Name: determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms
Uploaded: 2022-09-28T13:50:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

AHR dankt Majlis Amanah Rakyat (MARA) für die finanzielle Unterstützung.

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für BSL 1 oder 2 geschrieben; Führen Sie für BSL 3-Arbeiten das gesamte Protokoll in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse 3 (Handschuhfach) durch.
1. Insektenzubereitung
<ol><li>Bereiten Sie zwei leere Moskitokäfige (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) mit 12 cm Hülsenöffnungen vor (Abbildung 1). Bevor Sie mit den Experimenten fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Moskitokäfige keine Löcher oder andere Schäden aufweisen.</li>
	<li>Mit einem mechanischen Aspirator (einem einfachen Sauger mit einer Sammelkammer) werden 30 Insekten (z. B. Aedes aegypti-Mücken ; hier wurden Weibchen 3-5 Tage nach dem Auflaufen verwendet) in einen separaten Käfig gebracht, um die Handhabung und Entsorgung nach dem Experiment zu erleichtern. HINWEIS: Insgesamt 30 Insekten pro Experiment werden empfohlen, da es einfach zu handhaben und zu zählen ist, ohne dass ein hohes Risiko besteht, dass Moskitos entweichen. Die Anzahl der verwendeten Insekten kann an das Ziel des Experiments angepasst werden.</li>
</ol>2. Aufbau von Zweikammerapparaturen
<ol><li>Stellen Sie die Inkubatoren gemäß den Anweisungen des Inkubatorherstellers auf die gewünschten Temperaturen ein.</li>
	<li>Lassen Sie die Inkubatoren aufheizen und stabilisieren Sie sich bei den spezifischen Temperaturen, die <30 min für Temperaturen im Bereich von 25-30 ° C betragen. Überprüfen Sie die Lufttemperatur im Inkubator mit einem Temperaturfühler, um sicherzustellen, dass der Inkubator auf die vorgesehene Temperatur eingestellt ist.</li>
	<li>Stellen Sie einen leeren Moskitokäfig in jeden Inkubator (Abbildung 2A).</li>
	<li>Führen Sie die Hülsen des Käfigs durch das vordere Loch des Inkubators. Bereiten Sie eine zu öffnende Abdeckung (Klappe) mit Klebeband vor und legen Sie sie über das Loch im Acrylrohr (Abbildung 2B).</li>
	<li>Führen Sie das Acrylrohr in die Hülse eines Käfigs oben auf dem Inkubatorloch ein. Der Durchmesser des Rohres ist größer als das Loch in der Vorderseite der Inkubatoren, so dass es das Loch vollständig bedeckt.</li>
	<li>Ziehen Sie das Netz der Hülse um den Schlauch mit einem Gummiband oder einem wiederverwendbaren Kabelbinder fest (Abbildung 2C). Stellen Sie sicher, dass das Acrylrohr nicht locker ist und zwischen den Inkubatoren baumelt; Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie an den Käfighülsen, um überschüssiges Material zwischen dem Käfig und dem Gummiband zu entfernen.</li>
	<li>Stellen Sie beide Inkubatoren einander gegenüber und wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit der Hülse des anderen Inkubators. Beide Käfige sind nun durch das Acrylrohr sicher verbunden (Abbildung 2D).</li>
</ol>3. Mückeneinfügung
<ol><li>Öffnen Sie die Klebebandklappe zum Einführen von Moskitos. Legen Sie einen Trichter in das Loch. Entleeren Sie die Insekten in den Trichter, der in die Acrylröhre gelegt wurde. HINWEIS: Falls gewünscht/erforderlich: Verwenden Sie bei Moskitos einen CO2 -Stift, um alle Moskitos auszuschalten, bevor Sie sie in den Trichter21 legen; für Drosophila, verwenden Sie Eis, um Insekten niederzuschlagen22.</li>
	<li>Entfernen Sie den Trichter und decken Sie das Loch im Rohr mit der Klebebandklappe ab. Lassen Sie für Insekten für 30 Minuten, um die bevorzugte Kammer auszuwählen. HINWEIS: Wenn CO2 oder Eis verwendet wurde, klopfen Sie leicht auf die Rohrbrücke, um die Insekten nach ein paar Minuten zu wecken.</li>
</ol>4. Mückenzählung
<ol><li>Nach 30 Minuten visuell beobachten und aufschreiben, wie viele Insekten in der Brücke (der Acrylröhre) gefunden wurden.</li>
