Name: determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms
Uploaded: 2022-09-28T13:50:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

AHR anerkender finansieringsstøtte fra Majlis Amanah Rakyat (MARA).

BEMÆRK: Denne protokol er skrevet til BSL 1 eller 2; for BSL 3-arbejde skal du udføre hele protokollen inde i et klasse 3 biosikkerhedsskab (handskerum).
1. Forberedelse af insekter
<ol><li>Forbered to tomme mygbure (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) med 12 cm ærmeåbninger (figur 1). Før du fortsætter med forsøgene, skal du sikre dig, at der ikke er huller eller anden skade på mygburene.</li>
	<li>Ved hjælp af en mekanisk aspirator (en simpel pooter med et opsamlingskammer) overføres 30 insekter (f.eks. Aedes aegypti myg; her blev kvinder 3-5 dage efter fremkomsten brugt) til et separat bur for lettere håndtering og bortskaffelse efter eksperimentet. BEMÆRK: I alt 30 insekter pr. eksperiment foreslås, da det er let at styre og tælle uden stor risiko for myggeflugt. Antallet af anvendte insekter kan justeres, så det passer til formålet med eksperimentet.</li>
</ol>2. Opsætning af to-kammerapparater
<ol><li>Indstil inkubatorerne til de ønskede temperaturer i henhold til inkubatorproducentens anvisninger.</li>
	<li>Lad inkubatorerne varme op og stabilisere sig ved de specifikke temperaturer, hvilket er <30 minutter for temperaturer i området 25-30 °C. Kontroller lufttemperaturen i inkubatoren med en temperatursonde for at sikre, at inkubatoren er indstillet til den tilsigtede temperatur.</li>
	<li>Placer et tomt mygbur i hver inkubator (figur 2A).</li>
	<li>Foder burets ærmer gennem inkubatorens forreste hul. Forbered et oplukkeligt dæksel (klap) med gaffatape og læg det over hullet i akrylrøret (figur 2B).</li>
	<li>Indsæt akrylrøret i muffen på et bur oven på inkubatorhullet. Rørets diameter er større end hullet foran på inkubatorerne, så det helt dækker hullet.</li>
	<li>Spænd ærmets maske rundt om røret med et gummibånd eller genanvendeligt kabelbånd (figur 2C). Sørg for, at akrylrøret ikke er løst og dingler mellem inkubatorerne; Hvis det er tilfældet, skal du trække i burærmerne for at fjerne overskydende materiale mellem buret og elastikken.</li>
	<li>Placer begge inkubatorer mod hinanden og gentag trin 2.5 og 2.6 med ærmet på den anden inkubator. Begge bure er nu sikkert forbundet gennem akrylrøret (figur 2D).</li>
</ol>3. Myggestik
<ol><li>Åbn gaffatapeklappen til myggestik. Placer en tragt i hullet. Tøm insekterne i tragten, der er anbragt i akrylrøret. BEMÆRK: Hvis det ønskes/kræves: For myg skal du bruge en CO2 -pen til at slå alle myg ud, før du placerer dem i tragten21; for Drosophila, brug is til at slå insekter ned22.</li>
	<li>Fjern tragten, og dæk hullet i røret med gaffatapeklappen. Lad i 30 minutter for insekter at vælge det foretrukne kammer. BEMÆRK: Hvis der blev brugt CO2 eller is, skal du trykke let på rørbroen for at vække insekterne efter et par minutter.</li>
</ol>4. Myg tæller
<ol><li>Efter 30 minutter skal du visuelt observere og skrive ned, hvor mange insekter der blev fundet i broen (akrylrøret).</li>
	<li>Tryk/blæs insekterne i broen til hver side af kuvøsen. Optag for at trække fra det samlede antal insekter senere. OBS: Slå alle 30 insekter ud i apparatet ved at frigive CO 2 i broen (brug CO2 til alle insekter, da is ikke slår insekter ned i burene). Vær også opmærksom på antallet af insekter i broen, der flyver til hver side af inkubatoren.</li>
	<li>Klem og luk ærmerne fra akrylrøret på begge sider, fastgør hurtigt med en knude for at lukke burene, og sørg for, at elastikken stadig er intakt for at forhindre insekter i at slippe ud.</li>
	<li>Fjern burene fra inkubatoren, og tæl visuelt insekterne i hvert bur (træk antallet af insekter fra broen, hvis det er nødvendigt).</li>
	<li>Gentag trin 4.4 med det andet bur. Sørg for, at tallene fra de to inkubatorer og broen tilføjer op til 30 (eller antallet af anvendte insekter, hvis forskellige).</li>
	<li>Hvis tallene ikke stemmer overens med det samlede antal insekter, der blev brugt i trin 1.2, skal du kigge efter de resterende insekter i burærmet.</li>
</ol>5. Replikering
<ol><li>Når du udfører eksperimenter, skal du sørge for at tage højde for mulige eksterne forstyrrelser, såsom lysretning, omgivende lugte osv. For eksempel ved at vende burene, inkubatororientering og kombinationer mellem replikater.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wright, R. K., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+ectotherm+immune+responses.">Temperature effects on ectotherm immune responses.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).</li><li>Deal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature+preferendum+of+certain+insects.">The temperature preferendum of certain insects.</a> The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).</li><li>Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+geographical+distribution+of+the+mosquito,+Culex+pipiens,+in+Canada+under+climate+change.">Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change.</a> Applied Geography. 33, 53-62 (2012).</li><li>Beck-Johnson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+temperature+fluctuations+in+understanding+mosquito+population+dynamics+and+malaria+risk.">The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk.</a> Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).</li><li>Erraguntla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+model+for+microclimatic+temperature+and+its+use+in+mosquito+population+modeling.">Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling.</a> Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).</li><li>Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+effects+of+temperature+on+mosquito+and+parasite+traits+that+determine+the+transmission+potential+of+human+malaria.">Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria.</a> PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+symbiont-dependent+host+detoxification+metabolism+contributes+to+increased+insecticide+susceptibility+of+insects+under+high+temperature.">Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature.</a> The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).</li><li>Amarasekare, P., Savage, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+elucidating+the+temperature+dependence+of+fitness.">A framework for elucidating the temperature dependence of fitness.</a> The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).</li><li>Buckley, L. B., Nufio, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevational+clines+in+the+temperature+dependence+of+insect+performance+and+implications+for+ecological+responses+to+climate+change.">Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change.</a> Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).</li><li>MacLean, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+preference+across+life+stages+and+acclimation+temperatures+investigated+in+four+species+of+Drosophila.">Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila.</a> Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).</li><li>Casta&#241;eda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+potential+of+thermal+preference+and+heat+tolerance+in+Drosophila+subobscura.">Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).</li><li>Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+Mediterranean+fruit+flies+prefer+warmer+temperatures+that+improve+sexual+performance.">Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance.</a> Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).</li><li>Sayeed, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetics+of+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila.">Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).</li><li>Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+preferences+of+subtropical+Aedes+aegypti+and+temperate+Ae.+japonicus+mosquitoes.">Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes.</a> Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).</li><li>Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+analysis+of+the+locomotory+behaviour+of+Aedes+aegypti+and+Ae.+japonicus+mosquitoes+under+different+temperature+regimes+in+a+laboratory+setting.">Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting.</a> Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).</li><li>Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+behaviour+of+Anopheles+stephensi+in+response+to+infection+with+malaria+and+fungal+entomopathogens.">Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens.</a> Malaria Journal. 8, 72 (2009).</li><li>Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+anomalies+in+the+growth+of+selected+bacteria.">Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria.</a> Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).</li><li>Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+thermal+behavior+in+smaller+insects:+A+case+study+in+Drosophila+melanogaster+demonstrates+effects+of+sex,+geographic+origin,+and+rearing+temperature+on+adult+behavior.">Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior.</a> Fly. 10 (4), 149-161 (2016).</li><li>Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+modifies+thermal+preference+in+Drosophila+melanogaster.">Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).</li><li>Reinhold, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specificity+in+thermopreference+and+CO2-gated+heat-seeking+in+Culex+mosquitoes.">Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes.</a> Insects. 13 (1), 92 (2022).</li><li>Lin, C. S., Georghiou, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+mosquito+larvae+and+pupae+to+carbon+dioxide+anesthesia.">Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia.</a> Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).</li><li>Ito, F., Awasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+temperature+preference+behavior+and+effects+of+temperature+on+daily+behavior+in+11+Drosophila+species.">Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).</li><li>Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Scientific Reports. 5, 15298 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Undersøgelsen beskriver en ny metode til at observere temperaturpræferencen hos myg. I denne metode frigives myg i et rør, der er forbundet med to inkubatorer med uafhængigt kontrollerbare temperaturer. På denne måde får myggene lov til frit at vælge mellem to temperaturer uden at forstyrre deres naturlige adfærd og mekanisme til at udtrykke dette valg (f.eks. Flyvning).
