Name: determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms
Uploaded: 2022-09-28T13:50:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

AHR erkänner finansieringsstöd från Majlis Amanah Rakyat (MARA).

OBS: Detta protokoll är skrivet för BSL 1 eller 2; för BSL 3-arbete, utför hela protokollet i ett klass 3-biosäkerhetsskåp (handskfack).
1. Insektsberedning
<ol><li>Förbered två tomma myggburar (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) med 12 cm ärmöppningar (figur 1). Innan du fortsätter med experimenten, se till att det inte finns några hål eller annan skada på myggburarna.</li>
	<li>Använd en mekanisk aspirator (en enkel pooter med en uppsamlingskammare), överför 30 insekter (t.ex. Aedes aegypti-myggor ; här användes honor 3-5 dagar efter uppkomsten) till en separat bur för enklare hantering och bortskaffande efter experimentet. OBS: Totalt 30 insekter per experiment föreslås eftersom det är lätt att hantera och räkna utan hög risk för myggflykt. Antalet insekter som används kan justeras för att passa målet med experimentet.</li>
</ol>2. Installation av tvåkammarapparater
<ol><li>Ställ in inkubatorerna till önskade temperaturer, enligt inkubatortillverkarens instruktioner.</li>
	<li>Låt inkubatorerna värmas upp och stabiliseras vid de specifika temperaturerna, vilket är <30 min för temperaturer i intervallet 25-30 °C. Kontrollera lufttemperaturen i inkubatorn med en temperatursond för att säkerställa att inkubatorn är inställd på den avsedda temperaturen.</li>
	<li>Placera en tom myggbur i varje inkubator (figur 2A).</li>
	<li>Mata burets ärmar genom inkubatorns främre hål. Förbered ett öppningsbart lock (klaff) med silvertejp och placera det över hålet i akrylröret (figur 2B).</li>
	<li>Sätt in akrylröret i hylsan på en bur ovanpå inkubatorhålet. Rörets diameter är större än hålet på inkubatorernas framsida så att det helt täcker hålet.</li>
	<li>Dra åt hylsans nät runt röret med ett gummiband eller återanvändbart buntband (bild 2C). Se till att akrylröret inte är löst och dinglar mellan inkubatorerna; Om så är fallet, dra i burhylsorna för att ta bort överflödigt material mellan buret och gummibandet.</li>
	<li>Placera båda inkubatorerna vända mot varandra och upprepa steg 2,5 och 2,6 med hylsan på den andra inkubatorn. Båda burarna är nu ordentligt förbundna genom akrylröret (figur 2D).</li>
</ol>3. Mygginsättning
<ol><li>Öppna silvertejpfliken för mygginsättning. Placera en tratt i hålet. Töm insekterna i tratten som har placerats i akrylröret. OBS: Om så önskas / krävs: för myggor, använd en CO2-penna för att slå ut alla myggor innan du placerar dem i tratten21; för Drosophila, använd is för att slå ner insekter22.</li>
	<li>Ta bort tratten och täck hålet i röret med silvertejpklaffen. Låt stå i 30 minuter för insekter att välja önskad kammare. OBS: Om CO2 eller is användes, knacka lätt på rörbryggan för att väcka insekterna efter några minuter.</li>
</ol>4. Myggräkning
<ol><li>Efter 30 min, observera visuellt och skriv ner hur många insekter som hittades i bron (akrylröret).</li>
	<li>Knacka/blås insekterna i bron till vardera sidan av kuvösen. Spela in för att dra av från det totala antalet insekter senare. OBS: Slå ut alla 30 insekter i apparaten genom att släppa ut CO 2 i bron (använd CO2 för alla insekter eftersom is inte kommer att slå ner insekter i burarna). Notera också antalet insekter i bron som flyger till vardera sidan av inkubatorn.</li>
	<li>Nyp och stäng ärmarna från akrylröret på båda sidor, fäst snabbt med en knut för att stänga burarna och se till att gummibandet fortfarande är intakt för att förhindra att insekter släpper ut.</li>
	<li>Ta bort burarna från inkubatorn och räkna visuellt insekterna i varje bur (dra av antalet insekter från bron om det behövs).</li>
	<li>Upprepa steg 4.4 med den andra buren. Se till att siffrorna från de två inkubatorerna och bron lägger till upp till 30 (eller antalet insekter som används, om de är olika).</li>
	<li>Om siffrorna inte stämmer överens med det totala antalet insekter som används i steg 1.2, leta efter de återstående insekterna i burhylsan.</li>
</ol>5. Replikering
<ol><li>När du utför experiment, var noga med att ta hänsyn till eventuella yttre förspänningar, såsom ljusriktning, omgivande lukt etc. Till exempel genom att vända burarna, inkubatororienteringen och kombinationerna mellan replikaten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wright, R. K., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+ectotherm+immune+responses.">Temperature effects on ectotherm immune responses.</a> Developmental &amp; Comparative Immunology. 5, 117-122 (1981).</li><li>Deal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature+preferendum+of+certain+insects.">The temperature preferendum of certain insects.</a> The Journal of Animal Ecology. 10 (2), 323-356 (1941).