	<li>Klopfen / blasen Sie die Insekten in der Brücke zu beiden Seiten des Inkubators. Rekord, um später von der Gesamtzahl der Insekten abzuziehen. HINWEIS: Schlagen Sie alle 30 Insekten im Gerät aus, indem Sie CO 2 in die Brücke freisetzen (verwenden Sie CO2 für alle Insekten, da Eis Insekten in den Käfigen nicht umwirft). Beachten Sie auch die Anzahl der Insekten in der Brücke, die zu beiden Seiten des Inkubators fliegen.</li>
	<li>Kneifen und schließen Sie die Hülsen aus dem Acrylrohr auf beiden Seiten, befestigen Sie sie schnell mit einem Knoten, um die Käfige zu schließen, und stellen Sie sicher, dass das Gummiband noch intakt ist, um zu verhindern, dass Insekten entweichen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Käfige aus dem Inkubator und zählen Sie die Insekten in jedem Käfig visuell (ziehen Sie bei Bedarf die Anzahl der Insekten von der Brücke ab).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.4 mit dem anderen Käfig. Stellen Sie sicher, dass die Zahlen aus den beiden Inkubatoren und der Brücke 30 ergeben (oder die Anzahl der verwendeten Insekten, falls abweichend).</li>
	<li>Wenn die Zahlen nicht zur Gesamtzahl der in Schritt 1.2 verwendeten Insekten addieren, suchen Sie nach den verbleibenden Insekten in der Käfighülse.</li>
</ol>5. Replikation
<ol><li>Achten Sie bei der Durchführung von Experimenten darauf, mögliche externe Verzerrungen wie Lichtrichtung, Umgebungsgerüche usw. zu berücksichtigen. Zum Beispiel durch Umkehrung der Käfige, Inkubatorausrichtung und Kombinationen zwischen Replikaten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wright, R. K., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+ectotherm+immune+responses.">Temperature effects on ectotherm immune responses.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).</li><li>Deal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature+preferendum+of+certain+insects.">The temperature preferendum of certain insects.</a> The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).</li><li>Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Scientific Reports. 5, 15298 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Studie beschreibt eine neue Methode, um die Temperaturpräferenz bei Moskitos zu beobachten. Bei dieser Methode werden Moskitos in eine Röhre freigesetzt, die mit zwei Inkubatoren mit unabhängig steuerbaren Temperaturen verbunden ist. Auf diese Weise können die Moskitos frei zwischen zwei Temperaturen wählen, ohne ihr natürliches Verhalten und ihren Mechanismus zum Ausdruck dieser Wahl (z. B. Fliegen) zu stören.
Unser erstes repräsentatives Experiment verwendete die optimale Mückentemperatur von 27 °C in beiden Kammern. Während der Wiederholung dieses Experiments wurde beobachtet, dass Moskitos während der gesamten 30 Minuten frei zwischen beiden Käfigen flogen, und in allen Replikaten gab es in jeder der beiden Kammern fast die gleiche Anzahl. Dies bestätigte die experimentelle Absicht, den Moskitos die Möglichkeit zu geben, frei zwischen Käfigen zu wählen, während sie ihr natürliches Verhalten (Fliegen) zeigen. Umgekehrt nutzte das zweite repräsentative Experiment die attraktive optimale Temperatur von 27 °C in einer Kammer und eine suboptimale und damit abstoßende Temperatur von 30 °C in der zweiten Kammer. Wie erwartet, wählten Moskitos konsequent die optimale Temperaturkammer mit hoher Signifikanz, auch wenn wir die Inkubatoren austauschten, um Verzerrungen zu vermeiden.
Wir testeten den Aufbau auch für ein anderes Insekt, D. melanogaster (Fruchtfliegen), das einen anderen Ektotherm-Modellorganismus darstellt. Eine Kammer wurde auf die optimale Temperatur von D. melanogaster, 25 °C, und die andere auf 3 °C höher, 28 °C, eingestellt. Ähnlich wie Moskitos begünstigten auch Fruchtfliegen ihre optimale Temperatur und mieden die wärmere Kammer. Dies zeigt, dass das Protokoll für eine Reihe von Ektothermen geeignet ist.
