Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den videnskabelige forskningsfond ved Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), det grundlæggende offentlige velfærdsforskningsprojekt i Zhejiang-provinsen (LGF19H150006, LTGY23B070001), projektet fra Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) og projektet om eksperimentel teknologi fra Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).

1. Cellekultur
<ol><li>Forbered et dyrkningsmedium af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Dyrk den menneskelige kræftcelle i bugspytkirtlen, PANC-1, i en 75 cm2 kulturkolbe med en densitet på 1 x 106 celler / ml. Kulturen inkuberes ved 37 °C med 5% CO2.</li>
	<li>Subkultur cellerne, når celletætheden når 75% -80% under mikroskopisk observation. Fjern mediet, og skyl 2x med 3-5 ml fosfatbuffersaltvand (PBS; 0,01 M...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content.">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).</li><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

Denne protokol skitserer en optimeret metode til at isolere og rense sEV med den specificerede partikelstørrelse på 50-200 nm ved hjælp af en flowcellesorterer, som blev valideret af NTA. Metoden løste flaskehalsproblemet med at opnå sEV med ensartet partikelstørrelse og høj renhed og undgå interferens fra ikke-relaterede biologiske molekyler pakket ind i store elbiler22. Hurtige analyser med høj kapacitet er mulige med flowcytometri, som kan fange 100.000 partikler pr. sekund og træffe ...

En celle frigiver ekstracellulære vesikler (EV'er) af forskellig størrelse, der resulterer i signalmolekyler og membranindeslutninger, som er vigtige for intercellulær kommunikation1. EV'er i forskellige størrelser spiller også forskellige biologiske roller, hvor 50-200 nm sEV er i stand til præcist at distribuere RNA, DNA og proteiner til den korrekte ekstracellulære placering. SEV hjælper også med at bestemme deres sekretionsmekanismer, der ikke kun involverer regulering af normale fysiologiske processer såsom immunovervågning, stamcellevedligeholdelse, blodkoagulation og vævsreparation, men også patologien bag flere sygdomme såsom tumorprogression og metastase 2,3. Effektiv isolering og analyse af sEV er afgørende for at identificere biomarkører og designe fremtidige lægemiddelinterventioner.
Med kontinuerlig forskning i den kliniske anvendelse af sEV har isolationsmetoderne for sEV fremsat højere krav. På grund af heterogeniteten af sEV i størrelse, kilde og indhold samt deres lighed med andre EV'er i fysisk-kemiske og biokemiske egenskaber er der ingen standardmetode til sEV-isolering 4,5. I øjeblikket er ultracentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), polymerudfældning og immunoaffinitetsindfangning de mest almindelige sEV-isolationsmetoder6. Ultracentrifugering er stadig guldstandarden for sEV-isolering i forskning, på trods af at det er tidskrævende, hvilket resulterer i lav renhed med en bred størrelsesfordeling på 40-500 nm og betydelig mekanisk skade på sEV efter langvarig centrifugering 7,8,9. Polymerudfældning, som normalt bruger polyethylenglycol (PEG), lider af uacceptabel renhed til efterfølgende funktionel analyse med samtidig udfældning af ekstracellulære proteinaggregater og polymerforurening10,11. Immunoaffinitetsfangstbaserede metoder kræver dyre antistoffer med varierende specificitet samt har problemer med lavt behandlingsvolumen og giver12,13,14. Partikelstørrelse er en af hovedindikatorerne til evaluering af renheden af isoleret sEV. Selvom sEV-renhed forbliver et uopnåeligt mål, fjerner SEC en betydelig mængde mediumkomponenter, og sEV-partiklerne ekstraheret ved SEC-metoden ligger hovedsageligt i området 50-200 nm15. De eksisterende teknikker har nogle få ulemper, herunder, men ikke begrænset til, at være tidskrævende, lav renhed, lavt udbytte, dårlig reproducerbarhed, lav gennemstrømning af prøver og potentiel skade på sEV, hvilket gør det uforeneligt med klinisk udnyttelse16. Således er en hurtig, billig og størrelsesspecificeret sEV-isoleringsmetode, der gælder for forskellige biofluider, et væsentligt behov i flere forsknings- og kliniske situationer.
I flowcytometri analyseres enkeltpartikler på en multiparametrisk måde med høj kapacitet, og delmængder sorteres ud17. På grund af EV'ernes heterogenitet ville en cytometrisk måling af enkeltpartikelflow være ideel, som er blevet brugt til at undersøge EV'er efter paradigmerne for celleanalyse, hvor lyssprednings- og fluorescensetiketter bruges til at identificere fysiologirelaterede egenskaber og proteinkomponenter18,19,20. Ikke desto mindre udfordres konventionel flowcytometri af den lille størrelse af sEV og lav overflod af overfladebiomarkører. Følsomheden af flowcytometri kan forbedres ved at optimere detektionsparametre for at skelne baggrundsstøj og sEV uanset brug af fremadrettet spredning (FSC), sidespredning (SSC) eller fluorescenstærskeludløsende parameter19.
Med den nuværende protokol blev flowcytometriske sorteringsindstillinger med høj opløsning optimeret ved hjælp af fluorescerende perler som standard. Ved at vælge den korrekte dysestørrelse, kappevæsketryk, tærskeludløsningsparameter og spændinger, der styrer spredte lysintensiteter, var vi i stand til at isolere en specifik delmængde af sEV fra en kompleks blanding.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

