Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق البحث العلمي بجامعة تشجيانغ للطب الصيني (2020ZG29) ، ومشروع أبحاث الرفاهية العامة الأساسية لمقاطعة تشجيانغ (LGF19H150006 ، LTGY23B070001) ، ومشروع وزارة التعليم بمقاطعة تشجيانغ (Y202147028) ومشروع التكنولوجيا التجريبية لقسم مختبر جامعة تشجيانغ (SJS201712 ، SYB202130).

1. ثقافة الخلية
<ol><li>قم بإعداد وسط استزراع من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). استزرع خلية سرطان البنكرياس البشرية ، PANC-1 ، في قارورة مزرعة 75 سم2 بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. احتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.</li>
	<li>الاستزراع الفرعي لل...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content.">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).</li><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

يحدد هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل وتنقية sEV بحجم الجسيمات المحدد من 50-200 نانومتر باستخدام فارز خلايا التدفق ، والذي تم التحقق من صحته بواسطة NTA. حلت الطريقة مشكلة عنق الزجاجة المتمثلة في الحصول على sEV بحجم جسيم موحد ونقاء عالي ، وتجنب التداخل من الجزيئات البيولوجية غير ذات الصلة الملفوفة...

تطلق الخلية حويصلات خارج الخلية (EVs) بأحجام مختلفة تؤدي إلى جزيئات إشارات وشوائب غشائية ، وهي مهمة للتواصل بين الخلايا1. تلعب المركبات الكهربائية ذات الأحجام المختلفة أيضا أدوارا بيولوجية مختلفة ، حيث يمكن ل 50-200 نانومتر sEV توزيع الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات بدقة على الموقع الصحيح خارج الخلية. يساعد sEV أيضا في تحديد آليات إفرازها ، والتي لا تتضمن فقط تنظيم العمليات الفسيولوجية الطبيعية مثل المراقبة المناعية ، وصيانة الخلايا الجذعية ، وتخثر الدم ، وإصلاح الأنسجة ولكن أيضا علم الأمراض الكامن وراء العديد من الأمراض مثل تطور الورم وورم خبيث 2,3. يعد العزل والتحليل الفعالان للمركبات الكهربائية أمرا بالغ الأهمية لتحديد المؤشرات الحيوية وتصميم التدخلات الدوائية المستقبلية.
مع البحث المستمر حول التطبيق السريري ل sEV ، طرحت طرق عزل sEV متطلبات أعلى. نظرا لعدم تجانس sEV في الحجم والمصدر والمحتويات ، فضلا عن تشابهها مع المركبات الكهربائية الأخرى في الخواص الفيزيائية والكيميائية الحيوية ، لا توجد طريقة قياسية لعزل sEV 4,5. حاليا ، يعد الطرد المركزي الفائق ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، وترسيب البوليمر ، والتقاط التقارب المناعي أكثر طرق عزل sEV شيوعا6. لا يزال الطرد المركزي الفائق هو المعيار الذهبي لعزل sEV في البحث ، على الرغم من كونه يستغرق وقتا طويلا ، مما يؤدي إلى نقاء منخفض مع توزيع واسع الحجم من 40-500 نانومتر وأضرار ميكانيكية كبيرة لل sEV بعد الطرد المركزي طويل المدى7،8،9. يعاني ترسيب البوليمر ، الذي يستخدم عادة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، من نقاء غير مقبول للتحليل الوظيفي اللاحق مع الترسيب المصاحب لمجاميع البروتين خارج الخلية وتلوث البوليمر10,11. تتطلب الطرق القائمة على التقاط التقارب المناعي أجساما مضادة عالية التكلفة ذات خصوصية متفاوتة ، بالإضافة إلى وجود مشاكل في انخفاض حجم المعالجة وإنتاجية12،13،14. حجم الجسيمات هو أحد المؤشرات الرئيسية لتقييم نقاء sEV المعزول. على الرغم من أن نقاء sEV لا يزال هدفا بعيد المنال ، إلا أن SEC يزيل كمية كبيرة من المكونات المتوسطة ، وجزيئات sEV المستخرجة بواسطة طريقة SEC هي أساسا في حدود 50-200 نانومتر15. التقنيات الحالية لها بعض العيوب ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر كونها تستغرق وقتا طويلا ، ونقاء منخفض ، وعائد منخفض ، وضعف قابلية التكاثر ، وانخفاض إنتاجية العينات ، والضرر المحتمل ل sEV ، مما يجعلها غير متوافقة مع الاستخدام السريري16. وبالتالي ، فإن طريقة عزل sEV السريعة وغير المكلفة والمحددة الحجم المطبقة على السوائل الحيوية المتنوعة هي حاجة أساسية في العديد من الحالات البحثية والسريرية.
في قياس التدفق الخلوي ، يتم تحليل الجسيمات المفردة بطريقة عالية الإنتاجية ومتعددة المعلمات ، ويتم فرز المجموعات الفرعية17. نظرا لعدم تجانس المركبات الكهربائية ، سيكون القياس الخلوي لتدفق الجسيمات الواحدة مثاليا ، والذي تم استخدامه للتحقيق في المركبات الكهربائية باتباع نماذج تحليل الخلية ، مع استخدام ملصقات تشتت الضوء والتألق لتحديد الميزات المتعلقة بعلم وظائف الأعضاء ومكونات البروتين18،19،20. ومع ذلك ، فإن قياس التدفق الخلوي التقليدي يواجه تحديا بسبب صغر حجم sEV وانخفاض وفرة المؤشرات الحيوية السطحية. يمكن تحسين حساسية قياس التدفق الخلوي من خلال تحسين معلمات الكشف لتمييز ضوضاء الخلفية و sEV بغض النظر عن استخدام التشتت الأمامي (FSC) أو التشتت الجانبي (SSC) أو عتبة التألقالتي تؤدي إلى تشغيل المعلمة 19.
مع البروتوكول الحالي ، تم تحسين إعدادات الفرز الخلوي عالية التدفق باستخدام حبات الفلورسنت كمعيار. من خلال اختيار حجم الفوهة المناسب ، وضغط سائل الغمد ، ومعلمة تشغيل العتبة ، والفولتية التي تتحكم في شدة الضوء المتناثرة ، تمكنا من عزل مجموعة فرعية محددة من sEV من خليط معقد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

