Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Wissenschaftlichen Forschungsfonds der Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), das Basic Public Welfare Research Project der Provinz Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), das Projekt des Bildungsministeriums der Provinz Zhejiang (Y202147028) und das Projekt für experimentelle Technologie der Laborabteilung der Zhejiang University (SJS201712, SYB202130).

1. Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie ein Nährmedium aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) vor, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Die menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszelle PANC-1 wird in einem 75cm2 Kulturkolben mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml kultiviert. Inkubation der Kultur bei 37 °C mit 5% CO2.</li>
	<li>Subkultur der Zellen, wenn die Zelldichte unter mikroskopischer Beobachtung 75%-80% erreicht. Entfernen Sie das Medium und spül...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. 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D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Isolierung und Aufreinigung von sEV mit der spezifizierten Partikelgröße von 50-200 nm unter Verwendung eines Durchflusszellensortierers, der von NTA validiert wurde. Die Methode löste das Engpassproblem, sEV mit einheitlicher Partikelgröße und hoher Reinheit zu erhalten, und verhinderte Interferenzen durch nicht verwandte biologische Moleküle, die in großformatige EVseingewickelt sind 22. Schnelle Hochdurchsatzanalysen sind mit der Du...

Eine Zelle setzt extrazelluläre Vesikel (EVs) unterschiedlicher Größe frei, die zu Signalmolekülen und Membraneinschlüssen führen, die für die interzelluläre Kommunikation wichtig sind1. EVs unterschiedlicher Größe spielen auch unterschiedliche biologische Rollen, wobei 50-200 nm sEV in der Lage sind, RNA, DNA und Proteine präzise an die richtige extrazelluläre Stelle zu verteilen. Die sEV hilft auch bei der Bestimmung ihrer Sekretionsmechanismen, die nicht nur die Regulierung normaler physiologischer Prozesse wie Immunüberwachung, Stammzellerhaltung, Blutgerinnung und Gewebereparatur umfassen, sondern auch die Pathologie, die verschiedenen Krankheiten wie Tumorprogression und Metastasierung zugrunde liegt 2,3. Eine effektive Isolierung und Analyse von sEV ist entscheidend für die Identifizierung von Biomarkern und die Entwicklung zukünftiger medikamentöser Interventionen.
Mit kontinuierlicher Forschung zur klinischen Anwendung von sEV haben die Isolationsmethoden von sEV höhere Anforderungen gestellt. Aufgrund der Heterogenität von sEV in Größe, Quelle und Gehalt sowie ihrer Ähnlichkeit mit anderen EVs in Bezug auf physikalisch-chemische und biochemische Eigenschaften gibt es keine Standardmethode für die sEV-Isolierung 4,5. Derzeit sind Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie (SEC), Polymerfällung und Immunaffinitätserfassung die gebräuchlichsten sEV-Isolationsmethoden6. Die Ultrazentrifugation ist nach wie vor der Goldstandard für die sEV-Isolierung in der Forschung, obwohl sie zeitaufwändig ist, was zu einer geringen Reinheit mit einer breiten Größenverteilung von 40-500 nm und einer signifikanten mechanischen Schädigung des sEV nach Langzeitzentrifugation führt 7,8,9. Die Polymerfällung, bei der üblicherweise Polyethylenglykol (PEG) verwendet wird, weist eine inakzeptable Reinheit für die anschließende Funktionsanalyse mit gleichzeitiger Ausfällung extrazellulärer Proteinaggregate und Polymerkontaminationauf 10,11. Immunaffinitäts-Capture-basierte Methoden erfordern teure Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität sowie Probleme mit geringem Verarbeitungsvolumen und Ausbeuten12,13,14. Die Partikelgröße ist einer der Hauptindikatoren zur Bewertung der Reinheit von isoliertem sEV. Obwohl die Reinheit von sEV nach wie vor ein unerreichbares Ziel ist, entfernt SEC eine beträchtliche Menge an Medienkomponenten, und die mit der SEC-Methode extrahierten sEV-Partikel liegen hauptsächlich im Bereich von 50-200 nm15. Die bestehenden Techniken weisen einige Nachteile auf, darunter Zeitaufwand, geringe Reinheit, geringe Ausbeute, schlechte Reproduzierbarkeit, geringer Probendurchsatz und potenzielle Schädigung von sEV, was sie mit der klinischen Anwendung unvereinbar macht16. Daher ist eine schnelle, kostengünstige und größenspezifische sEV-Isolationsmethode, die auf verschiedene Biofluide anwendbar ist, ein wesentlicher Bedarf in verschiedenen Forschungs- und klinischen Situationen.
