Name: determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms
Uploaded: 2022-09-28T13:50:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

AHR признает финансовую поддержку со стороны Меджлиса Амана Ракьят (MARA).

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол написан для BSL 1 или 2; для работы BSL 3 выполните весь протокол в шкафу биобезопасности класса 3 (перчаточном ящике).
1. Подготовка насекомых
<ol><li>Подготовьте две пустые клетки для комаров (17,5 см х 17,5 см х 17,5 см) с отверстиями рукавов по 12 см (рисунок 1). Прежде чем приступить к экспериментам, убедитесь, что в клетках комаров нет отверстий или других повреждений.</li>
	<li>Используя механический аспиратор (простой путер с камерой сбора), перенесите 30 насекомых (например, комаров Aedes aegypti ; здесь использовались самки через 3-5 дней после всходов) в отдельную клетку для облегчения обращения и утилизации после эксперимента. ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается в общей сложности 30 насекомых за эксперимент, поскольку им легко управлять и подсчитывать без высокого риска побега комаров. Количество используемых насекомых может быть скорректировано в соответствии с целью эксперимента.</li>
</ol>2. Двухкамерная аппаратура
<ol><li>Установите инкубаторы на желаемую температуру в соответствии с инструкциями производителя инкубатора.</li>
	<li>Дайте инкубаторам нагреться и стабилизироваться при удельных температурах, что составляет <30 мин для температур в диапазоне 25-30 °C. Проверьте температуру воздуха в инкубаторе с помощью температурного зонда, чтобы убедиться, что инкубатор настроен на нужную температуру.</li>
	<li>Поместите пустую клетку от комаров в каждый инкубатор (рисунок 2А).</li>
	<li>Подайте рукава клетки через переднее отверстие инкубатора. Подготовьте открывающуюся крышку (лоскут) клейкой лентой и поместите ее над отверстием в акриловой трубке (рисунок 2B).</li>
	<li>Вставьте акриловую трубку в рукав одной клетки поверх отверстия инкубатора. Диаметр трубки больше, чем отверстие в передней части инкубаторов, так что она полностью закрывает отверстие.</li>
	<li>Затяните сетку втулки вокруг трубки резинкой или многоразовой кабельной стяжкой (рисунок 2С). Следите за тем, чтобы акриловая трубка не была рыхлой и не болталась между информаторами; если это так, потяните за рукава клетки, чтобы удалить лишний материал между клеткой и резинкой.</li>
	<li>Поставьте оба инкубатора лицом друг к другу и повторите шаги 2.5 и 2.6 с рукавом другого инкубатора. Обе клетки теперь надежно связаны через акриловую трубку (рисунок 2D).</li>
</ol>3. Вставка комаров
<ol><li>Откройте клапан клейкой ленты для введения комаров. Поместите воронку в отверстие. Опорожните насекомых в воронку, которая была помещена в акриловую трубку. ПРИМЕЧАНИЕ: При желании/необходимости: для комаров используйте ручку CO2 , чтобы уничтожить всех комаров, прежде чем помещать их в воронку21; для дрозофилы используйте лед, чтобы сбить насекомыхс ног 22.</li>
	<li>Снимите воронку и закройте отверстие в трубке клапаном клейкой ленты. Оставьте на 30 мин для насекомых, чтобы выбрать предпочтительную камеру. ПРИМЕЧАНИЕ: Если использовался CO2 или лед, слегка постучите по трубчатому мосту, чтобы разбудить насекомых через пару минут.</li>
</ol>4. Подсчет комаров
<ol><li>Через 30 мин визуально наблюдайте и записывайте, сколько насекомых было найдено в мосту (акриловой трубке).</li>
	<li>Постукивайте/дуйте на насекомых в мостике по обе стороны инкубатора. Запись для вычета из общего количества насекомых в дальнейшем. ПРИМЕЧАНИЕ: Выведите из строя всех 30 насекомых в аппарате, выпустив CO2 в мост (используйте CO2 для всех насекомых, так как лед не будет сбивать насекомых в клетках). Кроме того, обратите внимание на количество насекомых в мосту, которые летают по обе стороны инкубатора.</li>
	<li>Зажмите и закройте рукава от акриловой трубки с обеих сторон, быстро застегните узел, чтобы закрыть клетки, и убедитесь, что резинка все еще неповреждена, чтобы предотвратить побег насекомых.</li>
	<li>Извлеките клетки из инкубатора и визуально подсчитайте насекомых в каждой клетке (вычтите количество насекомых с моста, если это необходимо).</li>
	<li>Повторите шаг 4.4 с другой клеткой. Убедитесь, что числа из двух инкубаторов и моста составляют до 30 (или количество используемых насекомых, если оно отличается).</li>
	<li>Если цифры не складываются в общее количество насекомых, используемых на этапе 1.2, найдите оставшихся насекомых в рукаве клетки.</li>
</ol>5. Репликация
