Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר המדעי של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית (2020ZG29), פרויקט מחקר הרווחה הציבורית הבסיסית של מחוז ג'ג'יאנג (LGF19H150006, LTGY23B070001), הפרויקט של מחלקת החינוך של מחוז ג'ג'יאנג (Y202147028) ופרויקט הטכנולוגיה הניסויית של מחלקת המעבדות של אוניברסיטת ג'ג'יאנג (SJS201712, SYB202130).

1. תרבית תאים
<ol><li>הכינו מדיום תרבית של מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS). תרבית את תא סרטן הלבלב האנושי, PANC-1, בבקבוק תרביתבגודל 75 ס"מ 2 בצפיפות של 1 x 106 תאים / מ"ל. לדגור על התרבית ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>תת-תרבית התאים כאשר צפיפות התאים מגיעה ל-75%...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content.">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).</li><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לבידוד וטיהור sEV עם גודל החלקיקים שצוין של 50-200 ננומטר באמצעות ממיין תאי זרימה, שאומת על ידי נת"ע. השיטה פתרה את בעיית צוואר הבקבוק של קבלת sEV עם גודל חלקיקים אחיד וטוהר גבוה, תוך הימנעות מהפרעות של מולקולות ביולוגיות לא קשורות עטופות ברכבים חשמליים גדולים<sup cl...