</li><li>Hongoh, V., Berrang-Ford, L., Scott, M. E., Lindsay, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+geographical+distribution+of+the+mosquito,+Culex+pipiens,+in+Canada+under+climate+change.">Expanding geographical distribution of the mosquito, Culex pipiens, in Canada under climate change.</a> Applied Geography. 33, 53-62 (2012).</li><li>Beck-Johnson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+temperature+fluctuations+in+understanding+mosquito+population+dynamics+and+malaria+risk.">The importance of temperature fluctuations in understanding mosquito population dynamics and malaria risk.</a> Royal Society Open Science. 4 (3), 160969 (2017).</li><li>Erraguntla, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+model+for+microclimatic+temperature+and+its+use+in+mosquito+population+modeling.">Predictive model for microclimatic temperature and its use in mosquito population modeling.</a> Scientific Reports. 11 (1), 18909 (2021).</li><li>Shapiro, L. L., Whitehead, S. A., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+effects+of+temperature+on+mosquito+and+parasite+traits+that+determine+the+transmission+potential+of+human+malaria.">Quantifying the effects of temperature on mosquito and parasite traits that determine the transmission potential of human malaria.</a> PLoS Biology. 15 (10), 20033489 (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+symbiont-dependent+host+detoxification+metabolism+contributes+to+increased+insecticide+susceptibility+of+insects+under+high+temperature.">Decline in symbiont-dependent host detoxification metabolism contributes to increased insecticide susceptibility of insects under high temperature.</a> The ISME Journal. 15 (12), 3693-3703 (2021).</li><li>Amarasekare, P., Savage, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+elucidating+the+temperature+dependence+of+fitness.">A framework for elucidating the temperature dependence of fitness.</a> The American Naturalist. 179 (2), 178-191 (2012).</li><li>Buckley, L. B., Nufio, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevational+clines+in+the+temperature+dependence+of+insect+performance+and+implications+for+ecological+responses+to+climate+change.">Elevational clines in the temperature dependence of insect performance and implications for ecological responses to climate change.</a> Conservation Physiology. 2 (1), 035 (2014).</li><li>MacLean, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+preference+across+life+stages+and+acclimation+temperatures+investigated+in+four+species+of+Drosophila.">Temperature preference across life stages and acclimation temperatures investigated in four species of Drosophila.</a> Journal of Thermal Biology. 86, 102428 (2019).</li><li>Casta&#241;eda, L. E., Romero-Soriano, V., Mesas, A., Roff, D. A., Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+potential+of+thermal+preference+and+heat+tolerance+in+Drosophila+subobscura.">Evolutionary potential of thermal preference and heat tolerance in Drosophila subobscura.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (8), 818-824 (2019).</li><li>Weldon, C. W., Terblanche, J. S., Bosua, H., Malod, K., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+Mediterranean+fruit+flies+prefer+warmer+temperatures+that+improve+sexual+performance.">Male Mediterranean fruit flies prefer warmer temperatures that improve sexual performance.</a> Journal of Thermal Biology. 108, 103298 (2022).</li><li>Sayeed, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetics+of+thermosensation+and+hygrosensation+in+Drosophila.">Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (12), 6079-6084 (1996).</li><li>Verhulst, N. O., Brendle, A., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+preferences+of+subtropical+Aedes+aegypti+and+temperate+Ae.+japonicus+mosquitoes.">Thermal preferences of subtropical Aedes aegypti and temperate Ae. japonicus mosquitoes.</a> Journal of Thermal Biology. 91, 102637 (2020).</li><li>Ziegler, R., Blanckenhorn, W. U., Mathis, A., Verhulst, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+analysis+of+the+locomotory+behaviour+of+Aedes+aegypti+and+Ae.+japonicus+mosquitoes+under+different+temperature+regimes+in+a+laboratory+setting.">Video analysis of the locomotory behaviour of Aedes aegypti and Ae. japonicus mosquitoes under different temperature regimes in a laboratory setting.</a> Journal of Thermal Biology. 105, 103205 (2022).</li><li>Blanford, S., Read, A. F., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+behaviour+of+Anopheles+stephensi+in+response+to+infection+with+malaria+and+fungal+entomopathogens.">Thermal behaviour of Anopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens.</a> Malaria Journal. 8, 72 (2009).</li><li>Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-related+anomalies+in+the+growth+of+selected+bacteria.">Temperature-related anomalies in the growth of selected bacteria.</a> Journal of Dairy Science. 54 (12), 1780-1783 (1971).