Name: determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms
Uploaded: 2022-09-28T13:50:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

AHR anerkjenner finansieringsstøtte fra Majlis Amanah Rakyat (MARA).

MERK: Denne protokollen er skrevet for BSL 1 eller 2; for BSL 3-arbeid, utfør hele protokollen inne i et klasse 3 biosikkerhetsskap (hanskeboks).
1. Insektpreparat
<ol><li>Forbered to tomme myggbur (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) med 12 cm hylseåpninger (figur 1). Før du fortsetter med forsøkene, må du sørge for at det ikke er hull eller annen skade på myggburene.</li>
	<li>Ved hjelp av en mekanisk aspirator (en enkel pooter med oppsamlingskammer), overfør 30 insekter (f.eks. Aedes aegypti mygg; her ble kvinner 3-5 dager etter fremveksten brukt), til et eget bur for enklere håndtering og avhending etter forsøket. MERK: Totalt 30 insekter per eksperiment er foreslått, da det er enkelt å håndtere og telle uten høy risiko for myggflukt. Antall insekter som brukes kan justeres for å passe til målet med forsøket.</li>
</ol>2. Oppsett av tokammerapparater
<ol><li>Sett inkubatorene til de ønskede temperaturene, i henhold til inkubatorprodusentens instruksjoner.</li>
	<li>La inkubatorene varme opp og stabilisere seg ved de spesifikke temperaturene, som er <30 minutter for temperaturer i området 25-30 °C. Kontroller lufttemperaturen i inkubatoren med en temperatursonde, for å sikre at inkubatoren er satt opp til den tiltenkte temperaturen.</li>
	<li>Plasser et tomt myggbur i hver inkubator (figur 2A).</li>
	<li>Fôr ermene på buret gjennom det fremre hullet på inkubatoren. Klargjør et deksel som kan åpnes (klaff) med tape og legg det over hullet i akrylrøret (figur 2B).</li>
	<li>Sett akrylrøret inn i hylsen på ett bur på toppen av inkubatorhullet. Diameteren på røret er større enn hullet foran på inkubatorene slik at det helt dekker hullet.</li>
	<li>Stram nettet på hylsen rundt røret med et gummibånd eller gjenbrukbart kabelbånd (figur 2C). Sørg for at akrylrøret ikke er løs og dinglende mellom inkubatorene; Hvis det er det, trekk burhylsene for å fjerne overflødig materiale mellom buret og gummibåndet.</li>
	<li>Plasser begge inkubatorene vendt mot hverandre og gjenta trinn 2.5 og 2.6 med hylsen til den andre inkubatoren. Begge merdene er nå sikkert forbundet gjennom akrylrøret (figur 2D).</li>
</ol>3. Mygg innsetting
<ol><li>Åpne duct tape klaff for mygg innsetting. Plasser en trakt i hullet. Tøm insektene i trakten som er plassert i akrylrøret. MERK: Hvis ønskelig / nødvendig: for mygg, bruk en CO2 penn for å slå ut alle mygg før du plasserer dem i trakten21; for Drosophila, bruk is for å slå insekter ned22.</li>
	<li>Fjern trakten og dekk hullet i røret med tapeklaffen. La i 30 minutter for insekter å velge det foretrukne kammeret. MERK: Hvis CO2 eller is ble brukt, trykk lett på rørbroen for å vekke insektene etter et par minutter.</li>
</ol>4. Myggtelling
<ol><li>Etter 30 minutter, visuelt observere og skrive ned hvor mange insekter som ble funnet i broen (akrylrøret).</li>
	<li>Tap/blås insektene i broen til hver side av kuvøsen. Registrer for å trekke fra det totale antall insekter senere. MERK: Slå ut alle 30 insekter i apparatet ved å slippe CO 2 inn i broen (bruk CO2 for alle insekter da is ikke vil slå ned insekter i burene). Legg også merke til antall insekter i broen som flyr til hver side av inkubatoren.</li>
	<li>Klyp og lukk ermene fra akrylrøret på begge sider, fest raskt med en knute for å lukke burene, og sørg for at gummibåndet fortsatt er intakt for å forhindre at insekter rømmer.</li>
	<li>Fjern burene fra inkubatoren, og tell visuelt insekter i hvert bur (trekk antall insekter fra broen om nødvendig).</li>
	<li>Gjenta trinn 4.4 med det andre buret. Pass på at tallene fra de to inkubatorene og broen legger opp til 30 (eller antall insekter som brukes, hvis forskjellige).</li>
	<li>Hvis tallene ikke summerer seg til det totale antallet insekter som ble brukt i trinn 1.2, se etter de resterende insektene i burhylsen.</li>
</ol>5. Replikering
<ol><li>Når du utfører eksperimenter, må du ta hensyn til mulige eksterne forstyrrelser, for eksempel lysretning, omgivende lukter, etc. For eksempel ved å reversere burene, inkubatororientering og kombinasjoner mellom replikasjoner.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wright, R. K., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+ectotherm+immune+responses.">Temperature effects on ectotherm immune responses.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).</li><li>Deal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature+preferendum+of+certain+insects.">The temperature preferendum of certain insects.</a> The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).</li><li>Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+geographical+distribution+of+the+mosquito,+Culex+pipiens,+in+Canada+under+climate+change.">Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change.</a> Applied Geography. 33, 53-62 (2012).</li><li>Beck-Johnson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+temperature+fluctuations+in+understanding+mosquito+population+dynamics+and+malaria+risk.">The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk.</a> Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).</li><li>Erraguntla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+model+for+microclimatic+temperature+and+its+use+in+mosquito+population+modeling.">Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling.</a> Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).</li><li>Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+effects+of+temperature+on+mosquito+and+parasite+traits+that+determine+the+transmission+potential+of+human+malaria.">Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria.</a> PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+symbiont-dependent+host+detoxification+metabolism+contributes+to+increased+insecticide+susceptibility+of+insects+under+high+temperature.">Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature.</a> The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).</li><li>Amarasekare, P., Savage, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+elucidating+the+temperature+dependence+of+fitness.">A framework for elucidating the temperature dependence of fitness.</a> The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).</li><li>Buckley, L. B., Nufio, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevational+clines+in+the+temperature+dependence+of+insect+performance+and+implications+for+ecological+responses+to+climate+change.">Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change.</a> Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).</li><li>MacLean, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+preference+across+life+stages+and+acclimation+temperatures+investigated+in+four+species+of+Drosophila.">Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila.</a> Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).</li><li>Casta&#241;eda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+potential+of+thermal+preference+and+heat+tolerance+in+Drosophila+subobscura.">Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).</li><li>Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+Mediterranean+fruit+flies+prefer+warmer+temperatures+that+improve+sexual+performance.">Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance.</a> Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).</li><li>Sayeed, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetics+of+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila.">Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).</li><li>Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+preferences+of+subtropical+Aedes+aegypti+and+temperate+Ae.+japonicus+mosquitoes.">Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes.</a> Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).</li><li>Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+analysis+of+the+locomotory+behaviour+of+Aedes+aegypti+and+Ae.+japonicus+mosquitoes+under+different+temperature+regimes+in+a+laboratory+setting.">Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting.</a> Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).</li><li>Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+behaviour+of+Anopheles+stephensi+in+response+to+infection+with+malaria+and+fungal+entomopathogens.">Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens.</a> Malaria Journal. 8, 72 (2009).</li><li>Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+anomalies+in+the+growth+of+selected+bacteria.">Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria.</a> Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).</li><li>Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+thermal+behavior+in+smaller+insects:+A+case+study+in+Drosophila+melanogaster+demonstrates+effects+of+sex,+geographic+origin,+and+rearing+temperature+on+adult+behavior.">Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior.</a> Fly. 10 (4), 149-161 (2016).</li><li>Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+modifies+thermal+preference+in+Drosophila+melanogaster.">Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).</li><li>Reinhold, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specificity+in+thermopreference+and+CO2-gated+heat-seeking+in+Culex+mosquitoes.">Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes.</a> Insects. 13 (1), 92 (2022).</li><li>Lin, C. S., Georghiou, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+mosquito+larvae+and+pupae+to+carbon+dioxide+anesthesia.">Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia.</a> Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).</li><li>Ito, F., Awasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+temperature+preference+behavior+and+effects+of+temperature+on+daily+behavior+in+11+Drosophila+species.">Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).</li><li>Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Scientific Reports. 5, 15298 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Studien beskriver en ny metode for å observere temperaturpreferansen hos mygg. I denne metoden slippes mygg ut i et rør som er koblet til to inkubatorer med uavhengig kontrollerbare temperaturer. På denne måten får myggene fritt velge mellom to temperaturer uten å forstyrre deres naturlige oppførsel og mekanisme for å uttrykke dette valget (f.eks. Å fly).