Vores første repræsentative eksperiment brugte myggens optimale temperatur på 27 °C i begge kamre. Under gentagelserne af dette eksperiment blev myg observeret at flyve frit mellem begge bure i hele 30 minutter, og i alle replikater var der næsten lige mange i hvert af de to kamre. Dette bekræftede den eksperimentelle hensigt om at give myggene mulighed for frit at vælge mellem bure, mens de udviser deres naturlige adfærd (flyvende). Omvendt udnyttede det andet repræsentative eksperiment den attraktive optimale temperatur på 27 °C i det ene kammer og en suboptimal og dermed frastødende temperatur på 30 °C i det andet kammer. Som forventet valgte myg konsekvent det optimale temperaturkammer med høj betydning, selv når vi byttede inkubatorerne for at undgå bias.
Vi testede også opsætningen for et andet insekt, D. melanogaster (frugtfluer), der repræsenterer en anden ektotermisk modelorganisme. Det ene kammer blev indstillet til den optimale temperatur på D. melanogaster, 25 °C, og det andet blev indstillet til 3 °C højere, 28 °C. I lighed med myg favoriserede bananfluer også deres optimale temperatur og undgik det varmere kammer. Dette viser, at protokollen er velegnet til en række ektotermer.
Beskrivelse af kritiske trin i protokollen Det vigtigste kritiske trin i protokollen er insekthåndtering, da det genererer muligheden for, at insekter undslipper. Dette kan forhindres ved at fastslå, at der ikke er huller, der er store nok til flugt i de anvendte bure, at de elastikker/kabelbindere, der bruges til at fastgøre netmufferne til broen, er stramme, og at dækslet til insektindføringshullet på broen er sikkert fastgjort og forseglet.
Det er også afgørende at sikre, at insekter ikke undslipper før eller efter forsøget, især når insekterne er nødvendige for nedstrøms eksperimenter eller senere tidspunkter for forskellige temperaturvalg. Dette kan gøres ved at bedøve insekterne, inden de placeres i akrylbroen (ved hjælp af is til Drosophila og CO 2 til myg) og frigive CO2 i broen for at slå insekterne ned efter forsøgene, inden de beregnes. Brugen af CO2 er ideel til myg, da det ikke påvirker adfærdsresultaterne21. Hos fluer kan eksponering for CO2 ændre deres flyveadfærd23, og det anbefales derfor at bruge is22.
Tælling af insekter er også et kritisk skridt for at sikre, at antallet af insekter er ens før og efter eksperimentet for nøjagtige resultater. For at gøre dette anbefaler vi brugen af en CO2 -pen, når eksperimentet er afsluttet for at slå ned de insekter, der er placeret i broen. Dette vil hjælpe med at flytte insekterne til hver side af kammeret og dermed reducere antallet af undslupne. Vi fremhæver også i protokollen, at insekter kan fanges i burets ærmer under burseparation; Sørg derfor for, at disse kontrolleres grundigt under tællingen.