In der Durchflusszytometrie werden einzelne Partikel multiparametrisch mit hohem Durchsatz analysiert und Teilmengen aussortiert17. Aufgrund der Heterogenität von EVs wäre eine durchflusszytometrische Einzelpartikelmessung ideal, die zur Untersuchung von EVs nach den Paradigmen der Zellanalyse verwendet wurde, wobei Lichtstreu- und Fluoreszenzmarkierungen verwendet wurden, um physiologische Merkmale und Proteinkomponenten zu identifizieren18,19,20. Nichtsdestotrotz wird die konventionelle Durchflusszytometrie durch die geringe Größe von sEV und die geringe Häufigkeit von Oberflächenbiomarkern herausgefordert. Die Sensitivität der Durchflusszytometrie könnte verbessert werden, indem die Detektionsparameter optimiert werden, um Hintergrundrauschen und sEV zu unterscheiden, unabhängig davon, ob Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) oder Fluoreszenzschwellen-Auslöseparameter19 verwendet werden.
Mit dem vorliegenden Protokoll wurden hochauflösende durchflusszytometrische Sortiereinstellungen unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen als Standard optimiert. Durch die Auswahl der richtigen Düsengröße, des Mantelflüssigkeitsdrucks, des Schwellenwert-Auslöseparameters und der Spannungen, die die Streulichtintensität steuern, konnten wir eine bestimmte Teilmenge von sEV aus einem komplexen Gemisch isolieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEV) können aus allen Zelltypen freigesetzt werden und Proteine, DNA und RNA tragen. Signalmoleküle dienen als Indikatoren für den physiologischen und pathologischen Zustand einer Zelle. Es gibt jedoch keine Standardmethode für die sEV-Isolierung, die nachgeschaltete Biomarker-Identifizierungs- und Arzneimittelinterventionsstudien verhindert. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Reinigung von 50-200 nm sEV durch einen Durchflusszellensortierer zur Verfügung. Zu diesem Zweck wurden eine 50-μm-Düse und ein Mantelflüssigkeitsdruck von 80 psi gewählt, um eine gute Sortierrate und einen stabilen Seitenstrom zu erzielen. Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße wurden verwendet, um Populationen von 100-, 200- und 300-nm-Partikeln zu lokalisieren. Durch eine zusätzliche Optimierung der Auslöseschwelle für Spannung, Verstärkung und Vorwärtsstreuung (FSC) konnte das sEV-Signal vom Hintergrundrauschen getrennt werden. Diese Optimierungen bieten einen Bereich kritischer Sortiereinstellungen, der es ermöglicht, eine repräsentative Population von sEV nur mit FSC vs. Side Scatter (SSC) zu erhalten. Die auf Durchflusszytometrie basierende Isolationsmethode ermöglicht nicht nur eine Hochdurchsatzanalyse, sondern auch eine synchrone Klassifizierung oder Proteomanalyse von sEV basierend auf der Biomarkerexpression, was zahlreiche nachgelagerte Forschungsanwendungen eröffnet.

Das Flussdiagramm für das experimentelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei diesem Verfahren wurden Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße als Referenzstandards für die Partikelgrößenverteilung verwendet. Unter der spezifischen instrumentellen Parameterbedingung konnte das Partikelsignal mit Hilfe der logarithmischen Form klar vom Hintergrundrauschen im FSC- vs. SSC-Diagramm unterschieden werden. Gating-Strategien sind in Abbildung 2 dargestell...