Vårt første representative eksperiment brukte myggens optimale temperatur på 27 °C i begge kamrene. Under repetisjonene av dette eksperimentet ble mygg observert å være fritt flygende mellom begge burene i hele 30 minutter, og i alle replikasjoner var det nesten like mange i hvert av de to kamrene. Dette bekreftet den eksperimentelle intensjonen om å la myggene muligheten til fritt å velge mellom bur mens de viser sin naturlige oppførsel (flyr). Omvendt benyttet det andre representative eksperimentet den attraktive optimale temperaturen på 27 ° C i ett kammer og en suboptimal og dermed avstøtende temperatur på 30 ° C i det andre kammeret. Som forventet valgte myggene konsekvent det optimale temperaturkammeret med høy betydning, selv når vi byttet inkubatorene for å unngå skjevhet.
Vi testet også oppsettet for et annet insekt, D. melanogaster (bananfluer), som representerer en annen ektoterm modellorganisme. Det ene kammeret ble satt til optimal temperatur på D. melanogaster, 25 °C, og det andre ble satt til 3 °C høyere, 28 °C. I likhet med mygg favoriserte fruktfluer også sin optimale temperatur og unngikk det varmere kammeret. Dette viser at protokollen er egnet for en rekke ektotermer.
Beskrivelse av kritiske trinn i protokollen Det viktigste kritiske trinnet i protokollen er insekthåndtering, da det genererer muligheten for at insekter rømmer. Dette kan forhindres ved å fastslå at det ikke er hull som er store nok til rømning i burene som brukes, at gummibåndene/buntebåndene som brukes til å feste nettinghylsene til broen er tette, og at dekselet til insektinnsettingshullet på broen er forsvarlig festet og forseglet.
Det er også viktig å sikre at insekter ikke rømmer før eller etter forsøket, spesielt når insektene er nødvendige for nedstrøms eksperimentering eller senere tidspunkter for ulike temperaturvalg. Dette kan gjøres ved å bedøve insektene før de plasseres i akrylbroen (ved å bruke is til Drosophila og CO 2 for mygg) og slippe CO2 inn i broen for å slå ned insektene etter forsøkene, før beregning. Bruken av CO2 er ideell for mygg siden det ikke vil påvirke atferdsresultatene21. Hos fluer kan eksponering for CO2 endre flygeatferd23, og det anbefales derfor å bruke is22.
Telling av insekter er også et kritisk skritt for å sikre at antall insekter er like før og etter forsøket for nøyaktige resultater. For å gjøre dette anbefaler vi bruk av en CO2 penn når eksperimentet er fullført for å slå ned insektene som befinner seg i broen. Dette vil bidra til å flytte insekter til hver side av kammeret, og dermed redusere antall rømninger. Vi fremhever også i protokollen at insekter kan fanges i ermene på burene under burseparasjon; Sørg derfor for at disse kontrolleres grundig under telling.