Beschreibung kritischer Schritte im Protokoll Der wichtigste kritische Schritt im Protokoll ist der Umgang mit Insekten, da es die Möglichkeit der Flucht von Insekten erzeugt. Dies kann verhindert werden, indem festgestellt wird, dass in den verwendeten Käfigen keine Löcher vorhanden sind, die groß genug für eine Flucht sind, dass die Gummibänder / Kabelbinder, die zur Befestigung der Netzhülsen an der Brücke verwendet werden, fest sind und dass die Abdeckung für das Insekteneinführungsloch auf der Brücke sicher befestigt und versiegelt ist.
Es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass Insekten nicht vor oder nach dem Experiment entkommen, insbesondere wenn die Insekten für nachgeschaltete Experimente oder spätere Zeitpunkte für verschiedene Temperaturentscheidungen benötigt werden. Dies kann erreicht werden, indem die Insekten vor dem Einsetzen in die Acrylbrücke (mit Eis für Drosophila und CO 2 für Moskitos) und CO2 in die Brücke freigesetzt werden, um die Insekten nach den Experimenten vor der Berechnung niederzuschlagen. Die Verwendung von CO2 ist ideal für Moskitos, da es die Verhaltensergebnisse nicht beeinflusst21. Bei Fliegen kann die Exposition gegenüber CO2 ihr Flugverhaltenverändern 23, daher wird empfohlen, Eis22 zu verwenden.
Das Zählen von Insekten ist ebenfalls ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Insekten vor und nach dem Experiment gleich ist, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Um dies zu tun, empfehlen wir nach Abschluss des Experiments die Verwendung eines CO2 -Stifts, um die Insekten, die sich in der Brücke befinden, niederzuschlagen. Dies wird dazu beitragen, die Insekten auf beide Seiten der Kammer zu bewegen, wodurch die Anzahl der Entflohenen reduziert wird. Wir heben im Protokoll auch hervor, dass Insekten während der Käfigtrennung in den Hülsen der Käfige gefangen werden können; Stellen Sie daher sicher, dass diese während der Zählung gründlich überprüft werden.
Mögliche Modifikationen und Fehlerbehebung der Technik Die Hauptschwierigkeit bei dieser Technik ist das flexible Geflecht der Käfighülsen, das zu Lücken oder Verstecken und damit zu Insektenflucht oder -fallen führt. Es gibt einige mögliche Modifikationen, falls erforderlich, um die Technik zu verbessern. Wir empfehlen, zwei oder mehr Gummibänder zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Brücke zwischen den Kammern ordnungsgemäß befestigt ist, ohne dass den Insekten Platz gelassen wird (loses Netz schafft ein Versteck für Insekten). Wir empfehlen auch, bei der Montage des Gerätes besonders darauf zu achten, die Netzhülse straff zu ziehen, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
Inkubatoren mit kleinem Formfaktor werden in der Regel nur beheizt (d.h. haben keine aktive Kühlung), wie es bei den hier verwendeten Inkubatoren der Fall war. Folglich erfordert die Verwendung von Temperaturen um oder unter der Umgebungsraumtemperatur, dass das Experiment in einem kalten Raum durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die für die Inkubatoren eingestellten Temperaturen so niedrig wie gewünscht sind.
Darüber hinaus kann dieser Aufbau auch für BSL 3 verwendet werden, wo eine Biosicherheitswerkbank der Klasse drei (Handschuhfach) benötigt wird. In diesem Fall muss das Handschuhfach groß genug sein, um den gesamten Apparat unterzubringen. Das in diesem Protokoll beschriebene Experiment ist ideal für Experimente in einem Handschuhfach, da alles, was benötigt wird, im Handschuhfach enthalten ist und vor allem die Möglichkeit, dass Insekten entkommen, minimal ist.