Potentielle ændringer og fejlfinding af teknikken Den største vanskelighed ved denne teknik er burærmernes fleksible net, hvilket resulterer i huller eller skjulesteder og dermed insektflugt eller fangst. Der er nogle potentielle ændringer, hvis det er nødvendigt, for at forbedre teknikken. Vi foreslår at bruge to eller flere elastikker for at sikre, at broen er fastgjort ordentligt mellem kamrene uden at efterlade noget potentielt rum til insekterne (løst net skaber et skjulested for insekter). Vi anbefaler også, at man er særlig opmærksom på at trække netbøsningen stramt, som beskrevet i trin 2.6, når apparatet samles.
Små formfaktorinkubatorer opvarmes normalt kun (dvs. har ingen aktiv afkøling), som det var tilfældet for de inkubatorer, der anvendes her. Derfor vil brug af temperaturer omkring eller under den omgivende stuetemperatur kræve, at eksperimentet udføres i et koldt rum for at sikre, at de temperaturer, der er indstillet til inkubatorerne, bliver så lave som ønsket.
Derudover kan denne opsætning også bruges til BSL 3, hvor der er behov for et klasse tre biosikkerhedsskab (handskerum). I dette tilfælde skal handskerummet være stort nok til at passe til hele apparatet. Eksperimentet beskrevet i denne protokol er ideelt til eksperimenter i et handskerum, fordi alt, hvad der kræves, vil være indeholdt i handskerummet, og vigtigst af alt er muligheden for, at insekter slipper ud, minimal.
Endelig er der plads nok i inkubatorerne til at tilføje eksternt lys eller en fugtighedskilde uden at påvirke insekterne i burene. Afhængigt af insektarten eller det eksperimentelle design kan en LED-lampe med 1 cm tykkelse let placeres oven på buret inde i en eller begge inkubatorer. At give lys til begge og tilbyde et temperaturvalg kan være en mere realistisk protokol for nogle lysfølsomme eksperimentelle designs, eller kun at give lys (eller fugtighed) til et kammer er en mulig ændring af protokollen for at vurdere valg af lys / fugtighed.
Fordele ved denne teknik i forbindelse med dual choice temperaturpræferenceassays Metoden beskrevet her præsenterer et alternativ til den traditionelle temperaturgradientmetode beskrevet i tidligere undersøgelser10,13,14,16. I de fleste af disse undersøgelser anvendes en stor vandret aluminiumsblok med en termisk gradient, mens mekanismen til generering af denne gradient varierer, herunder opvarmnings- / køleblokke, vandbad osv. I disse tilfælde produceres temperaturgradienten på overfladen af aluminiumsblokken (snarere end lufttemperaturen i et bur). Derfor begrænser de fleste (men ikke alle) alternative teknikker insekternes flyveevne mere end denne protokol. Her kan insekter flyve relativt frit mellem bure, hvilket giver mulighed for et mere realistisk udtryk for naturlig adfærd efter eget valg. Det ville endda være muligt at opskalere dette eksperimentelle apparat ved hjælp af større bure og inkubatorer, for eksempel til større insekter.
Ud over den naturlige adfærdsfordel demonstrerer vi også meget høj temperaturensartethed i de to kamre, hvilket muliggør enkel scoring og et klart udvalg af to store enkelttemperaturkamre. Brugen af et binært stort kammerdesign som dette kan reducere støj i dataene, hvor for eksempel på et gradientapparat enhver tilfældig bevægelse af insekterne vil ændre positionen på gradienten og dermed deres opfattede temperaturpræference.
Teknikken beskrevet her er også meget enkel og billig. Denne teknik behøver ikke ekstra apparater til at indstille temperaturerne (dvs. et vandbad10 og / eller en kogeplade 11, 12, 13, 14, 15), intet specialudstyr udover et skåret akrylrør og borede huller og intet kamera 18,19 eller sofistikeret software 19 til analyse. Sådanne komponenter, der anvendes i andre teknikker, kan være dyre og/eller kræve betydelig ekspertise og test for at starte eksperimenter.