</li><li>Rajpurohit, S., Schmidt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+thermal+behavior+in+smaller+insects:+A+case+study+in+Drosophila+melanogaster+demonstrates+effects+of+sex,+geographic+origin,+and+rearing+temperature+on+adult+behavior.">Measuring thermal behavior in smaller insects: A case study in Drosophila melanogaster demonstrates effects of sex, geographic origin, and rearing temperature on adult behavior.</a> Fly. 10 (4), 149-161 (2016).</li><li>Truitt, A. M., Kapun, M., Kaur, R., Miller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+modifies+thermal+preference+in+Drosophila+melanogaster.">Wolbachia modifies thermal preference in Drosophila melanogaster.</a> Environmental Microbiology. 21 (9), 3259-3268 (2019).</li><li>Reinhold, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specificity+in+thermopreference+and+CO2-gated+heat-seeking+in+Culex+mosquitoes.">Species-specificity in thermopreference and CO2-gated heat-seeking in Culex mosquitoes.</a> Insects. 13 (1), 92 (2022).</li><li>Lin, C. S., Georghiou, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+of+mosquito+larvae+and+pupae+to+carbon+dioxide+anesthesia.">Tolerance of mosquito larvae and pupae to carbon dioxide anesthesia.</a> Mosquito News. 36 (4), 460-461 (1976).</li><li>Ito, F., Awasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+temperature+preference+behavior+and+effects+of+temperature+on+daily+behavior+in+11+Drosophila+species.">Comparative analysis of temperature preference behavior and effects of temperature on daily behavior in 11 Drosophila species.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1-15 (2022).</li><li>Bartholomew, N., Burdett, J., VandenBrooks, J., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Scientific Reports. 5, 15298 (2015).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Studien beskriver en ny metod för att observera temperaturpreferensen hos myggor. I denna metod släpps myggor i ett rör som är anslutet till två inkubatorer med oberoende kontrollerbara temperaturer. På detta sätt får myggorna fritt välja mellan två temperaturer utan att störa deras naturliga beteenden och mekanism för att uttrycka detta val (t.ex. flygning).
Vårt första representativa experiment använde myggans optimala temperatur på 27 °C i båda kamrarna. Under upprepningarna av detta experiment observerades myggor flyga fritt mellan båda burarna under hela 30 minuter, och i alla replikat var det nästan lika många i var och en av de två kamrarna. Detta bekräftade den experimentella avsikten att låta myggorna fritt välja mellan burar samtidigt som de uppvisar sina naturliga beteenden (flygning). Omvänt använde det andra representativa experimentet den attraktiva optimala temperaturen på 27 ° C i en kammare och en suboptimal och därmed avvisande temperatur på 30 ° C i den andra kammaren. Som förväntat valde myggor konsekvent den optimala temperaturkammaren med hög betydelse, även när vi bytte inkubatorerna för att undvika förspänning.
Vi testade också upplägget för en annan insekt, D. melanogaster (bananflugor), som representerar en annan ektotermmodellorganism. Den ena kammaren ställdes in på den optimala temperaturen D. melanogaster, 25 °C, och den andra ställdes in på 3 °C högre, 28 °C. I likhet med myggor gynnade fruktflugor också sin optimala temperatur och undvek den varmare kammaren. Detta visar att protokollet är lämpligt för en rad ektotermer.
Beskrivning av kritiska steg i protokollet Det viktigaste kritiska steget i protokollet är insektshantering, eftersom det genererar möjligheten att insekter flyr. Detta kan förhindras genom att fastställa att det inte finns några hål som är tillräckligt stora för att komma ut i de burar som används, att gummibanden/buntbanden som används för att fästa näthylsorna i bryggan är täta och att locket för insektsinsättningshålet på bron är ordentligt fastsatt och förseglat.
Det är också viktigt att se till att insekter inte flyr före eller efter experimentet, särskilt när insekterna krävs för nedströms experiment eller senare tidpunkter för olika temperaturval. Detta kan göras genom att bedöva insekterna innan de placeras i akrylbron (med hjälp av is för Drosophila och CO 2 för myggor) och släppa ut CO2 i bron för att slå ner insekterna efter experimenten, före beräkningen. Användningen av CO2 är idealisk för myggor eftersom det inte påverkar beteenderesultaten21. Hos flugor kan exponering för CO2 förändra deras flygbeteende23, därför rekommenderas att använda is22.
Att räkna insekter är också ett kritiskt steg för att säkerställa att antalet insekter är lika före och efter experimentet för exakta resultat. För att göra detta rekommenderar vi att du använder en CO2-penna när experimentet är klart för att slå ner insekterna som finns i bron. Detta kommer att hjälpa till att flytta insekterna till vardera sidan av kammaren, vilket minskar antalet flyktingar. Vi lyfter också fram i protokollet att insekter kan fångas i burarnas ärmar under burseparation; Se därför till att dessa kontrolleras noggrant under räkningen.