תא משחרר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בגדלים שונים שגורמות למולקולות איתות ותכלילי ממברנה, החשובים לתקשורת בין-תאית1. כלי רכב חשמליים בגדלים שונים ממלאים גם תפקידים ביולוגיים שונים, כאשר 50-200 ננומטר sEV מסוגלים להפיץ במדויק רנ"א, דנ"א וחלבונים למיקום החוץ תאי הנכון. ה- sEV מסייע גם לקבוע את מנגנוני ההפרשה שלהם, הכוללים לא רק את הרגולציה של תהליכים פיזיולוגיים נורמליים כגון מעקב חיסוני, תחזוקת תאי גזע, קרישת דם ותיקון רקמות, אלא גם את הפתולוגיה העומדת בבסיס מספר מחלות כגון התקדמות הגידול וגרורות 2,3. בידוד וניתוח יעילים של sEV הם קריטיים לזיהוי סמנים ביולוגיים ולתכנון התערבויות עתידיות בתרופות.
עם מחקר מתמשך על היישום הקליני של sEV, שיטות הבידוד של sEV הציבו דרישות גבוהות יותר. בשל ההטרוגניות של sEV בגודל, במקור ובתוכן, כמו גם הדמיון שלהם עם כלי רכב חשמליים אחרים בתכונות פיסיקוכימיות וביוכימיות, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV 4,5. נכון לעכשיו, אולטרה-צנטריפוגה, כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC), משקעים פולימריים ולכידת זיקה חיסונית הן שיטות בידוד sEV הנפוצות ביותר6. אולטרה-צנטריפוגה היא עדיין תקן הזהב לבידוד sEV במחקר, למרות היותה גוזלת זמן, וכתוצאה מכך טוהר נמוך עם פיזור גודל רחב של 40-500 ננומטר ונזק מכני משמעותי לרכב החשמלי לאחר צנטריפוגה ארוכת טווח 7,8,9. משקעים פולימריים, אשר בדרך כלל משתמש פוליאתילן גליקול (PEG), סובל טוהר בלתי מתקבל על הדעת עבור ניתוח פונקציונלי לאחר מכן עם משקעים במקביל של אגרגטים חלבונים תאיים וזיהום פולימר10,11. שיטות מבוססות לכידת זיקה חיסונית דורשות נוגדנים בעלות גבוהה עם ספציפיות משתנה, כמו גם יש בעיות עם נפח עיבוד נמוך ותשואות12,13,14. גודל החלקיקים הוא אחד המדדים העיקריים להערכת הטוהר של sEV מבודד. למרות שטוהר sEV נותר יעד בלתי ניתן להשגה, SEC מסיר כמות ניכרת של רכיבים בינוניים, וחלקיקי sEV המופקים בשיטת SEC הם בעיקר בטווח של 50-200 ננומטר15. לטכניקות הקיימות יש כמה חסרונות, כולל אך לא מוגבל להיותן גוזלות זמן, טוהר נמוך, תפוקה נמוכה, יכולת שחזור ירודה, תפוקה נמוכה של דגימות ונזק פוטנציאלי של sEV, מה שהופך אותן ללא תואמות לניצול קליני16. לפיכך, שיטת בידוד sEV מהירה, זולה ומוגדרת בגודל המתאים לנוזלים ביולוגיים מגוונים היא צורך חיוני במספר מצבים מחקריים וקליניים.
בציטומטריית זרימה, חלקיקים בודדים מנותחים באופן רב-פרמטרי בתפוקה גבוהה, ותת-קבוצות ממוינות17. בשל ההטרוגניות של כלי רכב חשמליים, מדידה ציטומטרית של זרימה של חלקיק יחיד תהיה אידיאלית, אשר שימשה לחקר כלי רכב חשמליים בעקבות הפרדיגמות של ניתוח תאים, עם תוויות פיזור אור ופלואורסצנטיות המשמשות לזיהוי תכונות הקשורות לפיזיולוגיה ורכיבי חלבון18,19,20. עם זאת, ציטומטריית זרימה קונבנציונלית מאותגרת על ידי הגודל הקטן של sEV והשפע הנמוך של סמנים ביולוגיים על פני השטח. ניתן לשפר את הרגישות של ציטומטריית זרימה על ידי אופטימיזציה של פרמטרי זיהוי כדי להבחין בין רעשי רקע ו- sEV ללא קשר לשימוש בפיזור קדמי (FSC), פיזור צד (SSC) או פרמטר מפעיל סף פלואורסצנטי19.
עם הפרוטוקול הנוכחי, הגדרות מיון ציטומטריות זרימה ברזולוציה גבוהה עברו אופטימיזציה באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים כסטנדרט. על ידי בחירת גודל הזרבובית המתאים, לחץ נוזל הנדן, פרמטר הפעלת הסף והמתחים השולטים בעוצמות האור המפוזרות, הצלחנו לבודד תת-קבוצה ספציפית של sEV מתערובת מורכבת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV) יכולות להשתחרר מכל סוגי התאים ולשאת חלבון, דנ"א ורנ"א. מולקולות איתות משמשות אינדיקטורים למצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התא. עם זאת, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV, המונעת זיהוי סמנים ביולוגיים במורד הזרם ומחקרי התערבות תרופתית. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיהור של 50-200 ננומטר sEV על ידי ממיין תאי זרימה. לשם כך, נבחרו זרבובית 50 מיקרומטר ולחץ נוזל נדן 80 psi כדי להשיג קצב מיון טוב וזרם צד יציב. מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו לאיתור אוכלוסיות של חלקיקי 100, 200 ו-300 ננומטר. עם מיטוב נוסף של סף הפעלת המתח, הרווח והפיזור הקדמי (FSC), ניתן להפריד את אות ה- sEV מרעשי הרקע. אופטימיזציות אלה מספקות פאנל של הגדרות מיון קריטיות המאפשר לקבל אוכלוסייה מייצגת של sEV באמצעות FSC לעומת פיזור צד (SSC) בלבד. שיטת הבידוד מבוססת ציטומטריית זרימה לא רק מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה, אלא גם מאפשרת סיווג סינכרוני או ניתוח פרוטאום של sEV בהתבסס על ביטוי הסמן הביולוגי, ופותחת יישומי מחקר רבים במורד הזרם.

דיאגרמת תרשים הזרימה של פרוטוקול הניסוי מוצגת באיור 1. בשיטה זו, מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו כתקני ייחוס להתפלגות גודל חלקיקים. תחת תנאי הפרמטר האינסטרומנטלי הספציפי, ניתן היה להבחין בבירור בין אות החלקיקים לרעשי הרקע בתרשים FSC לעומת SSC באמצעות הצורה הלוגריתמ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