Små ekstracellulære vesikler (sEV) kan frigives fra alle celletyper og bære protein, DNA og RNA. Signalmolekyler tjener som indikatorer for en celles fysiologiske og patologiske tilstand. Der findes imidlertid ingen standardmetode til sEV-isolering, som forhindrer downstream-biomarkøridentifikation og lægemiddelinterventionsundersøgelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til isolering og oprensning af 50-200 nm sEV ved hjælp af en flowcellesorterer. Til dette blev der valgt en 50 μm dyse og 80 psi kappevæsketryk for at opnå en god sorteringshastighed og stabil sidestrøm. Standardstørrelse polystyrenmikrosfærer blev brugt til at lokalisere populationer af 100, 200 og 300 nm partikler. Med yderligere optimering af udløsertærsklen for spænding, forstærkning og fremadspredning (FSC) kunne sEV-signalet adskilles fra baggrundsstøjen. Disse optimeringer giver et panel af kritiske sorteringsindstillinger, der gør det muligt at opnå en repræsentativ population af sEV udelukkende ved hjælp af FSC vs. side scatter (SSC). Den flowcytometribaserede isolationsmetode giver ikke kun mulighed for analyse med høj kapacitet, men giver også mulighed for synkron klassificering eller proteomanalyse af sEV baseret på biomarkørekspressionen, hvilket åbner adskillige downstream-forskningsapplikationer.

Rutediagrammet for forsøgsprotokollen er vist i figur 1. I denne metode blev polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse anvendt som referencestandarder for partikelstørrelsesfordeling. Under den specifikke instrumentparameterbetingelse kunne partikelsignalet tydeligt skelnes fra baggrundsstøjen i FSC vs. SSC-plottet ved hjælp af den logaritmiske form. Gating strategier er vist i figur 2. R4, R5 og R6 henviser til positionerne for henholdsvis 100 nm, 200 nm ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Denne protokol giver en hurtig og størrelsesspecifik isoleringsmetode til små ekstracellulære vesikler ved at optimere størrelsen på luftsprøjtedysen, kappevæsketrykket, prøveflowtrykket, spændingen, forstærkningen og udløsningstærskelparametrene.

Optimering af flowcytometriske sorteringsparametre til high-throughput isolering og oprensning af små ekstracellulære vesikler