<ol><li>При выполнении экспериментов обязательно учитывайте возможные внешние смещения, такие как направление света, запахи окружающей среды и т. Д. Например, путем изменения клеток, ориентации инкубатора и комбинаций между репликами.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wright, R. K., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+ectotherm+immune+responses.">Temperature effects on ectotherm immune responses.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).</li><li>Deal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature+preferendum+of+certain+insects.">The temperature preferendum of certain insects.</a> The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).</li><li>Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+geographical+distribution+of+the+mosquito,+Culex+pipiens,+in+Canada+under+climate+change.">Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change.</a> Applied Geography. 33, 53-62 (2012).</li><li>Beck-Johnson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+temperature+fluctuations+in+understanding+mosquito+population+dynamics+and+malaria+risk.">The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk.</a> Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).</li><li>Erraguntla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+model+for+microclimatic+temperature+and+its+use+in+mosquito+population+modeling.">Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling.</a> Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).</li><li>Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+effects+of+temperature+on+mosquito+and+parasite+traits+that+determine+the+transmission+potential+of+human+malaria.">Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria.</a> PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+symbiont-dependent+host+detoxification+metabolism+contributes+to+increased+insecticide+susceptibility+of+insects+under+high+temperature.">Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature.</a> The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).</li><li>Amarasekare, P., Savage, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+elucidating+the+temperature+dependence+of+fitness.">A framework for elucidating the temperature dependence of fitness.</a> The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).</li><li>Buckley, L. B., Nufio, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevational+clines+in+the+temperature+dependence+of+insect+performance+and+implications+for+ecological+responses+to+climate+change.">Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change.</a> Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).</li><li>MacLean, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+preference+across+life+stages+and+acclimation+temperatures+investigated+in+four+species+of+Drosophila.">Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila.</a> Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).</li><li>Casta&#241;eda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+potential+of+thermal+preference+and+heat+tolerance+in+Drosophila+subobscura.">Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).</li><li>Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+Mediterranean+fruit+flies+prefer+warmer+temperatures+that+improve+sexual+performance.">Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance.</a> Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).</li><li>Sayeed, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetics+of+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila.">Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).</li><li>Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+preferences+of+subtropical+Aedes+aegypti+and+temperate+Ae.+japonicus+mosquitoes.">Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes.</a> Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).</li><li>Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+analysis+of+the+locomotory+behaviour+of+Aedes+aegypti+and+Ae.+japonicus+mosquitoes+under+different+temperature+regimes+in+a+laboratory+setting.">Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting.</a> Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).</li><li>Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+behaviour+of+Anopheles+stephensi+in+response+to+infection+with+malaria+and+fungal+entomopathogens.">Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens.</a> Malaria Journal. 8, 72 (2009).</li><li>Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+anomalies+in+the+growth+of+selected+bacteria.">Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria.</a> Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).</li><li>Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+thermal+behavior+in+smaller+insects:+A+case+study+in+Drosophila+melanogaster+demonstrates+effects+of+sex,+geographic+origin,+and+rearing+temperature+on+adult+behavior.">Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior.</a> Fly. 10 (4), 149-161 (2016).</li><li>Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+modifies+thermal+preference+in+Drosophila+melanogaster.">Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).</li><li>Reinhold, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specificity+in+thermopreference+and+CO2-gated+heat-seeking+in+Culex+mosquitoes.">Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes.</a> Insects. 13 (1), 92 (2022).</li><li>Lin, C. S., Georghiou, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+mosquito+larvae+and+pupae+to+carbon+dioxide+anesthesia.">Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia.</a> Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).</li><li>Ito, F., Awasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+temperature+preference+behavior+and+effects+of+temperature+on+daily+behavior+in+11+Drosophila+species.">Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).</li><li>Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Scientific Reports. 5, 15298 (2015).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