Denne teknik kan også replikeres med forskellige enheder, der bruger batterier, hvis der ikke er nogen ekstern strømforsyning, hvilket gør systemet ideelt til at udføre eksperimenter i marken. Desuden kan det samme apparat ændres lidt for at studere andre binære valgpræferencesituationer, såsom lys versus mørk, høj / lav luftfugtighed osv., Enten i laboratoriet eller marken.
Apparatet i fuld størrelse i protokollen er betydeligt mindre end temperaturgradientopsætninger, hvilket giver mulighed for en lettere pasform inde i et BSL 3 handskerum som beskrevet ovenfor. Desuden er insekterne lettere at dæmme op for, da de kan slås ned med CO2 i slutningen af forsøget, og burene kan hurtigt lukkes igen efter adskillelse fra broen. Disse indeslutningsfordele er ideelle til BSL 3-arbejde.
Vi anerkender dog, at vores apparat kun tillader en binær beslutning snarere end et frit valg langs en gradient, som afhængigt af applikationen kan kræve yderligere kørsler for at identificere optimale temperaturer.

Organismer kan kun leve og reproducere inden for deres termiske toleranceområde. Da miljøtemperaturen varierer på grund af årstider, der ændrer sig og global opvarmning, skal arterne tilpasse sig og reagere i overensstemmelse hermed for at sikre deres overlevelse. Dette omfatter ektotermer, hvor kropstemperaturen er i ligevægt med miljøet1. Derfor har hvert insekt deres eget optimale miljømæssige temperaturområde, som de søger at forblive inden for2.
Temperatur er en af de vigtige faktorer, der bruges til at forudsige fordelingen og rækkevidden af insekter 3,4,5, observere patogen-insektforhold6,7 og virkningen af eksterne faktorer på egnetheden af ektotermer såsom deres voksne levetid, fecundity og fodringshastighed 8,9.
Tidligere undersøgelser har undersøgt den foretrukne temperatur af ektotermer med forskellige opsætninger. Den mest almindelige er at bruge en stor aluminiumsblok enten med et afkølet eller opvarmet vandbad10, et isbad og programmerbart varmeelement11, kolde og varme plader12,13, termiske regulatorplader 14,15 eller en varmepakke og ispakke 16 i hver ende for at skabe en temperaturgradient. Derudover har andre undersøgelser også brugt en temperaturgradientinkubator til at studere væksten af udvalgte bakterier 17 og monteret en aluminiumsstang på en termoelektrisk enhed (opvarmet og afkølet i enderne) for at observere den termiske præference for Drosophila melanogaster18,19.
Den alternative metode, der foreslås her, har imidlertid betydelige fordele for visse insektanvendelser. For det første kræver andre løsninger komplet konstruktion fra bunden med grundlæggende materialer, herunder aluminiumsplader, konstruktion af akrylkamre til insekterne og ofte en kameraopsætning og specialsoftware; Dette kan være dyrt og tidskrævende at konfigurere. For det andet er mange alternative apparater afhængige af en temperaturgradient på en overflade (i modsætning til lufttemperatur). Derfor er kammeret, hvor insekterne undersøges, ofte meget smalt (f.eks. 24 cm lange gradienter med kun 2 cm bredde og 1 cm dybde16), hvilket kan forhindre naturlig adfærd, såsom flyvning, som er afgørende for insekternes normale mobilitet og derfor bydende nødvendigt ved valg af en foretrukken temperatur. Nogle undersøgelser måler lufttemperaturen; Den valgte scoring indebærer dog stadig at tælle antallet af myg, der lander på Peltier-elementerne i modsætning til insekter, der flyver frit i burene20.
I denne undersøgelse beskriver vi en enklere opsætning, der bruger minimalt modificeret standardudstyr og giver insekter tilstrækkelig plads til at flyve og navigere relativt uhindret i et kolonivedligeholdelsesbur i standardstørrelse. I stedet for at stole på en gradient bruger protokollen to relativt store sektioner med ensartet indre temperatur, hvilket giver mulighed for naturlig roaming af insekterne ved deres foretrukne temperatur og en simpel binær scoring. Derfor giver apparatet og protokollen, der er beskrevet her, et billigt og simpelt middel til at studere mygtemperaturpræference i en mindre obstruktiv og mere realistisk indstilling.