Potensielle modifikasjoner og feilsøking av teknikken Hovedproblemet med denne teknikken er det fleksible nettverket av burhylsene som resulterer i hull eller gjemmesteder og dermed insektflukt eller fangst. Det er noen potensielle modifikasjoner, om nødvendig, for å forbedre teknikken. Vi foreslår at du bruker to eller flere gummibånd for å sikre at broen er forsvarlig festet mellom kamrene uten å etterlate potensiell plass til insektene (løst nett skaper et gjemmested for insekter). Vi anbefaler også spesiell forsiktighet for å trekke maskehylsen stramt, som beskrevet i trinn 2.6, når du monterer apparatet.
Inkubatorer med liten formfaktor oppvarmes vanligvis bare (dvs. har ingen aktiv kjøling), slik tilfellet var for inkubatorene som brukes her. Følgelig vil bruk av temperaturer rundt eller under romtemperaturen kreve at eksperimentet utføres i et kaldt rom for å sikre at temperaturene som er satt for inkubatorene, vil gå så lave som ønsket.
I tillegg kan dette oppsettet også brukes til BSL 3, hvor det er behov for et klasse tre biosikkerhetsskap (hanskeboks). I dette tilfellet må hanskerommet være stort nok til å passe til hele apparatet. Eksperimentet beskrevet i denne protokollen er ideelt for eksperimenter i et hanskerom fordi alt som kreves vil være inneholdt i hanskerommet, og viktigere, muligheten for at insekter rømmer er minimal.
Til slutt er det nok plass i inkubatorene til å legge til eksternt lys eller en fuktighetskilde uten å påvirke insekter i burene. Avhengig av insektart eller eksperimentell design, kan en LED-lampe med 1 cm tykkelse enkelt plasseres på toppen av buret inne i en eller begge inkubatorer. Å gi lys til begge og tilby et temperaturvalg kan være en mer realistisk protokoll for noen lysfølsomme eksperimentelle design, eller bare å gi lys (eller fuktighet) til ett kammer er en mulig modifikasjon av protokollen for å vurdere lys / fuktighetsvalg.
Fordeler med denne teknikken i sammenheng med dual choice temperaturpreferanseanalyser Metoden beskrevet her presenterer et alternativ til den tradisjonelle temperaturgradientmetoden beskrevet i tidligere studier10,13,14,16. I de fleste av disse studiene brukes en stor horisontal aluminiumsblokk med termisk gradient, mens mekanismen for å generere denne gradienten varierer, inkludert oppvarming / kjøleblokker, vannbad, etc. I disse tilfellene produseres temperaturgradienten på overflaten av aluminiumblokken (i stedet for lufttemperaturen i et bur). Følgelig begrenser de fleste (men ikke alle) alternative teknikker flyevnen til insekter mer enn denne protokollen. Her kan insekter fly relativt fritt mellom burene, noe som gir et mer realistisk uttrykk for naturlig atferd i valg. Det ville til og med være mulig å oppskalere dette eksperimentelle apparatet ved hjelp av større bur og inkubatorer, for eksempel for større insekter.
I tillegg til den naturlige atferdsfordelen, demonstrerer vi også svært høy temperaturuniformitet i de to kamrene, noe som muliggjør enkel scoring og et klart utvalg av to store enkelttemperaturkamre. Bruken av et binært storkammerdesign som dette kan redusere støy i dataene, der for eksempel på et gradientapparat vil enhver tilfeldig bevegelse av insektene endre posisjonen på gradienten og dermed deres oppfattede temperaturpreferanse.
Teknikken beskrevet her er også veldig enkel og lav pris. Denne teknikken trenger ikke ekstra apparater for å stille inn temperaturene (dvs. et vannbad10 og / eller en kokeplate 11,12,13,14,15), ikke noe spesialutstyr foruten et kuttet akrylrør og borede hull, og ingen kamera 18,19 eller sofistikert programvare 19 for analyse. Slike komponenter som brukes i andre teknikker kan være dyre og / eller krever betydelig kompetanse og testing for å starte eksperimenter.