Schließlich gibt es genug Platz in den Inkubatoren, um externes Licht oder eine Feuchtigkeitsquelle hinzuzufügen, ohne die Insekten in den Käfigen zu beeinträchtigen. Je nach Insektenart oder experimentellem Design kann eine LED-Lampe mit einer Dicke von 1 cm leicht auf dem Käfig in einem oder beiden Inkubatoren platziert werden. Die Bereitstellung von Licht für beide und das Anbieten einer Temperaturwahl kann für einige lichtempfindliche experimentelle Designs ein realistischeres Protokoll sein, oder nur die Bereitstellung von Licht (oder Feuchtigkeit) für eine Kammer ist eine mögliche Änderung des Protokolls zur Beurteilung der Licht- / Feuchtigkeitswahl.
Vorteile dieser Technik im Rahmen von Dual Choice Temperaturpräferenzassays Die hier beschriebene Methode stellt eine Alternative zu der traditionellen Temperaturgradientenmethode dar, die in früheren Studien10,13,14,16 beschrieben wurde. In den meisten dieser Studien wird ein großer horizontaler Aluminiumblock mit einem thermischen Gradienten verwendet, während der Mechanismus zur Erzeugung dieses Gradienten variiert, einschließlich Heiz- / Kühlblöcken, Wasserbädern usw. In diesen Fällen wird der Temperaturgradient auf der Oberfläche des Aluminiumblocks erzeugt (und nicht auf der Lufttemperatur in einem Käfig). Folglich schränken die meisten (aber nicht alle) alternativen Techniken die Flugfähigkeit von Insekten stärker ein als dieses Protokoll. Hier können Insekten relativ frei zwischen Käfigen fliegen, was einen realistischeren Ausdruck des natürlichen Verhaltens bei der Wahl ermöglicht. Es wäre sogar möglich, diese experimentelle Apparatur mit größeren Käfigen und Inkubatoren, zum Beispiel für größere Insekten, zu vergrößern.
Neben dem natürlichen Verhaltensvorteil zeigen wir auch eine sehr hohe Temperaturgleichmäßigkeit innerhalb der beiden Kammern, was eine einfache Bewertung und eine klare Auswahl von zwei großen Einzeltemperaturkammern ermöglicht. Die Verwendung eines binären großen Kammerdesigns wie dieses kann das Rauschen in den Daten reduzieren, wobei beispielsweise bei einem Gradientenapparat jede zufällige Bewegung der Insekten die Position auf dem Gradienten und damit ihre wahrgenommene Temperaturpräferenz ändert.
Die hier beschriebene Technik ist zudem sehr einfach und kostengünstig. Diese Technik benötigt keine zusätzlichen Geräte zum Einstellen der Temperaturen (z. B. ein Wasserbad10 und/oder eine Heizplatte 11,12,13,14,15), keine Spezialausrüstung außer einem geschnittenen Acrylrohr und Bohrlöchern und keine Kamera 18,19 oder ausgeklügelte Software 19 zur Analyse. Solche Komponenten, die in anderen Techniken verwendet werden, können teuer sein und / oder erfordern erhebliches Fachwissen und Tests, um Experimente zu beginnen.
Diese Technik kann auch mit verschiedenen Geräten repliziert werden, die Batterien verwenden, wenn keine externe Stromversorgung vorhanden ist, was das System ideal für Experimente im Feld macht. Darüber hinaus könnte das gleiche Gerät leicht modifiziert werden, um andere binäre Wahlpräferenzsituationen wie Hell versus Dunkel, hohe / niedrige Luftfeuchtigkeit usw. entweder im Labor oder im Feld zu untersuchen.
Die Apparatur in voller Größe im Protokoll ist deutlich kleiner als Temperaturgradienten-Setups, was einen einfacheren Einbau in ein BSL 3-Handschuhfach wie oben beschrieben ermöglicht. Außerdem sind die Insekten leichter einzudämmen, da sie am Ende des Experiments mit CO2 niedergeschlagen werden können und die Käfige nach der Trennung von der Brücke schnell wieder verschlossen werden können. Diese Containment-Vorteile sind ideal für BSL 3-Arbeiten.
Wir erkennen jedoch an, dass unsere Apparatur nur eine binäre Entscheidung und nicht eine freie Wahl entlang eines Gradienten zulässt, was je nach Anwendung zusätzliche Durchläufe erfordern kann, um optimale Temperaturen zu identifizieren.