Potentiella modifieringar och felsökning av tekniken Den största svårigheten med denna teknik är det flexibla nätet i burhylsorna som resulterar i luckor eller gömställen och därmed insektsflykt eller fångst. Det finns några potentiella modifieringar, om det behövs, för att förbättra tekniken. Vi föreslår att du använder två eller flera gummiband för att säkerställa att bron är ordentligt säkrad mellan kamrarna utan att lämna något potentiellt utrymme för insekterna (löst nät skapar ett gömställe för insekter). Vi rekommenderar också särskild försiktighet att dra näthylsan spänd, som beskrivs i steg 2.6, vid montering av apparaten.
Små formfaktorinkubatorer upphettas vanligtvis endast (dvs har ingen aktiv kylning), vilket var fallet för de inkubatorer som används här. Följaktligen kommer användning av temperaturer runt eller under den omgivande rumstemperaturen att kräva att experimentet utförs i ett kylrum för att säkerställa att de temperaturer som ställs in för inkubatorerna kommer att gå så lågt som önskat.
Dessutom kan denna inställning också användas för BSL 3, där ett klass tre biosäkerhetsskåp (handskfack) behövs. I detta fall måste handskfacket vara tillräckligt stort för att passa hela apparaten. Experimentet som beskrivs i detta protokoll är idealiskt för experiment i en handskfack eftersom allt som krävs kommer att finnas i handskfacket och, viktigare, möjligheten att insekter flyr är minimal.
Slutligen finns det tillräckligt med utrymme i inkubatorerna för att lägga till externt ljus eller en fuktighetskälla utan att påverka insekterna i burarna. Beroende på insektsart eller experimentell design kan en LED-lampa med 1 cm tjocklek enkelt placeras ovanpå buret inuti en eller båda inkubatorerna. Att ge ljus till båda och erbjuda ett temperaturval kan vara ett mer realistiskt protokoll för vissa ljuskänsliga experimentella mönster, eller att bara ge ljus (eller fuktighet) till en kammare är en möjlig modifiering av protokollet för att bedöma val av ljus / fuktighet.
Fördelar med denna teknik i samband med temperaturpreferensanalyser med dubbla val Metoden som beskrivs här presenterar ett alternativ till den traditionella temperaturgradientmetoden som beskrivits i tidigare studier10,13,14,16. I de flesta av dessa studier används ett stort horisontellt aluminiumblock med termisk gradient, medan mekanismen för att generera denna gradient varierar, inklusive värme- / kylblock, vattenbad etc. I dessa fall produceras temperaturgradienten på aluminiumblockets yta (snarare än lufttemperaturen i en bur). Följaktligen begränsar de flesta (men inte alla) alternativa tekniker insekternas flygförmåga mer än detta protokoll. Här kan insekter flyga relativt fritt mellan burar, vilket möjliggör ett mer realistiskt uttryck för naturliga beteenden i valet. Det skulle till och med vara möjligt att skala upp denna experimentapparat med hjälp av större burar och kuvöser, till exempel för större insekter.
Förutom den naturliga beteendefördelen visar vi också mycket hög temperaturjämnhet inom de två kamrarna, vilket möjliggör enkel poängsättning och ett tydligt urval av två stora entemperaturkammare. Användningen av en binär storkammarkonstruktion som denna kan minska bruset i data, där, till exempel på en gradientapparat, varje tillfällig rörelse av insekterna kommer att ändra positionen på gradienten och därmed deras upplevda temperaturpreferens.
Tekniken som beskrivs här är också mycket enkel och låg kostnad. Denna teknik behöver inte extra apparater för att ställa in temperaturerna (dvs. ett vattenbad10 och / eller en kokplatta 11,12,13,14,15), ingen specialutrustning förutom ett skuret akrylrör och borrade hål, och ingen kamera 18,19 eller sofistikerad programvara 19 för analys. Sådana komponenter som används i andra tekniker kan vara dyra och/eller kräva betydande expertis och testning för att påbörja experiment.
Denna teknik kan också replikeras med olika enheter som använder batterier om det inte finns någon extern strömförsörjning, vilket gör systemet idealiskt för att utföra experiment i fältet. Dessutom kan samma apparat modifieras något för att studera andra binära valpreferenser, såsom ljus kontra mörker, hög / låg luftfuktighet, etc., antingen i laboratoriet eller fältet.
Den fullstora apparaten i protokollet är betydligt mindre än temperaturgradientinställningarna, vilket möjliggör en enklare passform inuti en BSL 3-handskfack enligt beskrivningen ovan. Vidare är insekterna lättare att innehålla, eftersom de kan slås ner med CO2 i slutet av experimentet, och burarna kan snabbt återförslutas efter separation från bron. Dessa inneslutningsfördelar är idealiska för BSL 3-arbete.
Vi erkänner dock att vår apparat endast tillåter ett binärt beslut snarare än ett fritt val längs en lutning, vilket, beroende på applikation, kan kräva ytterligare körningar för att identifiera optimala temperaturer.