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Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Lösungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel durch Optimierung der Sortierparameter der Durchflusszytometrie. Diese Optimierungen bieten eine Reihe kritischer Sortiereinstellungen, die es ermöglichen, repräsentative Populationen kleiner extrazellulärer Vesikel nur mit Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Größenstreuung zu erhalten. Beginnen Sie mit dem Standard-Startvorgang des Durchflusszellensortierers.Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie die Starttaste drücken, und klicken Sie dann auf die Laser-Power-Taste auf dem Laser-Bedienfeld. Drücken Sie die Taste zum Wechseln der Tanks im Untermenü Smart Sampler, um die Fluidik unter Druck zu setzen. Verwenden Sie einen ultraschallgereinigten 50-Mikrometer-Strahl und eine Luftdüse und installieren Sie sie bis zur Düsenanordnung.Stellen Sie den Druck auf 80 SI für die Mantelflüssigkeit und 80,3 SI für den Probenfluss an der Druckkonsole ein. Drücken Sie die Taste zum Starten des Mantelflusses, um den Mantelstrom zu starten. Klicken Sie im Untermenü Smart Sampler auf die Blasenschaltfläche, um die Blase automatisch für 10 Minuten zu entblasen und dann auszuschalten.Um den Strahl auszurichten und den Laserspot zu bestimmen, schalten Sie das Licht der Beleuchtungskammer ein, um den Strahl über die Nadellöcher zu sehen. Stellen Sie die Mikrometer nach oben und unten, links und rechts sowie vorne und hinten ein, um den Stream auf der Lochblende zu zentrieren und den Stream zu fokussieren. Öffnen Sie alle Laserverschlüsse, wählen Sie die Registerkarte Laser- und Stream-Intercept aus und drücken Sie dann kontinuierlich die grüne Pfeiltaste, um den Kalibrierungsprozess für den Laserabfang und die Düsenausrichtung abzuschließen.Greifen Sie auf den Bildschirm für die Feinlaserausrichtung zu. Wählen Sie den 640-Nanometer-Laser und den 772-bar-44-Bandpasskanal als Parameter für die x-Achse und den 405-Nanometer-Laser und den 448-bar-59-Bandpasskanal als Parameter für die y-Achse. Drücken Sie den Triggerparameter-Selektor und wählen Sie den Vorwärtsstreuparameter des 488-Nanometer-Lasers.Als nächstes verdünnen Sie die regenbogenfluoreszierenden Partikel, indem Sie einen Tropfen in einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser bis zu einer Endkonzentration von eins mal 10 bis zu den sechsten Kügelchen pro Milliliter geben. Öffnen Sie die Tür der Probenkammer und laden Sie ein Röhrchen mit vorbereiteten fluoreszierenden Regenbogenpartikeln. Drücken Sie die Starttaste und passen Sie die Mikrometer nach oben und unten an, um die Fluoreszenzintensität zu optimieren und jedes Signal so intensiv wie möglich zu machen.Drücken Sie die Taste "Qualitätskontrolle starten" oder "QC" auf dem Touchscreen-Bedienfeld, um die Qualitätskontrolle automatisch durchzuführen. Drücken Sie dann die IntelliSort-Initialisierungstaste. Das Gerät passt automatisch die Frequenz und Amplitude der Tröpfchenschwingung an, um die Fallverzögerung von ca. 25 zu erhalten und den Abbruchpunkt des Tropfens klar zu visualisieren.Drücken Sie als Nächstes die Drop-Delay-Taste und die Maintain-Taste. Wählen Sie Tube als Sortierausgabetyp aus. Legen Sie einen 15-Milliliter-Röhrchenhalter in die Sortierkammer.Schalten Sie die Plattenspannung ein und stellen Sie die Plattenspannung auf ca. 4.000 Volt ein. Schalten Sie als Nächstes das Testmuster ein, indem Sie auf die Schaltfläche Stream-Setup klicken. Stellen Sie den Schieberegler für die Ladephase und den Schieberegler für die Ablenkung ein, um sicherzustellen, dass das Bild des Stroms mit dem Sammelrohr übereinstimmt.Wählen Sie dann die Schaltfläche mit dem Häkchen aus. Melden Sie sich bei der Summit-Workstation auf dem Computer an. Erstellen Sie ein neues Protokoll aus dem Hauptmenü der Datei.Erstellen Sie dann ein Punktdiagramm, indem Sie die Registerkarte Histogramm in der Systemsteuerung der Summit-Software auswählen. Wählen Sie Vorwärtsstreuung als Parameter für die x-Achse und Seitenstreuung als Parameter für die y-Achse. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die Achse des neuen Punktdiagramms im Arbeitsbereich und stellen Sie die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung in logarithmischer Form dar.Wählen Sie die Registerkarte "Erfassung" und suchen Sie den Bereich "Erfassungsparameter". Aktivieren Sie alle Signale im Untermenü der Parameter aktivieren. Wählen Sie Vorwärtsstreuung als Auslöseparameter und legen Sie den Schwellenwert auf 0,01 fest.Stellen Sie die Spannung und Verstärkung der Vorwärtsstreuung und der Seitenstreuung auf 250 und 0,6 ein, um sicherzustellen, dass Ereignisse innerhalb des Vorwärtsstreudiagramms und der Seitenstreuung getrennt sind. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln in 100-, 200- und 300-Nanometer-Suspensionen, indem Sie einen Mikroliter Mikrokugeln zu einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser hinzufügen. Laden Sie dann die Mikrokugelaufhängung nacheinander.Wählen Sie im Erfassungsmenü von Summit Software die Option Start aus, um 20.000 Ereignisse aufzuzeichnen, und klicken Sie dann nach der Aufzeichnung der Ereignisse auf Stopp. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm des Vorwärtsstreu- und Seitenstreupunkts, um Rechtecke zu erstellen, und ziehen Sie, um die Größe zu ändern. Positionieren Sie die Bereiche des elektronischen Rauschens und der 100-Nanometer-Mikrosphärenpopulation neu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Regionen klicken, um sie in R7 bzw. R4 umzubenennen.Wiederholen Sie die Schritte, um die 200- und 300-Nanometer-Mikrokugeln nacheinander mit Rechtecken einzurahmen, und benennen Sie sie in R5 bzw. R6 um. Bestimmen Sie schließlich den Sortierbereich von 50 bis 200 Nanometern basierend auf dem elektronischen Rauschen und der Position von 200-Nanometer-Partikeln, um ihn als R8 zu definieren. Bearbeiten Sie Sortierentscheidungen im Bereich Sortierlogik und Statistik, indem Sie auf das leere Feld des linken oder L1-Streams doppelklicken und den Bereich mit dem Namen R8 auswählen, um die Sortierlogik zu erstellen. Wählen Sie den Abbruchmodus der Reinheit und wählen Sie eine Tröpfchenhülle über einem Tropfen für den L1-Stream.Laden Sie eine 500-Mikroliter-Probe einer zuvor hergestellten extrazellulären Vesikel oder EVs-Mischung. Drücken Sie die Schaltfläche Start unter dem Erfassungsmenü in Summit, um die Daten zu erfassen, und klicken Sie dann auf Stopp. Drücken Sie anschließend im Sortiermenü auf Start, um 50 bis 200 Nanometer große kleine extrazelluläre Vesikel oder sEV in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.Die durchflusszytometrische Analyse von Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße, um den Größenbereich von 50 bis 200 Nanometern im Vorwärtsstreu- und Seitenstreudiagramm zu lokalisieren, ergab unterscheidbare Partikelsignale. R4, R5 und R6 beziehen sich auf die Positionen von 100-, 200- bzw. 300-Nanometer-Partikeln. R7 ist das elektronische Rauschen als Nachweisgrenze für 50-Nanometer-Partikel und R8 steht für den Positionsbereich von 50 bis 200 Nanometer-Partikeln.Die Partikelgrößenverteilung der EVs-Mischung, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) aus Pankreas-One-Zellen gewonnen wurde, lag nach der Ultrazentrifugation im weiten Bereich von 40 bis 400 Nanometern. Eine durchflusszytometrische Sortierung wurde durchgeführt, um die 50 bis 200 Nanometer sEV innerhalb der R8-Region zu isolieren und zu reinigen. Die Qualität der Isolierung wurde von NTA verifiziert und es wurde festgestellt, dass der Partikelgrößenbereich von sEV nach der Sortierung zwischen 50 und 200 Nanometern lag.Das Vorhandensein von sEV wurde weiter durch TEM beobachtet und die isolierten sEVs wurden durch Western-Blot-Analyse bestätigt, dass sie Marker von CD6, CD63 und CD81 enthielten. Diese Methode ermöglicht die Trennung kleiner extrazellulärer Vesikel und die Klassifizierung oder Analyse der Genexpression kleiner extrazellulärer Vesikel, was zahlreiche nachgeschaltete Forschungsanwendungen eröffnet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Ein wirtschaftliches und vielseitiges Hochdurchsatz-Proteinreinigungssystem mit einem Mehrsäulenplattenadapter

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identifizierung von Peptiden kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen aus dem Knochenmark

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...