Protokollen involverer forberedelse af insekterne før eksperimentet efterfulgt af opsætningen af tokammerapparater. Yderligere trin omfatter placering af insekter i apparatet for at muliggøre valg af temperatur og scoring af resultater. For en illustration af metoden her valgte vi insekternes optimale (standardopdræt) temperatur, 27 °C for Aedes aegypti, 25 °C for Drosophila melanogaster og en højere frastødende temperatur for begge insektarter, henholdsvis 30 °C og 28 °C. Insekter får 30 minutter til at vælge et foretrukket kammer. Denne gang viste sig at være tilstrækkelig, og en længere varighed ændrede ikke resultaterne; Dette kan dog forlænges afhængigt af art/temperatur/andre variabler efter behov.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic tube (Bridge)</td>
			<td>Perspex</td>
			<td>900 mm OD</td>
			<td>Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2) inflator</td>
			<td>Peaken</td>
			<td>B08HM2BDDB</td>
			<td>Any CO2 pen will work&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator (&#215;2)</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384)</td>
			<td>Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm &#8216;holesaw&#8217; drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical aspirator (for mosquitoes)&#160;</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E710</td>
			<td>Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito cage (&#215;3; two for the experiments, one for storing insects)</td>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BD4S1515</td>
			<td>Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diameter of opening = 5 cm 
			Length of funnel = 5 cm 
			Diameter of aperture = 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects)</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E714</td>
			<td>Manual/mouth aspirated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band or Reusable cable tie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Either, depending on preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td>Eidyer</td>
			<td>B07J4T1VQZ</td>
			<td>Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms

De fleste insekter og andre ektotermer har et relativt smalt optimalt temperaturvindue, og afvigelse fra deres optima kan have betydelige virkninger på deres kondition såvel som andre egenskaber. Derfor søger mange sådanne ektotermer deres optimale temperaturområde. Selvom temperaturpræferencer for myg og andre insekter er blevet godt undersøgt, udføres den traditionelle eksperimentelle opsætning ved hjælp af en temperaturgradient på en aluminiumoverflade i et meget lukket rum. I nogle tilfælde begrænser dette udstyr mange naturlige adfærd, såsom flyvning, hvilket kan være vigtigt i præferencevalg.
Formålet med denne undersøgelse er at observere insektpræference for lufttemperatur ved hjælp af et to-kammer apparat med tilstrækkelig plads til flyvning. De to kamre består af uafhængige temperaturstyrede inkubatorer, hver med en stor blænde. Inkubatorerne er forbundet med disse åbninger ved hjælp af en kort akrylbro. Inde i inkubatorerne er to netbure, der er forbundet via åbningerne og broen, så insekterne frit kan flyve mellem de forskellige forhold. Akrylbroen fungerer også som en temperaturgradient mellem de to inkubatorer.
På grund af det rummelige område i buret og den lette konstruktion kan denne metode bruges til at studere enhver lille ektoterm og / eller enhver manipulation, der kan ændre temperaturpræference, herunder sensorisk organmanipulation, diæt, tarmflora og endosymbiont tilstedeværelse på biosikkerhedsniveau 1 eller 2 (BSL 1 eller 2). Derudover kan apparatet bruges til undersøgelse af patogeninfektion ved hjælp af yderligere indeslutning (f.eks. Inde i et biosikkerhedsskab) ved BSL 3.

For at teste effektiviteten og effektiviteten af denne eksperimentelle opsætning blev 30 myg testet med samme temperatur i begge inkubatorer i fire replikater (figur 3). Når begge kamre blev indstillet til myggens optimale temperatur på 27 °C, var der ingen signifikant forskel mellem kammerpræference (P = 0,342; Wilcoxon signerede rangprøve). Men når det ene kammer blev indstillet til den attraktive optimale temperatur på 27 °C og det andet kammer til en suboptimal temperatur på 30 °C, viste myg konsekvent aktiv præference over for deres optima (P = 0,029; Wilcoxon signerede rang test; middelværdi på 78,2 % og 21,8 % for henholdsvis 27 °C og 30 °C). Vi testede også ved hjælp af Drosophila for at bestemme anvendeligheden med en anden ectotherm-model, og lignende resultater blev observeret.