Organismer kan leva och reproducera endast inom sitt termiska toleransområde. Eftersom omgivningstemperaturen varierar på grund av årstider som förändras och global uppvärmning, måste arter anpassa sig och reagera därefter för att säkerställa deras överlevnad. Detta inkluderar ektotermer, där kroppstemperaturen är i jämvikt med miljön1. Därför har varje insekt sitt eget optimala miljötemperaturområde som de försöker hålla sig inom2.
Temperatur är en av de viktiga faktorer som används för att förutsäga fördelningen och intervallet av insekter 3,4,5, observera patogen-insektsrelationer6,7 och effekten av yttre faktorer på ektotermernas kondition, såsom deras vuxna livslängd, fecundity och matningshastighet 8,9.
Tidigare studier har undersökt den föredragna temperaturen hos ektotermer med olika inställningar. Det vanligaste är att använda ett stort aluminiumblock antingen med ett kylt eller uppvärmt vattenbad10, ett isbad och programmerbart värmeelement11, kall- och kokplattor12,13, termiska regulatorplattor 14,15 eller ett värmepaket och ispaket 16 i vardera änden för att skapa en temperaturgradient. Dessutom har andra studier också använt en temperaturgradientinkubator för att studera tillväxten av utvalda bakterier17 och monterat en aluminiumstav på en termoelektrisk anordning (uppvärmd och kyld i ändarna) för att observera den termiska preferensen för Drosophila melanogaster18,19.
Den alternativa metod som föreslås här har dock betydande fördelar för vissa insektstillämpningar. För det första kräver andra lösningar komplett konstruktion från grunden med grundläggande material, inklusive aluminiumplåtar, konstruktion av akrylkammare för insekterna, och ofta en kamerainställning och specialprogramvara; Detta kan vara dyrt och tidskrävande att installera. För det andra är många alternativa apparater beroende av en temperaturgradient på en yta (i motsats till lufttemperatur). Följaktligen är kammaren där insekterna studeras ofta mycket smal (t.ex. 24 cm långa lutningar med endast 2 cm bredd och 1 cm djup16), vilket kan förhindra naturliga beteenden, såsom flygning, som är väsentliga för insekternas normala rörlighet och därför absolut nödvändiga för att välja en föredragen temperatur. Vissa studier mäter lufttemperaturen; den valda poängsättningen innebär dock fortfarande att räkna antalet myggor som landar på Peltier-elementen i motsats till insekter som flyger fritt i burarna20.
I den här studien beskriver vi en enklare installation, som använder minimalt modifierad standardutrustning och ger insekter tillräckligt med utrymme för att flyga och navigera relativt obehindrat i en standardstor koloniunderhållsbur. Vidare, snarare än att förlita sig på en gradient, använder protokollet två relativt stora sektioner av konsekvent inre temperatur, vilket möjliggör naturlig roaming av insekterna vid deras föredragna temperatur och en enkel binär poängsättning. Därför ger apparaten och protokollet som beskrivs här ett billigt och enkelt sätt att studera myggtemperaturpreferens i en mindre hindrande och mer realistisk miljö.
Protokollet innefattar förberedelse av insekterna före experimentet följt av tvåkammarapparatens inställning. Ytterligare steg inkluderar att placera insekter i apparaten för att möjliggöra val av temperatur och poängsättning av resultat. För en illustration av metoden här valde vi insekternas optimala (standarduppfödning) temperatur, 27 °C för Aedes aegypti, 25 °C för Drosophila melanogaster och en högre avvisande temperatur för båda insektsarterna, 30 °C respektive 28 °C. Insekter ges 30 min för att välja en föredragen kammare. Denna tid befanns vara tillräcklig, och en längre varaktighet förändrade inte resultaten; Detta kan dock förlängas beroende på art/temperatur/andra variabler efter behov.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic tube (Bridge)</td>
			<td>Perspex</td>
			<td>900 mm OD</td>
			<td>Size (Length x diameter): 8 cm x 9 cm; 1 cm bigger than the size of the hole in front of the incubator. Size of the hole on top: 1.6 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide (CO2) inflator</td>
			<td>Peaken</td>
			<td>B08HM2BDDB</td>
			<td>Any CO2 pen will work&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubator (&#215;2)</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>VWR INCU-Line 1L 10 (390-0384)</td>
			<td>Size of hole in front of incubator: 8 cm diameter. Holes need to be position in the center and have the same exact position on both incubators to allow alignment of bridge.This should be pre-drilled using a standard 8 cm &#8216;holesaw&#8217; drill bit. Incubator must be just large enough to contain one mosquito cage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical aspirator (for mosquitoes)&#160;</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E710</td>
			<td>Ideal barrel size 50 x 28 mm and tube diameter 9mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito cage (&#215;3; two for the experiments, one for storing insects)</td>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BD4S1515</td>
			<td>Size: 17.5 cm x 17.5 cm x 17.5 cm with 12 cm sleeve opening. Mesh material : Knitted nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diameter of opening = 5 cm 
			Length of funnel = 5 cm 
			Diameter of aperture = 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pocket Pooter (for Drosophila or small insects)</td>
			<td>Watkins and Doncaster</td>
			<td>E714</td>
			<td>Manual/mouth aspirated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band or Reusable cable tie</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Either, depending on preference.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td>Eidyer</td>
			<td>B07J4T1VQZ</td>
			<td>Any thermometer with at least 100 cm narrow wire probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining temperature preference of mosquitoes and other ectotherms

