektopik atımlar, profesyonel aritmik aktivitenin temel göstergeleridir.Ve sonunda, elektriksel aktivite aritmik dayak ile sonuçlanır. Konsantrasyon yanıtı ilişkileri FP ve liAP kayıtlarıyla korelasyon gösterdi. Ayrıca, dofetilid varlığında, hem FP hem de liAP aynı kuyu içinde yaklaşık iki saniyelik süreler gösterdi, FP dalga formu düzenli repolarizasyon sapmaları sundu.LiAP'de iken EAD'ler tespit edilebilir. Odak dışı mikroskop görüntüsü hücrelerin açılmasını etkileyebileceğinden, her melomen önce odağı ayarlamak önemlidir. Ayrıca, analiz için opterperasyonun kullanılması gerektiğinden kısa bir süre sonra aksiyon potansiyeli alınır.Bu teknik, standart MEA'ya kıyasla önceki aritmik etkileri tespit etmede daha hassastır ve olumsuz bileşik etkilerin daha kesin olarak tespit edilmesini sağlar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Femoral Arterial and Venous Catheterization for Blood Sampling, Drug Administration and Conscious Blood Pressure and Heart Rate Measurements

Kan Örnekleme, İlaç İdaresi ve Bilinçli Kan Basıncı ve Nabız ölçümleri Femoral Arter ve Venöz Kateterizasyon

In multiple fields of study, access to the circulatory system in laboratory studies is necessary. Pharmacological studies in rats using chronically ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Görme Kusurları karakterize Kronik Oküler Hipertansiyon bir Lazer-kaynaklı Fare Modeli

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Detection of Disease-associated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated ÃƒÅ½Ã‚Â±-synuclein

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Lazer kaynaklı Koroid Neovaskülarizasyonlarında A Fare Modeli

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

Bir insan Kadavra formaldehit sabit modeli kullanarak Neocortical elektrot dizilerin implantasyonu için cerrahi eğitim

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

İnsan rahim düz kas yardım ilaç geliştirme için contractility ölçümleri

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Mikroelektrot Impalement yöntemi bir kanüle orta serebral arter membran potansiyelini kaydetmek için

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

Böbrek Atardamarı Ile Böbreğe Doğrudan İlaç Verilmesi

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...