Denne teknikken kan også replikeres med forskjellige enheter som bruker batterier hvis det ikke er ekstern strømforsyning, noe som gjør systemet ideelt for å utføre eksperimenter i feltet. Videre kan det samme apparatet modifiseres litt for å studere andre binære valgpreferansesituasjoner, for eksempel lys mot mørk, høy / lav luftfuktighet, etc., enten i laboratoriet eller feltet.
Apparatet i full størrelse i protokollen er betydelig mindre enn temperaturgradientoppsett, noe som gjør det lettere å passe inn i en BSL 3-hanskeboks som beskrevet ovenfor. Videre er insektene lettere å inneholde, da de kan slås ned med CO2 på slutten av forsøket, og burene kan raskt lukkes igjen etter separasjon fra broen. Disse inneslutningsfordelene er ideelle for BSL 3-arbeid.
Vi erkjenner imidlertid at apparatet vårt bare tillater en binær beslutning i stedet for et fritt valg langs en gradient, som, avhengig av applikasjonen, kan kreve ekstra løp for å identifisere optimale temperaturer.

Organismer kan leve og reprodusere bare innenfor deres termiske toleranseområde. Ettersom miljøtemperaturen varierer på grunn av årstider og global oppvarming, må artene tilpasse seg og reagere tilsvarende for å sikre overlevelse. Dette inkluderer ektotermer, hvor kroppstemperaturen er i likevekt med miljøet1. Derfor har hvert insekt sitt eget optimale miljøtemperaturområde som de søker å holde seg innenfor2.
Temperatur er en av de viktige faktorene som brukes til å forutsi fordelingen og rekkevidden av insekter 3,4,5, observere patogen-insektforhold6,7 og effekten av eksterne faktorer på egnetheten til ektotermer som deres voksne levetid, fecundity og fôringshastighet 8,9.
Tidligere studier har undersøkt den foretrukne temperaturen til ektotermer med forskjellige oppsett. Det vanligste er å bruke en stor aluminiumsblokk enten med et avkjølt eller oppvarmet vannbad10, et isbad og programmerbart varmeelement11, kulde- og varmeplater12,13, termiske regulatorplater 14,15 eller en varmepakke og ispakke 16 i hver ende for å skape en temperaturgradient. I tillegg har andre studier også brukt en temperaturgradientinkubator for å studere veksten av utvalgte bakterier17 og montert en aluminiumstang på en termoelektrisk enhet (oppvarmet og avkjølt i enden) for å observere termisk preferanse for Drosophila melanogaster18,19.
Den alternative metoden som foreslås her har imidlertid betydelige fordeler for visse insektapplikasjoner. For det første krever andre løsninger komplett konstruksjon fra bunnen av med grunnleggende materialer, inkludert aluminiumsplater, konstruksjon av akrylkamre for insekter, og ofte et kameraoppsett og spesialprogramvare; Dette kan være dyrt og tidkrevende å sette opp. For det andre er mange alternative apparater avhengige av en temperaturgradient på en overflate (i motsetning til lufttemperatur). Følgelig er kammeret der insektene studeres ofte svært smalt (f.eks. 24 cm lange gradienter med bare 2 cm bredde og 1 cm dybde16), noe som kan forhindre naturlig atferd, for eksempel flyging, som er avgjørende for insekters normale mobilitet og dermed avgjørende for å velge en foretrukket temperatur. Noen studier måler lufttemperaturen; Valget innebærer imidlertid fortsatt å telle antall mygg som lander på Peltier-elementene i motsetning til insekter som flyr fritt i burene20.
I denne studien beskriver vi et enklere oppsett, som bruker minimalt modifisert standardutstyr og gir insekter tilstrekkelig plass til å fly og navigere relativt uhindret i et kolonivedlikeholdsbur i standardstørrelse. Videre, i stedet for å stole på en gradient, bruker protokollen to relativt store seksjoner med konsistent intern temperatur, noe som muliggjør naturlig roaming av insektene ved deres foretrukne temperatur og en enkel binær scoring. Derfor gir apparatet og protokollen beskrevet her en billig og enkel måte å studere myggtemperaturpreferanse i en mindre obstruktiv og mer realistisk setting.