Organismen können nur innerhalb ihres thermischen Toleranzbereichs leben und sich vermehren. Da die Umgebungstemperatur aufgrund von Jahreszeitenänderungen und globaler Erwärmung variiert, müssen sich Arten anpassen und entsprechend reagieren, um ihr Überleben zu sichern. Dazu gehören Ektothermen, bei denen die Körpertemperatur im Gleichgewicht mit der Umgebung ist1. Daher hat jedes Insekt seinen eigenen optimalen Umgebungstemperaturbereich, den sie innerhalbvon 2 halten möchten.
Die Temperatur ist einer der wichtigen Faktoren, die verwendet werden, um die Verteilung und Reichweite von Insekten vorherzusagen 3,4,5, die Beobachtung von Erreger-Insekten-Beziehungen 6,7 und die Wirkung externer Faktoren auf die Fitness von Ektothermen wie ihre Lebensdauer, Fruchtbarkeit und Fressrate 8,9.
Frühere Studien haben die bevorzugte Temperatur von Ektothermen mit unterschiedlichen Aufbauten untersucht. Am gebräuchlichsten ist die Verwendung eines großen Aluminiumblocks entweder mit einem gekühlten oder beheizten Wasserbad 10, einem Eisbad und einem programmierbaren Heizelement 11, kalten und heißen Platten12,13, Wärmereglerplatten 14,15 oder einem Wärmepack und einem Eisbeutel 16 an beiden Enden, um einen Temperaturgradienten zu erzeugen. Darüber hinaus haben andere Studien auch einen Temperaturgradienteninkubator verwendet, um das Wachstum ausgewählter Bakterienzu untersuchen 17 und einen Aluminiumstab auf einer thermoelektrischen Vorrichtung (an den Enden beheizt und gekühlt) montiert, um die thermische Präferenz von Drosophila melanogaster18,19 zu beobachten.
Die hier vorgeschlagene alternative Methodik hat jedoch erhebliche Vorteile für bestimmte Insektenanwendungen. Erstens erfordern andere Lösungen eine komplette Konstruktion von Grund auf mit Grundmaterialien, einschließlich Aluminiumblechen, dem Bau von Acrylkammern für die Insekten und oft einem Kamera-Setup und spezieller Software; Dies kann teuer und zeitaufwendig in der Einrichtung sein. Zweitens beruhen viele alternative Geräte auf einem Temperaturgradienten auf einer Oberfläche (im Gegensatz zur Lufttemperatur). Folglich ist die Kammer, in der die Insekten untersucht werden, oft sehr eng (z. B. 24 cm lange Steigungen mit nur 2 cm Breite und 1 cm Tiefe16), was natürliche Verhaltensweisen wie das Fliegen verhindern kann, die für die normale Mobilität von Insekten unerlässlich sind und daher für die Auswahl einer bevorzugten Temperatur unerlässlich sind. Einige Studien messen die Lufttemperatur; Die Bewertung der Wahl beinhaltet jedoch immer noch die Zählung der Anzahl der Moskitos, die auf den Peltier-Elementen landen, im Gegensatz zu Insekten, die frei in den Käfigen fliegen20.
In dieser Studie beschreiben wir einen einfacheren Aufbau, der minimal modifizierte Standardausrüstung verwendet und Insekten ausreichend Platz bietet, um relativ ungehindert in einem Standard-Pflegekäfig zu fliegen und zu navigieren. Anstatt sich auf einen Gradienten zu verlassen, verwendet das Protokoll zwei relativ große Abschnitte mit konstanter Innentemperatur, die ein natürliches Roaming der Insekten bei ihrer bevorzugten Temperatur und eine einfache binäre Bewertung ermöglichen. Daher bieten die hier beschriebenen Geräte und Protokolle eine kostengünstige und einfache Möglichkeit, die Temperaturpräferenz der Moskitos in einer weniger hinderlichen und realistischeren Umgebung zu untersuchen.
Das Protokoll beinhaltet die Vorbereitung der Insekten vor dem Experiment, gefolgt vom Aufbau der Zweikammerapparatur. Weitere Schritte umfassen das Platzieren von Insekten in der Apparatur, um die Wahl der Temperatur und die Bewertung der Ergebnisse zu ermöglichen. Zur Veranschaulichung der Methode wählten wir hier die optimale (Standardaufzucht-) Temperatur der Insekten, 27 °C für Aedes aegypti, 25 °C für Drosophila melanogaster und eine höhere Abwehrtemperatur für beide Insektenarten, 30 °C bzw. 28 °C. Insekten erhalten 30 Minuten Zeit, um eine bevorzugte Kammer auszuwählen. Diese Zeit erwies sich als ausreichend, und eine längere Dauer änderte nichts an den Ergebnissen; Dies kann jedoch je nach Spezies / Temperatur / anderen Variablen nach Bedarf erweitert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic tube (Bridge)</td>
			<td>Perspex</td>
			<td>900 mm OD</td>
			<td>Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2) inflator</td>
			<td>Peaken</td>
			<td>B08HM2BDDB</td>
			<td>Any CO2 pen will work&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator (&#215;2)</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384)</td>
			<td>Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm &#8216;holesaw&#8217; drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical aspirator (for mosquitoes)&#160;</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E710</td>
			<td>Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito cage (&#215;3; two for the experiments, one for storing insects)</td>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BD4S1515</td>
			<td>Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diameter of opening = 5 cm 
			Length of funnel = 5 cm 
			Diameter of aperture = 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects)</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E714</td>
			<td>Manual/mouth aspirated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band or Reusable cable tie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Either, depending on preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td>Eidyer</td>
			<td>B07J4T1VQZ</td>
			<td>Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms

Die meisten Insekten und andere Ektothermen haben ein relativ enges optimales Temperaturfenster, und eine Abweichung von ihrem Optima kann erhebliche Auswirkungen auf ihre Fitness sowie andere Eigenschaften haben. Folglich suchen viele solcher Ektothermen ihren optimalen Temperaturbereich. Obwohl die Temperaturpräferenzen von Moskitos und anderen Insekten gut untersucht wurden, wird der traditionelle Versuchsaufbau mit einem Temperaturgradienten auf einer Aluminiumoberfläche in einem stark geschlossenen Raum durchgeführt. In einigen Fällen schränkt diese Ausrüstung viele natürliche Verhaltensweisen ein, wie z. B. das Fliegen, was bei der Auswahl der Präferenzen wichtig sein kann.
Ziel dieser Studie ist es, die Präferenz von Insekten für die Lufttemperatur unter Verwendung einer Zweikammerapparatur mit ausreichend Flugraum zu beobachten. Die beiden Kammern bestehen aus unabhängigen temperaturgesteuerten Inkubatoren mit jeweils großer Apertur. Die Inkubatoren sind durch diese Öffnungen mit einer kurzen Acrylbrücke verbunden. Im Inneren der Inkubatoren befinden sich zwei Netzkäfige, die über die Öffnungen und die Brücke miteinander verbunden sind, so dass die Insekten frei zwischen den verschiedenen Bedingungen fliegen können. Die Acrylbrücke fungiert auch als Temperaturgradient zwischen den beiden Inkubatoren.
Aufgrund des geräumigen Bereichs im Käfig und der einfachen Konstruktion kann diese Methode verwendet werden, um jedes kleine Ektotherm und / oder jede Manipulation zu untersuchen, die die Temperaturpräferenz verändern kann, einschließlich sensorischer Organmanipulation, Ernährung, Darmflora und Endosymbiontenpräsenz auf Biosicherheitsstufe 1 oder 2 (BSL 1 oder 2). Zusätzlich kann das Gerät zur Untersuchung von Erregerinfektionen unter Verwendung eines weiteren Containments (z. B. innerhalb einer Biosicherheitswerkbank) bei BSL 3 verwendet werden.