פרוטוקול זה מספק שיטת פתרון מהירה וספציפית לגודל עבור שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות על ידי אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטריית זרימה. אופטימיזציות אלה מספקות פאנל של הגדרות מיון קריטיות המאפשר לקבל אוכלוסיות מייצגות של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות באמצעות פיזור קדמי לעומת פיזור גודל בלבד. התחל על-ידי ביצוע הליך ההפעלה הסטנדרטי של סדרן תאי הזרימה.הפעל את ההתקן על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה ולאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה של הלייזר בלוח הבקרה של הלייזר. לחצו על כפתור החלפת המיכלים בתפריט המשנה Smart Sampler כדי להפעיל לחץ על הפלואידיקה. השתמש בזרבובית סילון ואוויר 50 מיקרומטר מנוקה באולטרסאונד והתקן אותו עד למכלול הזרבובית.כוונן את הלחץ ל- 80 SI עבור נוזל נדן ו- 80.3 SI עבור זרימת הדגימה במסוף הלחץ. לחץ על לחצן זרימת הנדן כדי להתחיל את זרימת הנדן כדי להתחיל את זרימת הנדן. לחצו על לחצן הבועות בתפריט המשנה Smart Sampler כדי לבטל את הבועה באופן אוטומטי למשך 10 דקות ולאחר מכן כבו אותה.כדי ליישר את הזרם ולקבוע את נקודת הלייזר, הפעל את אור תא ההארה כדי לראות את הזרם מעל חורי הסיכה. כוונן את המיקרומטרים למעלה ולמטה, שמאלה וימינה, ומלפנים ומאחור כדי למרכז את הזרם על חור הסיכה ולמקד את הזרם. פתח את כל תריסי הלייזר, בחר בכרטיסיה יירוט לייזר וזרם ולאחר מכן לחץ על לחצן החץ הירוק ברציפות כפי שתתבקש כדי להשלים את תהליך כיול יירוט הלייזר ויישור הזרבובית.גש למסך יישור הלייזר העדין. בחר בלייזר בגודל 640 ננומטר ובערוץ פס פס 772 בר 44 כפרמטר ציר x ובפרמטר לייזר 405 ננומטר וערוץ פסים 448 בר 59 כפרמטר ציר Y. לחץ על בורר פרמטרי ההדק ובחר בפרמטר הפיזור קדימה של לייזר 488 ננומטר.לאחר מכן, לדלל את חלקיקי הקשת הפלואורסצנטית על ידי הוספת טיפה אחת לתוך מיליליטר אחד של מים מזוקקים כפול לריכוז סופי של אחד כפול 10 עד חרוז שישי למיליליטר. פתחו את דלת תא הדגימה וטענו שפופרת של חלקיקים פלואורסצנטיים מוכנים בקשת. לחץ על לחצן התחל דגימה וכוונן מיקרומטרים למעלה ולמטה כדי למטב את עוצמת הפלואורסצנטיות, מה שהופך כל אות לאינטנסיבי ככל האפשר.לחץ על לחצן התחל בקרת איכות או QC בלוח הבקרה של מסך המגע כדי לבצע QC באופן אוטומטי. לאחר מכן לחץ על לחצן אתחול IntelliSort. המכשיר מתאים באופן אוטומטי את התדירות והמשרעת של תנודת הטיפות כדי להשיג את עיכוב הירידה של כ -25 ולהיות מסוגל לדמיין את נקודת השבירה של הטיפה בבירור.לאחר מכן, לחץ על כפתור עיכוב השחרור ועל כפתור התחזוקה. בחר צינור כסוג פלט המיון. מניחים מחזיק צינור 15 מיליליטר בתא המיון.הפעל את מתח הצלחת והגדר את מתח הצלחת לכ- 4, 000 וולט. לאחר מכן, הפעל את תבנית הבדיקה על ידי בחירה בלחצן הגדרת הזרם. התאימו את מחוון פאזת הטעינה ואת מחוון הסטייה כדי לוודא שתמונת הזרם תואמת לצינור האיסוף.לאחר מכן בחר בלחצן סימן הביקורת. התחברו לתחנת העבודה Summit במחשב. צור פרוטוקול חדש מהתפריט הראשי של הקובץ.לאחר מכן צור תרשים נקודות על-ידי בחירת כרטיסיית ההיסטוגרמה בלוח הבקרה של תוכנת הפסגה. בחר 'פיזור קדימה' כפרמטר 'ציר x' ו'פיזור צד' כפרמטר 'ציר y'. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על ציר תרשים הנקודות החדש בסביבת העבודה והצג את הפיזור קדימה ואת הפיזור הצידי בצורה לוגריתמית.