De flesta insekter och andra ektotermer har ett relativt smalt optimalt temperaturfönster, och avvikelse från deras optima kan ha betydande effekter på deras kondition, liksom andra egenskaper. Följaktligen söker många sådana ektotermer sitt optimala temperaturområde. Även om temperaturpreferenser hos myggor och andra insekter har studerats väl, utförs den traditionella experimentella installationen med hjälp av en temperaturgradient på en aluminiumyta i ett mycket slutet utrymme. I vissa fall begränsar denna utrustning många naturliga beteenden, såsom flygning, vilket kan vara viktigt vid preferensval.
Syftet med denna studie är att observera insektspreferens för lufttemperatur genom att använda en tvåkammarapparat med tillräckligt utrymme för flygning. De två kamrarna består av oberoende temperaturstyrda inkubatorer, var och en med stor bländare. Inkubatorerna är förbundna med dessa öppningar med hjälp av en kort akrylbro. Inuti kuvöserna finns två nätburar, sammanlänkade via öppningarna och bron, så att insekterna fritt kan flyga mellan de olika förhållandena. Akrylbryggan fungerar också som en temperaturgradient mellan de två inkubatorerna.
På grund av det rymliga området i buren och enkel konstruktion kan denna metod användas för att studera alla små ektotermer och / eller manipulation som kan ändra temperaturpreferensen inklusive sensorisk organmanipulation, kost, tarmflora och endosymbiontnärvaro vid biosäkerhetsnivå 1 eller 2 (BSL 1 eller 2). Dessutom kan apparaten användas för studier av patogeninfektion med ytterligare inneslutning (t.ex. inuti ett biosäkerhetsskåp) vid BSL 3.