Um die Wirksamkeit und Wirksamkeit dieses Versuchsaufbaus zu testen, wurden 30 Mücken mit der gleichen Temperatur in beiden Inkubatoren in vier Replikaten getestet (Abbildung 3). Wenn beide Kammern auf die optimale Temperatur der Mücke von 27 °C eingestellt wurden, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kammerpräferenz (P = 0,342; Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtest). Wenn jedoch eine Kammer auf die attraktive optimale Temperatur von 27 °C und die andere Kammer auf eine suboptimale Temperatur von 30 °C eingestellt wurde, zeigten die Moskitos durchweg eine aktive Präferenz für ihr Optima (P = 0,029; Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test; Mittelwert von 78,2 % bzw. 21,8 % bei 27 °C bzw. 30 °C). Wir testeten auch mit Drosophila , um die Anwendbarkeit mit einem anderen Ektothermmodell zu bestimmen, und ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet.
Temperaturgleichmäßigkeit innerhalb der Käfige Abbildung 4 zeigt die Temperaturgleichmäßigkeit der Zweikammerapparatur. Nach der Montage wurden die beiden Seiten auf 27 °C und 30 °C eingestellt und gemäß den hier gegebenen Anweisungen ausgeglichen. Alle Teile des Inkubators und der Brücke liegen innerhalb von 0,4 °C von der zentralen Temperatur, außer (konsequent) für eine Ecke. Beachten Sie, dass die vordere untere linke Ecke (von vorne gesehen) sowohl bei 27 °C als auch bei 30 °C ein konsistenter Hot Spot ist. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass sich die Elektronik der Inkubatorsteuerungen direkt unter diesem Abschnitt des Inkubators befindet, und nicht auf die durchgeführten Manipulationen. Daher ist es wahrscheinlich Inkubator-Modell-spezifisch. Dies zeigt, dass die Manipulation und Zugabe zum Inkubator einen minimalen Einfluss auf die Temperaturgleichmäßigkeit haben. Darüber hinaus lag die Brückentemperatur zwischen den beiden Kammern, so dass Insekten nicht mit einem Temperaturtrog konfrontiert werden, durch den sie fliegen müssten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig01.jpg"> Abbildung 1: Beschreibung des Moskitokäfigs. Moskitokäfig (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) mit 12 cm Ärmelöffnungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig02.jpg"> Abbildung 2: Bilder und Diagramm der Apparatur während des Aufbaus . (A) Leerer Insektenkäfig im Inkubator. (B) Acrylrohr mit einer zu öffnenden Abdeckung (Klappe) aus Klebeband. (C) Seitenansicht des Aufbaus mit schematischem Diagramm. Das Netz der Hülse wurde mit einem Gummiband um das Acrylrohr gespannt. Für diese Experimente wurden 3-5 Tage alte, verpaarte, weibliche Ae. aegypti Moskitos verwendet. (D) Vollständige Einrichtung. Zwei gegenüberliegende Inkubatoren sind durch ein Acrylrohr verbunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig03.jpg"> Abbildung 3: Temperaturpräferenz bei Insekten. Der Zweikammerapparat wurde gemäß den Anweisungen zusammengebaut. Insekten wurden gemäß dem Protokoll eingesetzt und 30 Minuten lang gelassen, um ihre bevorzugte Kammer (Temperatur) auszuwählen und dann zu zählen. Schwarze Punkte stellen einzelne Replikate dar, und Blau stellt den Mittelwert dar. (A) Beide Inkubatoren wurden auf die gleiche Temperatur (27 °C) eingestellt und die Temperaturpräferenz von Ae. aegypti wurde beobachtet. (B) Die Inkubatoren wurden auf unterschiedliche Temperaturen (27 °C vs. 30 °C) und die Temperaturpräferenz von Ae eingestellt. Aegypti wurde beobachtet. (C) Die Inkubatoren wurden auf unterschiedliche Temperaturen eingestellt (25 °C vs. 28 °C) und die Temperaturpräferenz von D. melanogaster wurde beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Temperaturgleichmäßigkeit innerhalb der Kammern und der Brücke. Wie beschrieben, wurden zwei Inkubatoren, zwei Käfige und die Brücke gemäß den Anweisungen montiert. Die Temperatur wurde auf beiden Inkubatoren auf 27 °C und in der Mitte auf 30 °C eingestellt. Eine Temperatursonde wurde verwendet, um die Temperatur in der Mitte des Käfigs, allen acht Ecken des Inkubators und innerhalb der Brücke zu messen. Die gemessenen Temperaturen sind hier dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Insekten haben einen optimalen Umgebungstemperaturbereich, in dem sie bleiben möchten, und viele externe und interne Faktoren können diese Präferenz ändern. Hier beschreiben wir eine kostengünstige und einfache Methode zur Untersuchung der Temperaturwahl, die es Insekten ermöglicht, ihr natürliches Verhalten frei zu zeigen.