בחר בכרטיסייה acquisition ואתר את חלונית פרמטרי הרכישה. הפעל את כל האותות בתפריט המשנה של פרמטרים מפעילים. בחר פיזור קדימה כפרמטר הגורם המפעיל והגדר סף של 0.01.כוונן את המתח והרווח של פיזור קדמי ופיזור צדדי ב- 250 ו- 0.6 כדי להבטיח הפרדה בין אירועים בחלקת הפיזור הקדמי לעומת פיזור צדדי ואוכלוסיות. דללו את מיקרוספרות הפוליסטירן הפלואורסצנטיות לתרחיפים של 100, 200 ו-300 ננומטר על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של מיקרוספרות למיליליטר אחד של מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן לטעון את השעיית microsphere ברציפות.בחר התחל בתפריט הרכישה של Summit Software כדי להקליט 20, 000 אירועים ולאחר מכן לחץ על עצור לאחר הקלטת האירועים. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תרשים נקודות הפיזור קדימה לעומת פיזור צדדי כדי ליצור מלבנים וגרור לשינוי גודל. מקם מחדש את אזורי הרעש האלקטרוני ואוכלוסיית המיקרוספירה בגודל 100 ננומטר על ידי לחיצה ימנית על האזורים כדי לשנות את שמם ל-R7 ו-R4 בהתאמה.חזור על השלבים כדי למסגר את המיקרוספרות בגודל 200 ו- 300 ננומטר עם מלבנים ברצף, ושנה את שמם ל- R5 ו- R6 בהתאמה. לבסוף, קבע את אזור המיון של 50 עד 200 ננומטר בהתבסס על הרעש האלקטרוני והמיקום של חלקיקים של 200 ננומטר כדי להגדיר אותו כ- R8. ערוך החלטות מיון בחלונית לוגיקת מיון וסטטיסטיקה על-ידי לחיצה כפולה על השדה הריק של זרם שמאלי או L1 ובחירת האזור בשם R8 ליצירת לוגיקת המיון. בחר את מצב ההפלה של טוהר ובחר מעטפת טיפה מעל טיפה אחת עבור זרם L1.טען דגימה של 500 מיקרוליטר של שלפוחיות חוץ-תאיות שהוכנו בעבר או תערובת EVs. לחץ על לחצן התחל תחת תפריט הרכישה ב- Summit כדי להשיג את הנתונים ולאחר מכן לחץ על עצור. לאחר מכן, לחץ על התחל בתפריט המיון כדי לאסוף שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות בגודל 50 עד 200 ננומטר או sEV לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.ניתוח ציטומטריית זרימה של מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי כדי לאתר את טווח הגדלים של 50 עד 200 ננומטר בחלקת הפיזור הקדמי לעומת הפיזור הצדדי גילה אותות חלקיקים מובחנים. R4, R5 ו-R6 מתייחסים למיקומם של חלקיקים בגודל 100, 200 ו-300 ננומטר בהתאמה. R7 הוא הרעש האלקטרוני כגבול הגילוי של חלקיקים 50 ננומטר ו-R8 מייצג את טווח המיקום של חלקיקים של 50 עד 200 ננומטר.התפלגות גודל החלקיקים של תערובת כלי הרכב החשמליים שהופקה מתאי לבלב על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, או NTA, הייתה בטווח רחב של 40 עד 400 ננומטר לאחר אולטרה-צנטריפוגה. מיון ציטומטרי זרימה בוצע כדי לבודד ולטהר את sEV 50 עד 200 ננומטר באזור R8. איכות הבידוד אומתה על ידי נת"ע ונמצא כי טווח גודל החלקיקים של sEV לאחר מיון היה בין 50 ל-200 ננומטר.נוכחות של sEV נצפתה עוד יותר על ידי TEM וה- sEV המבודדים אושרו כמכילים סמנים של CD6, CD63 ו- CD81 על ידי Western Blot Analysis. שיטה זו מאפשרת הפרדה של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות וסיווג או ניתוח פרו טם של ביטוי גנים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות, מה שפותח יישומי מחקר רבים במורד הזרם.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

בידוד של מסחטות ושלפוחיות רקמה מהכבד

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

זיהוי פפטידים של בועיות חוץ-תאיות קטנות ממקרופאגים שמקורם במח עצם

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...