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Denne protokol giver en hurtig og størrelsesspecifik løsningsmetode til små ekstracellulære vesikler ved at optimere flowcytometrisorteringsparametre. Disse optimeringer giver et panel af kritiske sorteringsindstillinger, der gør det muligt at opnå repræsentative populationer af små ekstracellulære vesikler kun ved hjælp af fremadrettet spredning versus størrelsesspredning. Begynd med at udføre standardstartproceduren for flowcellesortereren.Tænd maskinen ved at trykke på startknappen, og klik derefter på lasertænd/sluk-knappen på laserkontrolpanelet. Tryk på knappen Skift beholder i undermenuen Smart Sampler for at sætte fluidikken under tryk. Brug en ultralydrenset 50 mikrometer stråle og luftdyse og installer den ned til dyseenheden.Juster trykket til 80 SI for kappevæske og 80,3 SI for prøveflow på trykkonsollen. Tryk på startkappeflowknappen for at starte kappestrømmen. Klik på bobleknappen i undermenuen Smart Sampler for automatisk at deboble i 10 minutter og derefter slå den fra.For at justere strømmen og bestemme laserpunktet skal du tænde belysningskammerets lys for at se strømmen over pinholes. Juster op og ned, venstre og højre og for- og bagmikrometer for at centrere strømmen på pinhullet og fokusere strømmen. Åbn alle laserskodder, vælg fanen laser- og streamskæringspunkt, og tryk derefter kontinuerligt på den grønne pileknap, når du bliver bedt om det for at fuldføre kalibreringsprocessen for laserskæring og dysejustering.Få adgang til skærmen med finlaserjustering. Vælg 640 nanometer laser og 772 bar 44 båndpaskanal som x-akseparameter og 405 nanometer laser og 448 bar 59 båndpaskanal som y-akseparameter. Tryk på udløserparametervælgeren, og vælg fremadspredningsparameteren for 488 nanometerlaseren.Fortynd derefter regnbuefluorescerende partikler ved at tilsætte en dråbe i en milliliter dobbeltdestilleret vand til en endelig koncentration på en gange 10 til de sjette perler pr. Milliliter. Åbn prøvekammerdøren, og læg et rør med forberedte regnbuefluorescerende partikler i. Tryk på startprøveknappen, og juster op og ned mikrometer for at optimere fluorescensintensiteten, hvilket gør hvert signal så intenst som muligt.Tryk på startkvalitetskontrol eller QC-knappen på berøringsskærmens kontrolpanel for at udføre QC automatisk. Tryk derefter på initialiseringsknappen IntelliSort. Instrumentet justerer automatisk frekvensen og amplituden af dråbesvingning for at opnå faldforsinkelsen på ca. 25 og være i stand til at visualisere dråbens brudpunkt tydeligt.Tryk derefter på dropforsinkelsesknappen og vedligeholdelsesknappen. Vælg rør som sorteringsoutputtype. Anbring en 15 ml rørholder i sorteringskammeret.Tænd pladespændingen og indstil pladespændingen til ca. 4.000 volt. Tænd derefter testmønsteret ved at vælge knappen Streamopsætning. Juster skyderen for opladningsfasen og skyderen for afbøjning for at sikre, at billedet af strømmen er på linje med opsamlingsrøret.Vælg derefter fluebenet. Log ind på Summit-arbejdsstationen på computeren. Opret en ny protokol fra filens hovedmenu.Opret derefter et prikplot ved at vælge histogramfanen i Summit Software-kontrolpanelet. Vælg fremadrettet spredning som parameteren x-akse og sidespredning som parameteren y-akse. Højreklik derefter på aksen for det nye prikplot i arbejdsområdet og præsenter fremadspredningen og sidespredningen i logaritmisk form.Vælg fanen Anskaffelse, og find panelet med anskaffelsesparametre. Aktivér alle signaler i undermenuen for aktiveringsparametre. Vælg forward scatter som triggerparameter, og indstil tærsklen på 0,01.Juster spændingen og forstærkningen af fremadrettet spredning og sidespredning ved 250 og 0,6 for at sikre, at begivenheder inden for diagrammet fremadrettet spredning versus sidespredning og populationer adskilles. Fortynd de fluorescerende polystyrenmikrosfærer i 100, 200 og 300 nanometer suspensioner ved at tilsætte en mikroliter mikrosfærer til en milliliter dobbeltdestilleret vand. Indlæs derefter mikrosfæreophænget successivt.Vælg Start under anskaffelsesmenuen for Summit Software for at optage 20.000 begivenheder, og klik derefter på Stop efter optagelse af begivenhederne. Højreklik på det fremadrettede scatter versus side scatter dot plot for at oprette rektangler og træk for at ændre størrelsen. Flyt regionerne med elektronisk støj og 100 nanometer mikrosfærepopulation ved at højreklikke på regionerne for at omdøbe dem til henholdsvis R7 og R4.Gentag trinene for at indramme 200 og 300 nanometer mikrosfærerne med rektangler successivt, og omdøb dem til henholdsvis R5 og R6. Endelig bestemmes sorteringsområdet 50 til 200 nanometer baseret på den elektroniske støj og placeringen af 200 nanometer partikler for at definere det som R8. Rediger sorteringsbeslutninger i panelet Sorteringslogik og statistik ved at dobbeltklikke på det tomme felt i den venstre eller L1-strøm og vælge området med navnet R8 for at oprette sorteringslogikken. Vælg afbrydelsestilstanden for renhed, og vælg en dråbekuvert over en dråbe til L1-strømmen.Der fyldes 500 mikroliter prøve af tidligere fremstillede ekstracellulære vesikler eller EV-blanding. Tryk på Start-knappen under anskaffelsesmenuen i Summit for at hente dataene, og klik derefter på Stop. Tryk derefter på Start i sorteringsmenuen for at samle små ekstracellulære vesikler eller sEV i størrelse på 50 til 200 nanometer i et 15 ml centrifugerør.Flowcytometrianalyse af polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse for at lokalisere størrelsesområdet 50 til 200 nanometer i det fremadrettede scatter versus sidespredningsplot afslørede skelnelige partikelsignaler. R4, R5 og R6 henviser til positionerne for henholdsvis 100, 200 og 300 nanometer partikler. R7 er den elektroniske støj som detektionsgrænse for 50 nanometer partikler, og R8 repræsenterer positionsområdet for 50 til 200 nanometer partikler.Partikelstørrelsesfordelingen af EVs-blandingen afledt af pancreas one-celler ved nanopartikelsporingsanalyse eller NTA var i det brede område på 40 til 400 nanometer efter ultracentrifugering. Flowcytometrisk sortering blev udført for at isolere og rense 50 til 200 nanometer sEV inden for R8-regionen. Kvaliteten af isolation blev verificeret af NTA, og det blev konstateret, at partikelstørrelsesområdet for sEV efter sortering var mellem 50 og 200 nanometer.Tilstedeværelsen af sEV blev yderligere observeret af TEM, og de isolerede sEV'er blev bekræftet at indeholde markører for CD6, CD63 og CD81 ved Western Blot Analysis. Denne metode gør det muligt at adskille små ekstracellulære vesikler og klassificere eller pro temanalysere små ekstracellulære vesiklers genekspression, hvilket åbner op for talrige downstream-forskningsapplikationer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering af vævs Ekstrudulære vesikler fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Et økonomisk og alsidigt proteinrensningssystem med høj gennemløb ved hjælp af en pladeadapter med flere kolonner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening for at opnå krystal hits til proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identifikation af peptider af små ekstracellulære vesikler fra knoglemarvafledte makrofager

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...