Protokollen innebærer utarbeidelse av insekter før eksperimentet etterfulgt av tokammerapparatoppsettet. Ytterligere trinn inkluderer å plassere insekter i apparatet for å tillate valg av temperatur og scoring av resultater. For en illustrasjon av metoden her, valgte vi optimal (standard oppdrett) temperatur på insektene, 27 °C for Aedes aegypti, 25 °C for Drosophila melanogaster, og en høyere frastøtende temperatur for begge insektartene, henholdsvis 30 °C og 28 °C. Insekter får 30 minutter for å velge et foretrukket kammer. Denne tiden ble funnet å være tilstrekkelig, og en lengre varighet endret ikke resultatene; Dette kan imidlertid utvides avhengig av art/temperatur/andre variabler etter behov.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic tube (Bridge)</td>
			<td>Perspex</td>
			<td>900 mm OD</td>
			<td>Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2) inflator</td>
			<td>Peaken</td>
			<td>B08HM2BDDB</td>
			<td>Any CO2 pen will work&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator (&#215;2)</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384)</td>
			<td>Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm &#8216;holesaw&#8217; drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical aspirator (for mosquitoes)&#160;</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E710</td>
			<td>Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito cage (&#215;3; two for the experiments, one for storing insects)</td>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BD4S1515</td>
			<td>Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diameter of opening = 5 cm 
			Length of funnel = 5 cm 
			Diameter of aperture = 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects)</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E714</td>
			<td>Manual/mouth aspirated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band or Reusable cable tie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Either, depending on preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td>Eidyer</td>
			<td>B07J4T1VQZ</td>
			<td>Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms

De fleste insekter og andre ektotermer har et relativt smalt optimalt temperaturvindu, og avvik fra deres optima kan ha betydelige effekter på deres kondisjon, så vel som andre egenskaper. Følgelig søker mange slike ektotermer sitt optimale temperaturområde. Selv om temperaturpreferanser av mygg og andre insekter har blitt godt studert, utføres det tradisjonelle eksperimentelle oppsettet ved hjelp av en temperaturgradient på en aluminiumoverflate i et svært lukket rom. I noen tilfeller begrenser dette utstyret mange naturlige atferder, for eksempel å fly, noe som kan være viktig i preferansevalg.
Målet med denne studien er å observere insektpreferanse for lufttemperatur ved å bruke et tokammerapparat med tilstrekkelig rom for flyging. De to kamrene består av uavhengige temperaturkontrollerte inkubatorer, hver med stor blenderåpning. Inkubatorene er forbundet med disse åpningene ved hjelp av en kort akrylbro. Inne i inkubatorene er det to nettede bur, koblet sammen via åpningene og broen, slik at insektene kan fly fritt mellom de forskjellige forholdene. Akrylbroen fungerer også som en temperaturgradient mellom de to inkubatorene.
På grunn av det romslige området i buret og enkel konstruksjon, kan denne metoden brukes til å studere enhver liten ektoterm og / eller manipulasjon som kan endre temperaturpreferanse, inkludert sensorisk organmanipulering, diett, tarmflora og endosymbiont tilstedeværelse på biosikkerhetsnivå 1 eller 2 (BSL 1 eller 2). I tillegg kan apparatet brukes til studier av patogeninfeksjon ved bruk av ytterligere inneslutning (f.eks. inne i et biosikkerhetsskap) ved BSL 3.

For å teste effekten og effektiviteten av dette eksperimentelle oppsettet ble 30 mygg testet med samme temperatur i begge inkubatorene i fire replikasjoner (figur 3). Når begge kamrene ble satt til myggens optimale temperatur på 27 °C, var det ingen signifikant forskjell mellom kammerpreferansene (P = 0,342; Wilcoxon signert-rang test). Men når det ene kammeret ble satt til den attraktive optimale temperaturen på 27 ° C og det andre kammeret til en suboptimal temperatur på 30 ° C, viste myggene konsekvent aktiv preferanse mot deres optima (P = 0,029; Wilcoxon signert-rang test; middelverdi på henholdsvis 78,2 % og 21,8 % for 27 °C og 30 °C). Vi testet også ved hjelp av Drosophila for å bestemme anvendeligheten med en annen ektotermmodell, og lignende resultater ble observert.