يمكن إطلاق الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEV) من جميع أنواع الخلايا وتحمل البروتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي. تعمل جزيئات الإشارة كمؤشرات للحالة الفسيولوجية والمرضية للخلية. ومع ذلك ، لا توجد طريقة قياسية لعزل sEV ، مما يمنع تحديد العلامات الحيوية النهائية ودراسات التدخل الدوائي. في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتنقية 50-200 نانومتر sEV بواسطة فارز خلايا التدفق. لهذا الغرض ، تم اختيار فوهة 50 ميكرومتر وضغط سائل غمد 80 رطل لكل بوصة مربعة للحصول على معدل فرز جيد وتيار جانبي مستقر. تم استخدام الكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي لتحديد مجموعات من الجسيمات 100 و 200 و 300 نانومتر. مع التحسين الإضافي لعتبة تشغيل الجهد والكسب والتشتت الأمامي (FSC) ، يمكن فصل إشارة sEV عن ضوضاء الخلفية. توفر هذه التحسينات لوحة من إعدادات الفرز الحرجة التي تمكن المرء من الحصول على مجموعة تمثيلية من sEV باستخدام FSC مقابل التشتت الجانبي (SSC) فقط. لا تسمح طريقة العزل القائمة على قياس التدفق الخلوي بتحليل الإنتاجية العالية فحسب ، بل تسمح أيضا بالتصنيف المتزامن أو تحليل البروتين ل sEV بناء على تعبير العلامات الحيوية ، مما يفتح العديد من تطبيقات البحث النهائية.

يوضح الشكل 1 مخطط مخطط التدفق للبروتوكول التجريبي. في هذه الطريقة ، تم استخدام الكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي كمعايير مرجعية لتوزيع حجم الجسيمات. في ظل حالة المعلمة الآلية المحددة ، يمكن تمييز إشارة الجسيمات بوضوح عن ضوضاء الخلفية في مخطط FSC مقابل SSC باستخد...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

يوفر هذا البروتوكول طريقة عزل سريعة ومحددة الحجم للحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحسين حجم فوهة رش الهواء وضغط سائل الغمد وضغط تدفق العينة والجهد والكسب ومعلمات عتبة التشغيل.