Temperaturensartethed i bure Figur 4 viser tokammerapparatets temperaturensartethed. Når de var samlet, blev de to sider indstillet til 27 ° C og 30 ° C og fik lov til at balancere i henhold til instruktionerne her. Alle dele af inkubatoren og broen er inden for 0,4 °C fra centraltemperaturen, undtagen (konsekvent) i et hjørne. Bemærk, at det forreste nederste venstre hjørne (set forfra) er et konstant hot spot ved både 27 °C og 30 °C. Dette skyldes sandsynligvis, at inkubatorstyringens elektronik er placeret lige under den del af inkubatoren, snarere end de udførte manipulationer; derfor er det sandsynligvis inkubatormodelspecifikt. Dette viser, at manipulationen og tilsætningen til inkubatoren har minimal effekt på temperaturens ensartethed. Desuden var brotemperaturen mellemliggende mellem de to kamre, hvilket sikrede, at insekter ikke konfronteres med et temperaturtrug, som de skulle flyve igennem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig01.jpg"> Figur 1: Beskrivelse af myggeburet. Myggebur (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) med 12 cm ærmeåbninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig02.jpg"> Figur 2: Billeder og diagram over apparatet under opsætningen . (A) Tomt insektbur placeret i inkubatoren. (B) Akrylrør med et oplukkeligt dæksel (klap) lavet af gaffatape. (C) Sidebillede af opsætningen med et skematisk diagram. Ærmets maske blev strammet omkring akrylrøret med et gummibånd. Til disse eksperimenter blev der brugt 3-5 dage gamle, parrede, kvindelige Ae. aegypti myg. (D) Komplet opsætning. To inkubatorer, der vender mod hinanden, er forbundet med et akrylrør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig03.jpg"> Figur 3: Temperaturpræference hos insekter. To-kammerapparatet blev samlet i henhold til instruktionerne. Insekter blev indsat i henhold til protokollen og efterladt i 30 minutter for at vælge deres foretrukne kammer (temperatur) og derefter tælles. Sorte punkter repræsenterer individuelle replikater, og blå repræsenterer middelværdien. (A) Begge inkubatorer blev indstillet til samme temperatur (27 °C), og Ae. aegyptis temperaturpræference blev observeret. (B) Inkubatorer blev indstillet til forskellige temperaturer (27 °C vs. 30 °C) og temperaturpræferencen for Ae. Aegypti blev observeret. (C) Inkubatorer blev indstillet til forskellige temperaturer (25 °C vs. 28 °C), og temperaturpræference for D. melanogaster blev observeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig04v2.jpg"> Figur 4: Temperaturensartethed i kamrene og broen. Som beskrevet blev to inkubatorer, to bure og broen samlet i henhold til instruktionerne. Temperaturen blev justeret til 27 °C på begge inkubatorer og 30 °C i midten. En temperatursonde blev brugt til at måle temperaturen i midten af buret, alle otte hjørner af inkubatoren og inde i broen. De målte temperaturer er vist her. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig04largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Insekter har et optimalt miljømæssigt temperaturområde, som de søger at forblive inden for, og mange eksterne og interne faktorer kan ændre denne præference. Her beskriver vi en omkostningseffektiv og enkel metode til at studere temperaturvalg, som gør det muligt for insekter frit at udvise deres naturlige adfærd.