В исследовании описан новый метод наблюдения температурных предпочтений у комаров. При этом способе комаров выпускают в трубку, которая соединена с двумя инкубаторами с независимо контролируемыми температурами. Таким образом, комарам разрешается свободно выбирать между двумя температурами, не нарушая их естественное поведение и механизм выражения этого выбора (например, полет).
В нашем первом репрезентативном эксперименте использовалась оптимальная температура комаров 27 °C в обеих камерах. Во время повторений этого эксперимента было замечено, что комары свободно летают между обеими клетками в течение всех 30 минут, и во всех репликах в каждой из двух камер было почти равное количество. Это подтвердило экспериментальное намерение позволить комарам свободно выбирать между клетками, демонстрируя при этом свое естественное поведение (полет). И наоборот, во втором репрезентативном эксперименте использовалась привлекательная оптимальная температура 27 °C в одной камере и неоптимальная и, следовательно, отталкивающая температура 30 °C во второй камере. Как и ожидалось, комары последовательно выбирали оптимальную температурную камеру при высокой значимости, даже когда мы меняли инкубаторы, чтобы избежать смещения.
Мы также протестировали установку для другого насекомого, D. melanogaster (плодовых мух), представляющего собой другой модельный организм эктотермы. Одна камера была установлена на оптимальную температуру D. melanogaster, 25 °C, а другая была установлена на 3 °C выше, 28 °C. Подобно комарам, плодовые мухи также предпочитали свою оптимальную температуру и избегали более теплой камеры. Это демонстрирует, что протокол подходит для целого ряда эктотерм.
Описание критических шагов в протоколе Основным критическим шагом в протоколе является обращение с насекомыми, поскольку оно создает возможность побега насекомых. Это можно предотвратить, определив, что в используемых клетках нет отверстий, достаточно больших для побега, что резиновые ленты / кабельные стяжки, используемые для крепления сетчатых втулок к мосту, являются плотными и что крышка для отверстия для вставки насекомых на мосту надежно прикреплена и герметизирована.
Также крайне важно обеспечить, чтобы насекомые не убегали до или после эксперимента, особенно когда насекомые необходимы для экспериментов вниз по течению или более поздних временных точек для различных вариантов температуры. Это можно сделать, обезболивая насекомых перед помещением их в акриловый мост (используя лед для дрозофилы и CO2 для комаров) и выпуская CO2 в мост, чтобы сбить насекомых после экспериментов, до расчета. Использование CO2 идеально подходит для комаров, поскольку оно не повлияет на поведенческие результаты21. У мух воздействие CO2 может изменить их летное поведение23, поэтому рекомендуется использовать лед22.
Подсчет насекомых также является критическим шагом, чтобы убедиться, что количество насекомых одинаково до и после эксперимента для получения точных результатов. Для этого мы рекомендуем использовать ручку CO2 после завершения эксперимента, чтобы сбить насекомых, которые находятся в мосту. Это поможет переместить насекомых по обе стороны камеры, тем самым уменьшая количество беглецов. Мы также подчеркиваем в протоколе, что насекомые могут быть пойманы в рукава клеток во время разделения клеток; поэтому убедитесь, что они тщательно проверены во время подсчета.
Возможные модификации и устранение неисправностей техники Основная трудность с этой техникой заключается в гибкой сетке рукавов клетки, что приводит к разрывам или укрытиям и, следовательно, к побегу насекомых или ловушке. Есть некоторые потенциальные модификации, если это необходимо, для улучшения техники. Мы предлагаем использовать две или более резинки, чтобы обеспечить правильное закрепление моста между камерами, не оставляя потенциального пространства для насекомых (свободная сетка создает укрытие для насекомых). Мы также советуем с особой осторожностью натягивать сетчатую втулку, как описано в шаге 2.6, при сборке аппарата.
Инкубаторы малого форм-фактора обычно только нагреваются (т.е. не имеют активного охлаждения), как это было в случае с инкубаторами, используемыми здесь. Следовательно, использование температур вокруг или ниже температуры окружающей среды в помещении потребует проведения эксперимента в холодной камере, чтобы гарантировать, что температуры, установленные для инкубаторов, будут настолько низкими, насколько это необходимо.