تحسين معلمات الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة حل سريعة ومحددة الحجم للحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحسين معلمات فرز قياس التدفق الخلوي. توفر هذه التحسينات لوحة من إعدادات الفرز الحرجة التي تمكن المرء من الحصول على مجموعات تمثيلية من الحويصلات الصغيرة خارج الخلية باستخدام التشتت الأمامي مقابل حجم التشتت فقط. ابدأ بتنفيذ إجراء بدء التشغيل القياسي لفارز خلايا التدفق.قم بتشغيل الجهاز بالضغط على زر بدء التشغيل ، ثم انقر فوق زر طاقة الليزر في لوحة تحكم الليزر. اضغط على زر خزانات التغيير في القائمة الفرعية Smart Sampler للضغط على السوائل. استخدم طائرة نفاثة وفوهة هواء 50 ميكرومتر يتم تنظيفها بالموجات فوق الصوتية وقم بتثبيتها على مجموعة الفوهة.اضبط الضغط على 80 SI لسائل الغلاف و 80.3 SI لتدفق العينة على وحدة الضغط. اضغط على زر بدء تدفق الغمد لبدء تدفق الغمد. انقر زر الفقاعة في القائمة الفرعية Smart Sampler لفك الفقاعات تلقائيا لمدة 10 دقائق ثم قم بإيقاف تشغيلها.لمحاذاة الدفق وتحديد بقعة الليزر ، قم بتشغيل ضوء غرفة الإضاءة لعرض الدفق فوق الثقوب. اضبط الميكرومتر لأعلى ولأسفل ولليسار واليمين والأمام والخلف لتوسيط الدفق على الثقب وتركيز الدفق. افتح جميع مصاريع الليزر ، وحدد علامة تبويب اعتراض الليزر والتيار ، ثم اضغط على زر السهم الأخضر باستمرار كما يطلب منك إكمال عملية معايرة اعتراض الليزر ومحاذاة الفوهة.قم بالوصول إلى شاشة محاذاة الليزر الدقيقة. حدد قناة تمرير النطاق الترددي 640 نانومتر و 772 بار 44 كمعلمة المحور السيني وقناة الليزر 405 نانومتر وقناة تمرير النطاق 448 بار 59 كمعلمة المحور ص. اضغط على محدد معلمة الزناد واختر معلمة التشتت الأمامي لليزر 488 نانومتر.بعد ذلك ، قم بتخفيف جزيئات الفلورسنت قوس قزح عن طريق إضافة قطرة واحدة إلى ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج إلى تركيز نهائي قدره واحد في 10 أس حبات سادسة لكل ملليلتر. افتح باب غرفة العينة وقم بتحميل أنبوب من جزيئات الفلورسنت قوس قزح المحضرة. اضغط على زر بدء العينة واضبط الميكرومتر لأعلى ولأسفل لتحسين شدة التألق ، مما يجعل كل إشارة مكثفة قدر الإمكان.اضغط على زر بدء مراقبة الجودة أو مراقبة الجودة على لوحة التحكم التي تعمل باللمس لأداء مراقبة الجودة تلقائيا. ثم اضغط على زر تهيئة IntelliSort. يقوم الجهاز تلقائيا بضبط تردد وسعة تذبذب القطرة للحصول على تأخير السقوط البالغ 25 تقريبا ويكون قادرا على تصور نقطة انقطاع السقوط بوضوح.بعد ذلك ، اضغط على زر تأخير الإسقاط وزر الصيانة. حدد الأنبوب كنوع إخراج الفرز. ضع حامل أنبوب سعة 15 ملليلتر في حجرة الفرز.قم بتشغيل جهد اللوحة واضبط جهد اللوحة على حوالي 4،000 فولت. بعد ذلك ، قم بتشغيل نمط الاختبار عن طريق تحديد زر إعداد البث. اضبط شريط تمرير مرحلة الشحن ومنزلق الانحراف للتأكد من أن صورة الدفق تتماشى مع أنبوب التجميع.ثم حدد زر علامة الاختيار. قم بتسجيل الدخول إلى محطة عمل Summit على الكمبيوتر. قم بإنشاء بروتوكول جديد من القائمة الرئيسية للملف.ثم قم بإنشاء مخطط نقطي عن طريق تحديد علامة تبويب الرسم البياني في لوحة تحكم برنامج القمة. اختر التشتت الأمامي كمعلمة المحور السيني والتشتت الجانبي كمعلمة المحور ص. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على محور مخطط النقاط الجديد في مساحة العمل وقدم المبعثر الأمامي والتشتت الجانبي في الشكل اللوغاريتمي.حدد علامة تبويب الاكتساب وحدد موقع لوحة معلمات الاستحواذ. قم بتمكين جميع الإشارات في القائمة الفرعية لتمكين المعلمات. اختر التشتت الأمامي كمعلمة تشغيل وقم بتعيين عتبة 0.01.