Bestemmelse af temperaturpræference for myg og andre ektotermer

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

Denne opsætning af tokammerapparater bruges til at studere insekters temperaturpræference og kan modificeres til at studere andre binære valgpræferencesituationer såsom lys versus mørk eller høj versus lav luftfugtighed. De vigtigste fordele ved denne teknik er den enkle opsætning, det rummelige område, der gør det muligt for insekterne at udstille deres flyvende natur, når de vælger deres foretrukne temperatur, og let scoring uden eksternt udstyr. Den sværeste del af protokollen er at fjerne akrylbruddet efter eksperimentet.Dette skyldes, at der er stor chance for, at insekterne undslipper. Derfor er det afgørende for os at bruge kuldioxiden til at bedøve insekterne. Kinga Stobierska og Lorna Glenn, begge kandidatstuderende fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren.Til at begynde med skal du forberede 2 tomme mygbure med 12 centimeter ærmeåbninger og sikre, at der ikke er huller eller andre skader. Brug derefter en mekanisk aspirator til at overføre 30 insekter til et separat bur for lettere håndtering og bortskaffelse efter eksperimentet. Indstil inkubatorerne til de ønskede temperaturer og lad dem varme op og stabilisere.Det tager cirka 30 minutter at opnå en temperatur i området 25 til 30 grader Celsius. Placer derefter et tomt mygbur i en inkubator og fodre burets ærmer gennem inkubatorens forreste hul. Bekræft inkubatorens indvendige lufttemperatur med en temperatursonde.Placer derefter en oplukkelig klap forberedt med gaffatape over hullet i akrylrøret. Rul ærmet op, der stikker ud gennem hullet foran den første inkubator, og fastgør det over den ene ende af akrylrøret med et elastikbånd. Placer derefter inkubatorerne mod hinanden og indsæt den ene ende af akrylrøret i muffen på det andet inkubatorhul.Sørg for, at akrylrørets diameter er større end hullet foran på inkubatorerne, så det helt dækker hullet. Sørg for, at akrylrøret ikke er løst og dingler mellem inkubatorerne. Hvis det er tilfældet, skal du trække i burærmerne for at fjerne overskydende materiale mellem buret og elastikken.For at sætte myggene inde skal du åbne gaffatapeklappen. Placer en tragt i hullet i akrylrøret, og tøm derefter insekterne i røret gennem tragten. Efter tømning af insekterne skal du fjerne tragten og dække rørhullet med en gaffatapeklap.Lad i 30 minutter for insekterne at vælge det foretrukne kammer. I slutningen af afviklingstiden skal du visuelt observere og nedskrive antallet af insekter, der ses i akrylrørbroen. Tryk eller blæs derefter alle insekterne i broen til hver side af inkubatoren eller ved at frigive kuldioxid i broen.Klem derefter og luk ærmerne fra akrylrøret på begge sider ved hurtigt at fastgøre dem med en stram knude. Fjern derefter burene fra begge inkubatorer og tæl visuelt insekterne i hvert bur. Sørg for, at tallene fra både inkubatorer og broen tilføjer op til 30.I den foreliggende undersøgelse blev myggenes og bananfluernes temperaturpræference bestemt ved hjælp af tokammermodellen. Resultaterne viste ingen signifikant forskel, når begge bure blev opretholdt ved 27 grader Celsius, hvilket indikerer myggenes evne til frit at vælge mellem bure, der udviser deres naturlige adfærd. Omvendt, når de to kamre blev indstillet til forskellige temperaturer, valgte myggene konsekvent den optimale temperatur på 27 grader Celsius over 30 grader Celsius.Tilsvarende, da opsætningen blev testet med Drosophila Melanogaster, undgik en anden ektodermmodel frugtfluerne det varmere kammer og foretrak deres optimale temperatur på 25 grader Celsius. Sørg for, at opsætningen er helt forseglet uden skjulesteder og uden net, der forstyrrer flyveområdet, så insekterne frit kan vælge mellem de 2 kamre.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design og analyse af temperaturpræferenceadfærd og dens døgnrytme i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-påvisningsassay for Malaria Fremsendende Myg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Laboratoriet opdræt af stabil fluer og andre Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for afprøvning toksicitet af roman insektbekæmpelsesmidler kemi til myg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...