Кроме того, эта установка также может быть использована для BSL 3, где необходим шкаф биобезопасности третьего класса (бардачок). В этом случае бардачок должен быть достаточно большим, чтобы вместить весь аппарат. Эксперимент, описанный в этом протоколе, идеально подходит для экспериментов в бардачке, потому что все необходимое будет содержаться в перчаточном ящике и, что важно, возможность побега насекомых минимальна.
Наконец, в инкубаторах достаточно места, чтобы добавить внешний свет или источник влажности, не влияя на насекомых в клетках. В зависимости от вида насекомых или экспериментальной конструкции светодиодная лампа толщиной 1 см может быть легко размещена поверх клетки внутри одного или обоих инкубаторов. Предоставление света обоим и выбор температуры может быть более реалистичным протоколом для некоторых фоточувствительных экспериментальных конструкций, или только обеспечение света (или влажности) в одной камере является возможной модификацией протокола для оценки выбора света / влажности.
Преимущества данного метода в контексте анализа температурных предпочтений с двойным выбором Метод, описанный здесь, представляет собой альтернативу традиционному методу градиента температуры, описанному в предыдущих исследованиях 10,13,14,16. В большинстве этих исследований используется большой горизонтальный алюминиевый блок с тепловым градиентом, при этом механизм генерации этого градиента варьируется, включая нагревательные/охлаждающие блоки, водяные бани и т.д. В этих случаях градиент температуры создается на поверхности алюминиевого блока (а не температура воздуха в клетке). Следовательно, большинство (но не все) альтернативные методы ограничивают способность насекомых к полету больше, чем этот протокол. Здесь насекомые могут относительно свободно летать между клетками, что позволяет более реалистично выражать естественное поведение в выборе. Можно было бы даже масштабировать этот экспериментальный аппарат, используя большие клетки и инкубаторы, например, для более крупных насекомых.
В дополнение к естественному преимуществу поведения, мы также демонстрируем очень высокую однородность температуры в двух камерах, что позволяет легко оценивать и четко выбирать две большие одиночные температурные камеры. Использование двоичной конструкции большой камеры, такой как эта, может уменьшить шум в данных, где, например, на градиентном устройстве, любое случайное движение насекомых изменит положение на градиенте и, следовательно, их воспринимаемые температурные предпочтения.
Техника, описанная здесь, также очень проста и недорога. Этот метод не нуждается в дополнительных приборах для установки температуры (например, водяная баня10 и / или конфорка 11,12,13,14,15), никакого специального оборудования, кроме разрезанной акриловой трубки и просверленных отверстий, и никакой камеры18,19 или сложного программного обеспечения19 для анализа. Такие компоненты, используемые в других методах, могут быть дорогостоящими и/или требовать значительных знаний и испытаний для начала экспериментов.
Этот метод также может быть воспроизведен с различными устройствами, которые используют батареи, если нет внешнего источника питания, что делает систему идеальной для проведения экспериментов в полевых условиях. Кроме того, тот же аппарат может быть слегка модифицирован для изучения других ситуаций предпочтения бинарного выбора, таких как свет против темноты, высокая / низкая влажность и т. Д., Либо в лаборатории, либо в полевых условиях.
Полноразмерное устройство в протоколе значительно меньше, чем настройки градиента температуры, что позволяет легче помещаться внутрь перчаточного ящика BSL 3, как описано выше. Кроме того, насекомых легче содержать, так как они могут быть сбиты с ног CO2 в конце эксперимента, а клетки могут быть быстро запечатаны после отделения от моста. Эти преимущества защитной оболочки идеально подходят для работы BSL 3.
Однако мы признаем, что наш аппарат допускает только двоичное решение, а не свободный выбор вдоль градиента, что, в зависимости от приложения, может потребовать дополнительных запусков для определения оптимальных температур.