För att testa effekten och effektiviteten av denna experimentella installation testades 30 myggor med samma temperatur i båda inkubatorerna i fyra replikat (figur 3). När båda kamrarna var inställda på myggans optimala temperatur på 27 °C fanns det ingen signifikant skillnad mellan kammarens preferenser (P = 0,342; Wilcoxon signerat rankningstest). Men när en kammare ställdes in på den attraktiva optimala temperaturen på 27 °C och den andra kammaren till en suboptimal temperatur på 30 °C, visade myggor konsekvent aktiv preferens mot sin optima (P = 0,029; Wilcoxon signerat rankningstest; medelvärde på 78,2 % och 21,8 % för 27 °C respektive 30 °C). Vi testade också med Drosophila för att bestämma tillämpligheten med en annan ektotermmodell och liknande resultat observerades.
Temperaturjämnhet i burar Figur 4 visar temperaturjämnheten hos tvåkammarapparaten. När de väl var monterade sattes de två sidorna till 27 °C och 30 °C och fick balansera enligt instruktionerna här. Alla delar av inkubatorn och bron ligger inom 0,4 °C från den centrala temperaturen, utom (konsekvent) för ett hörn. Observera att det främre nedre vänstra hörnet (sett framifrån) är en konsekvent hot spot vid både 27 °C och 30 °C. Detta beror sannolikt på att elektroniken i inkubatorkontrollerna ligger precis under den delen av inkubatorn, snarare än de manipuleringar som utförts; därför är det sannolikt inkubatormodellspecifikt. Detta visar att manipuleringen och tillsatsen till inkubatorn har minimal effekt på temperaturjämnheten. Dessutom var brotemperaturen mellanliggande mellan de två kamrarna, vilket säkerställer att insekter inte konfronteras med ett temperaturtråg som de skulle behöva flyga genom.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig01.jpg"> Figur 1: Beskrivning av myggburet. Myggbur (17,5 cm x 17,5 cm x 17,5 cm) med 12 cm ärmöppningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig02.jpg"> Figur 2: Bilder och diagram över apparaten under installationen . (A) Tom insektsbur placerad i inkubatorn. (B) Akrylrör med öppningsbart lock (klaff) tillverkat av silvertejp. (C) Sidovy av installationen med ett schematiskt diagram. Hylsans nät spändes runt akrylröret med ett gummiband. För dessa experiment användes 3-5 dagar gamla, parade, kvinnliga Ae. aegypti-myggor . (D) Fullständig installation. Två inkubatorer som vetter mot varandra är förbundna med ett akrylrör. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig03.jpg"> Figur 3: Temperaturpreferens hos insekter. Tvåkammarapparaten monterades enligt instruktionerna. Insekter sattes in enligt protokollet och lämnades i 30 minuter för att välja önskad kammare (temperatur) och räknades sedan. Svarta punkter representerar enskilda replikat och blått representerar medelvärdet. (A) Båda inkubatorerna ställdes in på samma temperatur (27 °C) och temperaturpreferensen för Ae. aegypti observerades. (B) Inkubatorerna ställdes in på olika temperaturer (27 °C jämfört med 30 °C) och temperaturpreferensen för Ae. Aegypti observerades. (C) Inkubatorerna ställdes in på olika temperaturer (25 °C jämfört med 28 °C) och temperaturpreferensen för D. melanogaster observerades. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64356/64356fig04v2.jpg"> Figur 4: Temperaturjämnhet i kamrarna och bryggan. Som beskrivits monterades två inkubatorer, två burar och bron enligt instruktionerna. Temperaturen justerades till 27 °C på båda inkubatorerna och 30 °C i mitten. En temperatursond användes för att mäta temperaturen i mitten av buret, alla åtta hörnen av inkubatorn och inuti bron. De uppmätta temperaturerna visas här. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64356/64356fig04largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms at JoVE.com