اضبط الجهد والكسب للتشتت الأمامي والتشتت الجانبي عند 250 و 0.6 لضمان فصل الأحداث داخل مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط التشتت الجانبي والسكان. قم بتخفيف الكريات المجهرية الفلورية من البوليسترين إلى معلقات 100 و 200 و 300 نانومتر عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من الكريات المجهرية إلى ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج. ثم قم بتحميل تعليق المجهرية على التوالي.حدد ابدأ ضمن قائمة الاستحواذ الخاصة ب Summit Software لتسجيل أحداث 20،000 ثم انقر فوق إيقاف بعد تسجيل الأحداث. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مخطط نقطة التشتت الأمامي مقابل نقطة التشتت الجانبية لإنشاء مستطيلات واسحب لتغيير الحجم. قم بتغيير موضع مناطق الضوضاء الإلكترونية وعدد الميكروسفير 100 نانومتر عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على المناطق لإعادة تسميتها باسم R7 و R4 على التوالي.كرر الخطوات لتأطير الكرات المجهرية 200 و 300 نانومتر مع المستطيلات على التوالي ، وإعادة تسميتها ك R5 و R6 على التوالي. أخيرا ، حدد منطقة الفرز من 50 إلى 200 نانومتر بناء على الضوضاء الإلكترونية وموضع جسيمات 200 نانومتر لتعريفها على أنها R8. قم بتحرير قرارات الفرز في لوحة منطق الفرز والإحصائيات بالنقر المزدوج فوق الحقل الفارغ للحقل الأيسر أو دفق L1 وتحديد المنطقة المسماة R8 لإنشاء منطق الفرز. اختر وضع إجهاض النقاء وحدد مغلف قطرة فوق قطرة واحدة لتيار L1.قم بتحميل عينة 500 ميكرولتر من الحويصلات خارج الخلية المعدة مسبقا أو خليط EVs. اضغط على زر البدء أسفل قائمة الاستحواذ في Summit للحصول على البيانات ثم انقر فوق إيقاف. بعد ذلك ، اضغط على ابدأ في قائمة الفرز لجمع 50 إلى 200 نانومتر من الحويصلات الصغيرة خارج الخلية أو sEV في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.كشف تحليل قياس التدفق الخلوي للكرات المجهرية المصنوعة من البوليسترين ذات الحجم القياسي لتحديد نطاق الحجم من 50 إلى 200 نانومتر في مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط التشتت الجانبي عن إشارات جسيمات مميزة. تشير R4 و R5 و R6 إلى مواضع جسيمات 100 و 200 و 300 نانومتر على التوالي. R7 هو الضوضاء الإلكترونية كحد الكشف عن جسيمات 50 نانومتر و R8 يمثل نطاق الموضع من 50 إلى 200 نانومتر من الجسيمات.كان توزيع حجم الجسيمات لخليط EVs المشتق من خلايا البنكرياس عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو NTA ، في نطاق واسع من 40 إلى 400 نانومتر بعد الطرد المركزي الفائق. تم إجراء الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية 50 إلى 200 نانومتر sEV داخل منطقة R8. تم التحقق من جودة العزل بواسطة NTA ووجد أن نطاق حجم الجسيمات من sEV بعد الفرز كان بين 50 إلى 200 نانومتر.تمت ملاحظة وجود sEV بواسطة TEM وتم تأكيد احتواء sEVs المعزولة على علامات CD6 و CD63 و CD81 بواسطة Western Blot Analysis. تسمح هذه الطريقة بفصل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية والتصنيف أو التحليل الاحترافي للحويصلات الصغيرة خارج الخلية التي تفتح العديد من التطبيقات البحثية النهائية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

نظام تنقية البروتين عالي الإنتاجية اقتصادي ومتعدد الاستخدامات باستخدام محول لوحة متعدد الأعمدة

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

تحديد الببتيدات للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الضامة المشتقة من نخاع العظام

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...