Организмы могут жить и размножаться только в пределах своего диапазона тепловой толерантности. Поскольку температура окружающей среды меняется из-за смены сезонов и глобального потепления, виды должны адаптироваться и реагировать соответствующим образом, чтобы обеспечить свое выживание. Сюда относятся эктотермы, где температура тела находится в равновесии с окружающей средой1. Следовательно, каждое насекомое имеет свой собственный оптимальный температурный диапазон окружающей среды, который они стремятся оставаться в пределах2.
Температура является одним из важных факторов, используемых для прогнозирования распределения и ареала насекомых 3,4,5, наблюдения за взаимоотношениями патоген-насеком 6,7 и влиянием внешних факторов на приспособленность эктотерм, таких как их взрослая продолжительность жизни, плодовитость и скорость питания 8,9.
Предыдущие исследования исследовали предпочтительную температуру эктотерм с различными установками. Наиболее распространенным является использование большого алюминиевого блока с охлаждаемой или нагретой водяной баней10, ледяной ванны и программируемым нагревательным элементом11, холодной и конфоркой 12,13, пластинами терморегулятора 14,15 или тепловым пакетом и пакетом со льдом16 на обоих концах для создания градиента температуры. Кроме того, в других исследованиях также использовался инкубатор градиента температуры для изучения роста выбранных бактерий17 и установлен алюминиевый стержень на термоэлектрическом устройстве (нагретом и охлажденном на концах) для наблюдения теплового предпочтения Drosophila melanogaster18,19.
Однако альтернативная методология, предложенная здесь, имеет значительные преимущества для некоторых применений насекомых. Во-первых, другие решения требуют полного строительства с нуля из основных материалов, включая алюминиевые листы, строительство акриловых камер для насекомых и часто настройку камеры и специальное программное обеспечение; это может быть дорогостоящим и трудоемким для настройки. Во-вторых, многие альтернативные аппараты полагаются на градиент температуры на поверхности (в отличие от температуры воздуха). Следовательно, камера, в которой изучаются насекомые, часто очень узкая (например, градиенты длиной 24 см с шириной всего 2 см и глубиной 1см 16), что может препятствовать естественному поведению, такому как полет, которые необходимы для нормальной мобильности насекомых и, следовательно, необходимы при выборе предпочтительной температуры. Некоторые исследования действительно измеряют температуру воздуха; тем не менее, оценка выбора по-прежнему включает в себя подсчет количества комаров, приземляющихся на элементы Пельтье, в отличие от насекомых, свободно летающих в клетках20.
В этом исследовании мы описываем более простую установку, которая использует минимально модифицированное стандартное оборудование и предоставляет насекомым достаточно места для полета и относительно беспрепятственной навигации в клетке для содержания колоний стандартного размера. Кроме того, вместо того, чтобы полагаться на градиент, протокол использует два относительно больших участка с постоянной внутренней температурой, что позволяет естественным образом перемещать насекомых при их предпочтительной температуре и простую двоичную оценку. Следовательно, устройство и протокол, описанные здесь, обеспечивают недорогое и простое средство изучения температурных предпочтений комаров в менее обструктивной и более реалистичной обстановке.
Протокол включает в себя подготовку насекомых перед экспериментом с последующей установкой двухкамерного аппарата. Дальнейшие шаги включают размещение насекомых в аппарате, чтобы обеспечить выбор температуры и оценку результатов. Для иллюстрации метода здесь мы выбрали оптимальную (стандартную для выращивания) температуру насекомых, 27 ° C для Aedes aegypti, 25 ° C для Drosophila melanogaster и более высокую температуру отпугивания для обоих видов насекомых, 30 ° C и 28 ° C соответственно. Насекомым дается 30 мин, чтобы выбрать предпочтительную камеру. Этого времени было признано достаточным, и более длительная продолжительность не изменила результатов; однако это может быть расширено в зависимости от вида/температуры/других переменных по мере необходимости.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic tube (Bridge)</td>
			<td>Perspex</td>
			<td>900 mm OD</td>
			<td>Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2) inflator</td>
			<td>Peaken</td>
			<td>B08HM2BDDB</td>
			<td>Any CO2 pen will work&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator (&#215;2)</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384)</td>
			<td>Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm &#8216;holesaw&#8217; drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical aspirator (for mosquitoes)&#160;</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E710</td>
			<td>Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito cage (&#215;3; two for the experiments, one for storing insects)</td>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BD4S1515</td>
			<td>Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diameter of opening = 5 cm 
			Length of funnel = 5 cm 
			Diameter of aperture = 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects)</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E714</td>
			<td>Manual/mouth aspirated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band or Reusable cable tie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Either, depending on preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td>Eidyer</td>
			<td>B07J4T1VQZ</td>
			<td>Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms

Большинство насекомых и других эктотерм имеют относительно узкое оптимальное температурное окно, и отклонение от их оптима может оказать существенное влияние на их приспособленность, а также другие характеристики. Следовательно, многие такие эктотермы ищут свой оптимальный температурный диапазон. Хотя температурные предпочтения комаров и других насекомых были хорошо изучены, традиционная экспериментальная установка выполняется с использованием градиента температуры на алюминиевой поверхности в сильно закрытом пространстве. В некоторых случаях это оборудование ограничивает многие естественные виды поведения, такие как полет, что может быть важно при выборе предпочтений.
Целью данного исследования является наблюдение за предпочтениями насекомых температуре воздуха с помощью двухкамерного аппарата с достаточным пространством для полета. Две камеры состоят из независимых инкубаторов с контролируемой температурой, каждый из которых имеет большое отверстие. Инкубаторы соединены этими отверстиями с помощью короткого акрилового моста. Внутри инкубаторов находятся две сетчатые клетки, связанные через отверстия и мост, что позволяет насекомым свободно летать между различными условиями. Акриловый мост также действует как градиент температуры между двумя инкубаторами.
Благодаря просторной площади в клетке и легкой конструкции, этот метод может быть использован для изучения любой небольшой эктотермы и / или любой манипуляции, которая может изменить температурные предпочтения, включая манипуляции с органами чувств, диету, кишечную флору и присутствие эндосимбионта на уровнях биобезопасности 1 или 2 (BSL 1 или 2). Кроме того, аппарат может быть использован для исследования патогенной инфекции с использованием дополнительной локализации (например, внутри шкафа биобезопасности) в BSL 3.