Temperaturuniformitet i bur Figur 4 viser temperaturuniformiteten til tokammerapparatet. Når de var montert, ble de to sidene satt til 27 ° C og 30 ° C og tillatt å balansere i henhold til instruksjonene gitt her. Alle deler av inkubatoren og broen er innenfor 0,4 °C av den sentrale temperaturen, unntatt (konsekvent) for ett hjørne. Merk at det fremre nederste venstre hjørnet (sett forfra) er et konsekvent hot spot ved både 27 °C og 30 °C. Dette skyldes sannsynligvis at elektronikken til inkubatorkontrollene ligger like under den delen av inkubatoren, i stedet for manipulasjonene som utføres; derfor er det sannsynligvis inkubatormodellspesifikt. Dette viser at manipulasjonen og tilsetningen til inkubatoren har minimal effekt på temperaturuniformiteten. Videre var brotemperaturen mellomliggende mellom de to kamrene, slik at insekter ikke ble konfrontert med et temperaturtrau som de måtte fly gjennom.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig01.jpg"> Figur 1: Beskrivelse av myggburet. Myggbur (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) med 12 cm ermeåpninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig02.jpg"> Figur 2: Bilder og diagram over apparatet under oppsettet . (A) Tomt insektbur plassert i inkubatoren. (B) Akrylrør med et åpent deksel (klaff) laget av tape. (C) Sidevisning av oppsettet med et skjematisk diagram. Masken på hylsen ble strammet rundt akrylrøret med et gummibånd. For disse forsøkene ble 3-5 dager gamle, parrede, kvinnelige Ae. aegypti mygg brukt. (D) Komplett oppsett. To inkubatorer som vender mot hverandre er forbundet med et akrylrør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig03.jpg"> Figur 3: Temperaturpreferanse hos insekter. Tokammerapparatet ble montert i henhold til instruksjonene. Insekter ble satt inn i henhold til protokollen og forlatt i 30 minutter for å velge deres foretrukne kammer (temperatur) og deretter telles. Svarte punkter representerer individuelle replikasjoner, og blå representerer gjennomsnittet. (A) Begge inkubatorene ble satt til samme temperatur (27 °C) og temperaturpreferansen til Ae. aegypti ble observert. (B) Inkubatorer ble satt til forskjellige temperaturer (27 ° C vs. 30 ° C) og temperaturpreferansen til Ae. Aegypti ble observert. (C) Inkubatorer ble satt til forskjellige temperaturer (25 °C vs. 28 °C) og temperaturpreferanse for D. melanogaster ble observert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig04v2.jpg"> Figur 4: Temperaturuniformitet i kamrene og broen. Som beskrevet ble to inkubatorer, to bur og broen montert i henhold til instruksjonene. Temperaturen ble justert til 27 °C på begge inkubatorene og 30 °C i midten. En temperatursonde ble brukt til å måle temperaturen i midten av buret, alle åtte hjørner av inkubatoren og inne i broen. Temperaturene som er målt er vist her. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig04largev2.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Insekter har et optimalt miljøtemperaturområde som de søker å holde seg innenfor, og mange eksterne og interne faktorer kan endre denne preferansen. Her beskriver vi en kostnadseffektiv og enkel metode for å studere temperaturvalg, som gjør at insekter fritt kan vise sin naturlige oppførsel.