Bestimmung der Temperaturpräferenz von Moskitos und anderen Ektothermen

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

Dieser Zwei-Kammer-Apparateaufbau wird verwendet, um die Temperaturpräferenz von Insekten zu untersuchen und kann modifiziert werden, um andere binäre Wahlpräferenzsituationen wie hell gegen dunkel oder hohe gegen niedrige Luftfeuchtigkeit zu untersuchen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind der einfache Aufbau, der geräumige Bereich, der es den Insekten ermöglicht, ihre fliegende Natur bei der Wahl ihrer bevorzugten Temperatur zu zeigen, und das einfache Scoring ohne externe Ausrüstung. Der schwierigste Teil des Protokolls ist das Entfernen des Acrylbruchs nach dem Experiment.Dies liegt daran, dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Insekten entkommen. Daher ist es für uns entscheidend, das Kohlendioxid zur Betäubung der Insekten zu verwenden. Kinga Stobierska und Lorna Glenn, beide Masterstudentinnen aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren.Bereiten Sie zunächst 2 leere Moskitokäfige mit 12 Zentimeter Hülsenöffnungen vor und stellen Sie sicher, dass keine Löcher oder andere Schäden vorhanden sind. Bringen Sie dann mit einem mechanischen Absauger 30 Insekten in einen separaten Käfig, um die Handhabung und Entsorgung nach dem Experiment zu erleichtern. Stellen Sie die Inkubatoren auf die gewünschten Temperaturen ein und lassen Sie sie aufheizen und stabilisieren.Es dauert ungefähr 30 Minuten, um eine Temperatur im Bereich von 25 bis 30 Grad Celsius zu erreichen. Stellen Sie dann einen leeren Moskitokäfig in einen Inkubator und füttern Sie die Hülsen des Käfigs durch das vordere Loch des Inkubators. Bestätigen Sie die Innenlufttemperatur des Inkubators mit einem Temperaturfühler.Als nächstes legen Sie eine mit Klebeband vorbereitete klappbare Klappe über das Loch im Acrylrohr. Rollen Sie den Ärmel, der durch das Loch vor dem ersten Inkubator ragt, hoch und befestigen Sie ihn mit einem Gummizug über einem Ende des Acrylrohrs. Stellen Sie dann die Inkubatoren zueinander hin und führen Sie ein Ende des Acrylrohrs in die Hülse des zweiten Inkubatorlochs ein.Stellen Sie sicher, dass der Durchmesser des Acrylrohrs größer ist als das Loch an der Vorderseite der Inkubatoren, damit es das Loch vollständig bedeckt. Stellen Sie sicher, dass das Acrylrohr nicht locker ist und zwischen den Inkubatoren baumelt. Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie an den Käfighülsen, um überschüssiges Material zwischen dem Käfig und dem Gummiband zu entfernen.Um die Moskitos hineinzulegen, öffnen Sie die Klebebandklappe. Legen Sie einen Trichter in das Loch der Acrylröhre und leeren Sie dann die Insekten durch den Trichter in die Röhre. Entfernen Sie nach dem Entleeren der Insekten den Trichter und decken Sie das Rohrloch mit einer Klebebandklappe ab.Lassen Sie für 30 Minuten für die Insekten, um die bevorzugte Kammer auszuwählen. Beobachten und notieren Sie am Ende der Absetzzeit visuell die Anzahl der Insekten, die in der Acrylrohrbrücke zu sehen sind. Dann klopfen oder blasen Sie alle Insekten in der Brücke zu beiden Seiten des Inkubators oder indem Sie Kohlendioxid in die Brücke freisetzen.Als nächstes kneifen und schließen Sie die Ärmel aus dem Acrylrohr auf beiden Seiten, indem Sie sie schnell mit einem festen Knoten befestigen. Entfernen Sie dann die Käfige aus beiden Inkubatoren und zählen Sie die Insekten in jedem Käfig visuell. Stellen Sie sicher, dass die Zahlen von Inkubatoren und der Brücke 30 ergeben.In der vorliegenden Studie wurde die Temperaturpräferenz der Mücken und Fruchtfliegen mit Hilfe des Zweikammermodells bestimmt. Die Ergebnisse zeigten keinen signifikanten Unterschied, wenn beide Käfige bei 27 Grad Celsius gehalten wurden, was darauf hindeutet, dass die Moskitos frei zwischen Käfigen wählen können, die ihr natürliches Verhalten zeigen. Umgekehrt, wenn die beiden Kammern auf unterschiedliche Temperaturen eingestellt wurden, wählten die Moskitos konsequent die optimale Temperatur von 27 Grad Celsius über 30 Grad Celsius.Als der Aufbau mit Drosophila Melanogaster, einem anderen Ektodermmodell, getestet wurde, mieden die Fruchtfliegen die wärmere Kammer und bevorzugten ihre optimale Temperatur von 25 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass das Setup vollständig versiegelt ist, ohne Verstecke und kein Netz, das den Flugbereich stört, damit die Insekten frei zwischen den 2 Kammern wählen können.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Forschung

Biologie

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

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In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissection der Dünndarm-und Speicheldrüsen von Ae. aegypti Moskitos

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Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

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Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

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Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

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