Чтобы проверить эффективность и результативность этой экспериментальной установки, 30 комаров были протестированы с одинаковой температурой в обоих инкубаторах в четырех репликах (рисунок 3). Когда в обеих камерах была установлена оптимальная температура комаров 27 °C, не было существенной разницы между предпочтениями камеры (P = 0,342; Тест Уилкоксона с подписанным рангом). Однако, когда одна камера была установлена на привлекательную оптимальную температуру 27 °C, а другая камера на неоптимальную температуру 30 °C, комары последовательно демонстрировали активное предпочтение по отношению к своей оптиме (P = 0,029; Тест Уилкоксона с подписным рангом; среднее значение 78,2% и 21,8% для 27 °C и 30 °C соответственно). Мы также протестировали с использованием дрозофилы для определения применимости с другой моделью эктотермы, и аналогичные результаты наблюдались.
Однородность температуры в клетках На рисунке 4 показана однородность температуры двухкамерного аппарата. После сборки обе стороны были установлены на 27 ° C и 30 ° C и позволили уравновесить в соответствии с инструкциями, приведенными здесь. Все части инкубатора и моста находятся в пределах 0,4 °C от центральной температуры, за исключением (последовательно) одного угла. Обратите внимание, что передний нижний левый угол (если смотреть спереди) является постоянной горячей точкой как при 27 ° C, так и при 30 ° C. Вероятно, это связано с тем, что электроника органов управления инкубатором расположена непосредственно под этой секцией инкубатора, а не с выполняемыми манипуляциями; следовательно, он, вероятно, зависит от модели инкубатора. Это свидетельствует о том, что манипуляции и добавление в инкубатор оказывают минимальное влияние на равномерность температуры. Кроме того, температура моста была промежуточной между двумя камерами, гарантируя, что насекомые не столкнутся с температурным желобом, через который им придется пролететь.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig01.jpg"> Рисунок 1: Описание клетки от комаров. Клетка для комаров (17,5 см x 17,5 см x 17,5 см) с отверстиями рукава 12 см. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig02.jpg"> Рисунок 2: Рисунки и схема аппарата во время установки. (А) Пустая клетка от насекомых помещена в инкубатор. (B) Акриловая трубка с открывающейся крышкой (заслонкой) из клейкой ленты. (C) Вид сбоку установки с принципиальной схемой. Сетка рукава была затянута вокруг акриловой трубки резинкой. Для этих экспериментов использовались 3-5 дневные, спаренные, самки комаров Ae. aegypti . (D) Полная настройка. Два инкубатора, обращенные друг к другу, соединены акриловой трубкой. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig03.jpg"> Рисунок 3: Температурные предпочтения у насекомых. Двухкамерный аппарат был собран в соответствии с инструкцией. Насекомых вводили в соответствии с протоколом и оставляли на 30 минут, чтобы выбрать предпочтительную камеру (температуру), а затем подсчитывали. Черные точки представляют отдельные реплики, а синие — среднее. (A) В обоих инкубаторах была установлена одинаковая температура (27 °C), и наблюдалось температурное предпочтение Ae. aegypti . (B) Инкубаторы были настроены на различные температуры (27 °C против 30 °C) и температурные предпочтения Ae. Наблюдался Аегипти . (C) Инкубаторы были установлены на различные температуры (25 °C против 28 °C) и наблюдалось температурное предпочтение D. melanogaster . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig04v2.jpg"> Рисунок 4: Однородность температуры внутри камер и моста. Как описано, два инкубатора, две клетки и мост были собраны в соответствии с инструкцией. Температура была отрегулирована до 27 °C на обоих инкубаторах и 30 °C в центре. Температурный зонд использовался для измерения температуры в центре клетки, во всех восьми углах инкубатора и внутри моста. Измеренные температуры показаны здесь. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig04largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Насекомые имеют оптимальный диапазон температур окружающей среды, в котором они стремятся оставаться, и многие внешние и внутренние факторы могут изменить это предпочтение. Здесь мы описываем экономически эффективный и простой метод изучения выбора температуры, который позволяет насекомым свободно демонстрировать свое естественное поведение.