Determining Temperature Preference of Mosquitoes and Other Ectotherms

Insekter har ett optimalt miljötemperaturområde som de försöker hålla sig inom, och många externa och interna faktorer kan ändra denna preferens. Här beskriver vi en kostnadseffektiv och enkel metod för att studera temperaturval, som gör att insekter fritt kan uppvisa sina naturliga beteenden.

Bestämning av temperaturpreferens för myggor och andra ektotermer

Most insects and other ectotherms have a relatively narrow optimal temperature window, and deviation from their optima can have significant effects on ...

Denna apparatuppsättning med två kammare används för att studera insekternas temperaturpreferenser och kan modifieras för att studera andra binära valpreferenser som ljus kontra mörk eller hög kontra låg luftfuktighet. De främsta fördelarna med denna teknik är den enkla installationen, det rymliga området som gör att insekterna kan uppvisa sin flygande natur när de väljer önskad temperatur och enkel poäng utan extern utrustning. Den svåraste delen av protokollet är att ta bort akrylbrottet efter experimentet.Detta beror på att det finns en stor chans att insekterna flyr. Därför är det avgörande för oss att använda koldioxiden för att bedöva insekterna. Demonstrerar proceduren kommer att vara Kinga Stobierska och Lorna Glenn, båda masterstudenter från mitt laboratorium.Börja med att förbereda 2 tomma myggburar med 12 centimeter ärmöppningar och se till att det inte finns några hål eller andra skador. Använd sedan en mekanisk aspirator och överför 30 insekter till en separat bur för enklare hantering och bortskaffande efter experimentet. Ställ inkubatorerna till önskade temperaturer och låt dem värmas upp och stabiliseras.Det tar cirka 30 minuter att uppnå en temperatur i intervallet 25 till 30 grader Celsius. Placera sedan en tom myggbur i en inkubator och mata burets ärmar genom inkubatorns främre hål. Bekräfta inkubatorns inre lufttemperatur med en temperatursond.Placera sedan en öppningsbar flik förberedd med silvertejp över hålet i akrylröret. Rulla upp hylsan som sticker ut genom hålet framför den första inkubatorn och säkra den över ena änden av akrylröret med ett elastiskt band. Placera sedan inkubatorerna mot varandra och sätt in ena änden av akrylröret i hylsan på det andra inkubatorhålet.Se till att akrylrörets diameter är större än hålet på inkubatorernas framsida så att det helt täcker hålet. Se till att akrylröret inte är löst och dinglar mellan inkubatorerna. Om så är fallet, dra i burhylsorna för att ta bort överflödigt material mellan buret och gummibandet.För att sätta myggorna inuti, öppna silvertejpfliken. Placera en tratt i akrylrörets hål och töm sedan insekterna i röret genom tratten. Efter tömning av insekterna, ta bort tratten och täck rörhålet med en kanalbandsflik.Låt stå i 30 minuter för insekterna att välja önskad kammare. I slutet av sedimenteringstiden, observera visuellt och skriv ner antalet insekter som ses i akrylrörsbron. Knacka sedan på eller blås alla insekter i bron till vardera sidan av inkubatorn eller genom att släppa ut koldioxid i bron.Nyp sedan och stäng ärmarna från akrylröret på båda sidor genom att snabbt fästa dem med en tät knut. Ta sedan bort burarna från båda inkubatorerna och räkna visuellt insekterna i varje bur. Se till att siffrorna från både inkubatorer och bron lägger till upp till 30.I den aktuella studien bestämdes myggornas och bananflugornas temperaturpreferens med hjälp av tvåkammarmodellen. Resultaten visade ingen signifikant skillnad när båda burarna hölls vid 27 grader Celsius, vilket indikerar myggornas förmåga att fritt välja mellan burar som uppvisar sitt naturliga beteende. Omvänt, när de två kamrarna ställdes in vid olika temperaturer valde myggorna konsekvent den optimala temperaturen på 27 grader Celsius över 30 grader Celsius.På samma sätt, när installationen testades med Drosophila Melanogaster, en annan ectoderm-modell undvek bananflugorna den varmare kammaren och föredrog deras optimala temperatur på 25 grader Celsius. Se till att installationen är helt förseglad utan gömställen och inget nät som stör flygområdet så att insekterna fritt kan välja mellan de 2 kamrarna.

Research

JoVE Journal

Biology

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Injektion av ett. stephensi embryon till Generera malaria resistenta myggor

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

Mikroinjektion av A. aegypti Embryon Skaffa Transgena myggor

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissekering av midgut och spottkörtlar från AE. aegypti Myggor

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

Förhindra spridning av malaria och denguefeber att använda genetiskt modifierade myggor

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Räkning och Avgöra genomförbarhet för odlade celler

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Skörd och förbereda Drosophila Embryon för Elektrofysiologiska inspelning och andra förfaranden

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Design och analys av temperaturpreferensbeteende och dess dygnsrytm i Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

En Multi-detektion analys för Malaria Överföring Myggor

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Laboratory Rearing of Stable Flies and Other Muscoid Diptera

Laboratoriet uppfödning av stabil flugor och andra Muscoid Diptera

Stable flies, Stomoxys calcitrans, are serious pests of livestock, humans, companion animals and wildlife worldwide. During the last 20+ years, changes in ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protokoll för testning av romanen insektsbekämpning kemier mygg toxicitet

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...