Bestemme temperaturpreferanse for mygg og andre ektotermer

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

Dette oppsettet med to kammerapparater brukes til å studere insektenes temperaturpreferanse og kan modifiseres for å studere andre binære valgpreferansesituasjoner som lys versus mørk eller høy versus lav luftfuktighet. De viktigste fordelene med denne teknikken er det enkle oppsettet, det romslige området som gjør at insektene kan vise sin flygende natur når de velger sin foretrukne temperatur, og enkel scoring uten eksternt utstyr. Den vanskeligste delen av protokollen er å fjerne akrylbruddet etter forsøket.Dette er fordi det er stor sjanse for at insektene rømmer. Derfor er det avgjørende for oss å bruke karbondioksidet til å bedøve insektene. Demonstrere prosedyren vil være Kinga Stobierska og Lorna Glenn, begge masterstudenter fra laboratoriet mitt.For å begynne, klargjør 2 tomme myggbur med 12 centimeter hylseåpninger og sørg for at det ikke er hull eller andre skader. Deretter bruker du en mekanisk aspirator, overfører 30 insekter til et eget bur for enklere håndtering og avhending etter forsøket. Sett inkubatorene til de ønskede temperaturene og la dem varme opp og stabilisere seg.Det tar omtrent 30 minutter å oppnå en temperatur i området 25 til 30 grader Celsius. Legg deretter et tomt myggbur i en inkubator og mate ermene på buret gjennom inkubatorens fremre hull. Bekreft innelufttemperaturen til inkubatoren med en temperatursonde.Deretter plasserer du en åpen klaff tilberedt med tape over hullet i akrylrøret. Rull opp ermet som stikker ut gjennom hullet foran den første inkubatoren, og fest den over den ene enden av akrylrøret med et elastisk bånd. Plasser deretter inkubatorene vendt mot hverandre og sett den ene enden av akrylrøret inn i hylsen til det andre inkubatorhullet.Forsikre deg om at diameteren på akrylrøret er større enn hullet foran på inkubatorene slik at den helt dekker hullet. Forsikre deg om at akrylrøret ikke er løs og dingler mellom inkubatorene. Hvis det er det, trekk burhylsene for å fjerne overflødig materiale mellom buret og gummibåndet.For å sette myggene inni, åpne duct tape klaffen. Plasser en trakt i hullet i akrylrøret og tøm deretter insektene inn i røret gjennom trakten. Etter tømming av insekter, fjern trakten og dekk rørhullet med en tapeklaff.La i 30 minutter for insekter å velge det foretrukne kammeret. På slutten av sedimenteringstiden, visuelt observere og skrive ned antall insekter sett i akrylrørbroen. Trykk deretter eller blås alle insektene i broen til hver side av inkubatoren eller ved å slippe karbondioksid inn i broen.Deretter klemmer og lukker du ermene fra akrylrøret på begge sider ved raskt å feste dem med en tett knute. Fjern deretter burene fra begge inkubatorer og visuelt telle insekter i hvert bur. Pass på at tallene fra både inkubatorer og broen legger opp til 30.I denne studien ble temperaturpreferansen til mygg og fruktfluer bestemt ved hjelp av tokammermodellen. Resultatene viste ingen signifikant forskjell når begge burene ble opprettholdt på 27 grader Celsius, noe som indikerer myggens evne til fritt å velge mellom bur som viser sin naturlige oppførsel. Omvendt, når de to kamrene ble satt til forskjellige temperaturer, valgte myggene konsekvent den optimale temperaturen på 27 grader Celsius over 30 grader Celsius.På samme måte, da oppsettet ble testet med Drosophila Melanogaster, en annen ektodermmodell, unngikk bananfluene det varmere kammeret og foretrakk deres optimale temperatur på 25 grader Celsius. Sørg for at oppsettet er helt forseglet uten gjemmesteder og ingen maske som forstyrrer det flygende området, slik at insektene fritt kan velge mellom de 2 kamrene.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design og analyse av temperaturpreferanseatferd og dens døgnrytme i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-deteksjon analysen for Malaria Sending Mygg

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Laboratoriet oppdrett av stabil fluer og andre Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoller for Testing toksisitet av romanen Insecticidal kjemikalier til mygg

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...