Определение температурных предпочтений комаров и других эктотерм

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

Эта двухкамерная аппаратная установка используется для изучения температурных предпочтений насекомых и может быть модифицирована для изучения других ситуаций предпочтения бинарного выбора, таких как свет против темноты или высокая или низкая влажность. Основными преимуществами этой техники являются простая настройка, просторная площадь, которая позволяет насекомым проявлять свою летающую природу при выборе предпочтительной температуры, и легкая оценка без внешнего оборудования. Самой сложной частью протокола является удаление акрилового бреши после эксперимента.Это связано с тем, что существует высокая вероятность побега насекомых. Таким образом, для нас крайне важно использовать углекислый газ для обезболивания насекомых. Демонстрировать процедуру будут Кинга Стобирска и Лорна Гленн, оба магистранты из моей лаборатории.Для начала подготовьте 2 пустые клетки для комаров с 12-сантиметровыми отверстиями рукавов и убедитесь, что нет отверстий или других повреждений. Затем с помощью механического аспиратора переведите 30 насекомых в отдельную клетку для облегчения обращения и утилизации после эксперимента. Установите инкубаторы на нужные температуры и дайте им нагреться и стабилизироваться.Для достижения температуры в диапазоне от 25 до 30 градусов по Цельсию требуется примерно 30 минут. Затем поместите пустую клетку от комаров в инкубатор и подайте рукава клетки через переднее отверстие инкубатора. Подтвердите внутреннюю температуру воздуха инкубатора с помощью температурного зонда.Затем поместите открывающуюся заслонку, подготовленную клейкой лентой, над отверстием в акриловой трубке. Засучите рукав, выступающий через отверстие перед первым инкубатором, и закрепите его над одним концом акриловой трубки эластичной лентой. Затем поместите инкубаторы лицом друг к другу и вставьте один конец акриловой трубки в рукав второго отверстия инкубатора.Убедитесь, что диаметр акриловой трубки больше, чем отверстие в передней части инкубаторов, чтобы она полностью закрывала отверстие. Убедитесь, что акриловая трубка не свободна и не болтается между инкубаторами. Если это так, потяните за рукава клетки, чтобы удалить лишний материал между клеткой и резинкой.Чтобы поместить комаров внутрь, откройте клапан клейкой ленты. Поместите воронку в отверстие акриловой трубки, а затем опорожните насекомых в трубку через воронку. После опорожнения насекомых снимите воронку и закройте отверстие трубки клапаном клейкой ленты.Оставьте на 30 минут, чтобы насекомые выбрали предпочтительную камеру. В конце времени успокоения визуально наблюдайте и записывайте количество насекомых, замеченных в акриловом трубчатом мосту. Затем постучите или сдуйте всех насекомых в мосту по обе стороны инкубатора или выпустив углекислый газ в мост.Далее зажмите и закройте рукава от акриловой трубки с обеих сторон, быстро скрепив их тугим узлом. Затем выньте клетки из обоих инкубаторов и визуально подсчитайте насекомых в каждой клетке. Убедитесь, что номера обоих инкубаторов и моста составляют до 30.В настоящем исследовании температурные предпочтения комаров и плодовых мушек были определены с использованием двухкамерной модели. Результаты не показали существенной разницы, когда обе клетки поддерживались на уровне 27 градусов по Цельсию, что указывает на способность комаров свободно выбирать между клетками, демонстрируя свое естественное поведение. И наоборот, когда две камеры были установлены при разных температурах, комары последовательно выбирали оптимальную температуру 27 градусов по Цельсию над 30 градусами Цельсия.Аналогичным образом, когда установка была протестирована с Drosophila Melanogaster, другой эктодермной моделью плодовых мушек избегала более теплой камеры и предпочитала их оптимальную температуру 25 градусов по Цельсию. Убедитесь, что установка полностью герметизирована без укрытий и сетки, нарушающей зону полета, чтобы насекомые могли свободно выбирать между 2 камерами.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Введение. stephensi Эмбрионы для генерации устойчивых к малярии комаров

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Микроинъекция А. Эмбрионы aegypti получить Трансгенные комары

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Препарирование Средняя кишка и слюнных желез от Ae. aegypti комаров

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Предотвращение распространения малярии и лихорадки денге с использованием генетически модифицированных комаров

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Подсчет голосов и определение жизнеспособности культивируемых клеток

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Сбор и подготовка Drosophila Эмбрионы для Электрофизиологические Запись и другие процедуры

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Дизайн и анализ поведения предпочтения температуры и его циркадный ритм в Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Анализ Multi-обнаружения малярии комарами

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Лаборатория воспитания стабильной мух и других Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Протоколы для испытания на токсичность новых инсектицидных химия комаров

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...