Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

इस काम को झेजियांग चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय (2020जेडजी 29) के वैज्ञानिक अनुसंधान कोष, झेजियांग प्रांत की बुनियादी सार्वजनिक कल्याण अनुसंधान परियोजना (एलजीएफ 19 एच 150006, एलटीजीवाई 23 बी 070001), झेजियांग प्रांतीय शिक्षा विभाग की परियोजना (वाई 202147028) और झेजियांग विश्वविद्यालय प्रयोगशाला विभाग (एसजेएस 201712, एसवाईबी 202020) की प्रायोगिक प्रौद्योगिकी की परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था।

1. सेल संस्कृति
<ol><li>10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) का एक संस्कृति माध्यम तैयार करें। मानव अग्नाशय के कैंसर सेल, पैनसी -1, को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के ?...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. 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D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल फ्लो सेल सॉर्टर का उपयोग करके 50-200 एनएम के निर्दिष्ट कण आकार के साथ एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए एक अनुकूलित विधि की रूपरेखा तैयार करता है, जिसे एनटीए द्वारा मान्य किया गया था। विधि ?...

एक कोशिका अलग-अलग आकार के बाह्य पुटिकाओं (ईवी) को जारी करती है जिसके परिणामस्वरूप सिग्नलिंग अणु और झिल्ली समावेशन होते हैं, जो अंतरकोशिकीयसंचार के लिए महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न आकारों के ईवी भी अलग-अलग जैविक भूमिका निभाते हैं, जिसमें 50-200 एनएम एसईवी आरएनए, डीएनए और प्रोटीन को सही बाह्य स्थान पर सटीक रूप से वितरित करने में सक्षम है। एसईवी उनके स्राव तंत्र को निर्धारित करने में भी मदद करता है, जिसमें न केवल प्रतिरक्षा निगरानी, स्टेम सेल रखरखाव, रक्त जमावट और ऊतक की मरम्मत जैसी सामान्य शारीरिक प्रक्रियाओं का विनियमन शामिल है, बल्कि ट्यूमर की प्रगति और मेटास्टेसिस 2,3 जैसी कई बीमारियों को अंतर्निहित विकृति भी शामिल है। बायोमाकर्स की पहचान करने और भविष्य के दवा हस्तक्षेपों को डिजाइन करने के लिए एसईवी का प्रभावी अलगाव और विश्लेषण महत्वपूर्ण है।
एसईवी के नैदानिक अनुप्रयोग पर निरंतर शोध के साथ, एसईवी के अलगाव विधियों ने उच्च आवश्यकताओं को आगे बढ़ाया है। आकार, स्रोत और सामग्री में एसईवी की विविधता के साथ-साथ भौतिक रासायनिक और जैव रासायनिक गुणों में अन्य ईवी के साथ उनकी समानता के कारण, एसईवी अलगाव 4,5 के लिए कोई मानक विधि नहीं है। वर्तमान में, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), बहुलक वर्षा, और इम्यूनोफिनिटी कैप्चर सबसे आम एसईवीअलगाव विधियां हैं। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन अभी भी अनुसंधान में एसईवी अलगाव के लिए स्वर्ण मानक है, समय लेने वाला होने के बावजूद, जिसके परिणामस्वरूप 40-500 एनएम के व्यापक आकार के वितरण के साथ कम शुद्धता और दीर्घकालिक सेंट्रीफ्यूजेशन 7,8,9 के बाद एसईवी को महत्वपूर्ण यांत्रिक क्षति होती है। बहुलक वर्षा, जो आमतौर पर पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) का उपयोग करती है, बाह्य प्रोटीन समुच्चय और बहुलक संदूषण10,11 के सहवर्ती वर्षा के साथ बाद के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अस्वीकार्य शुद्धता से ग्रस्त है। इम्यूनोफिनिटी कैप्चर-आधारित विधियों को अलग-अलग विशिष्टता के साथ उच्च लागत वाले एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, साथ ही कम प्रसंस्करण मात्रा औरउपज 12,13,14 के साथ समस्याएं होती हैं। कण आकार पृथक एसईवी की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए मुख्य संकेतकों में से एक है। यद्यपि एसईवी शुद्धता एक अप्राप्य लक्ष्य बनी हुई है, एसईसी मध्यम घटकों की काफी मात्रा को हटा देता है, और एसईसी विधि द्वारा निकाले गए एसईवी कण मुख्य रूप से 50-200 एनएम15 की सीमा में होते हैं। मौजूदा तकनीकों के कुछ नुकसान हैं, जिनमें समय लेने वाली, कम शुद्धता, कम उपज, खराब प्रजनन क्षमता, नमूनों की कम थ्रूपुट और एसईवी की संभावित क्षति शामिल है, जो इसेनैदानिक उपयोग के साथ असंगत बनाती है। इस प्रकार, विभिन्न बायोफ्लुइड्स पर लागू एक तेजी से, सस्ती और आकार-निर्दिष्ट एसईवी अलगाव विधि कई शोध और नैदानिक स्थितियों में एक आवश्यक आवश्यकता है।
फ्लो साइटोमेट्री में, एकल कणों का विश्लेषण उच्च-थ्रूपुट, मल्टीपैरामीट्रिक तरीके से किया जाता है, और उपसमुच्चयको 17 में क्रमबद्ध किया जाता है। ईवी की विविधता के कारण, एक एकल-कण प्रवाह साइटोमेट्रिक माप आदर्श होगा, जिसका उपयोग सेल विश्लेषण के प्रतिमानों के बाद ईवी की जांच करने के लिए किया गया है, जिसमें शरीर विज्ञान से संबंधित विशेषताओं और प्रोटीन घटकों 18,19,20 की पहचान करने के लिए प्रकाश स्कैटर और फ्लोरेसेंस लेबल का उपयोग किया जा रहा है। फिर भी, पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री को एसईवी के छोटे आकार और सतह बायोमाकर्स की कम प्रचुरता से चुनौती दी जाती है। फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी), साइड स्कैटर (एसएससी), या फ्लोरेसेंस थ्रेशोल्ड ट्रिगरिंग पैरामीटर19 का उपयोग किए बिना पृष्ठभूमि शोर और एसईवी को अलग करने के लिए डिटेक्शन मापदंडों को अनुकूलित करके फ्लो साइटोमेट्री की संवेदनशीलता में सुधार किया जा सकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्ट सेटिंग्स को मानक के रूप में फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था। उचित नोजल आकार, शीथ द्रव दबाव, थ्रेशोल्ड ट्रिगरिंग पैरामीटर और बिखरे हुए प्रकाश तीव्रता को नियंत्रित करने वाले वोल्टेज का चयन करके, हम एक जटिल मिश्रण से एसईवी के एक विशिष्ट उप-समूह को अलग करने में सक्षम थे।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) को सभी सेल प्रकारों से जारी किया जा सकता है और प्रोटीन, डीएनए और आरएनए ले जाया जा सकता है। सिग्नलिंग अणु एक कोशिका की शारीरिक और रोग संबंधी स्थिति के संकेतक के रूप में काम करते हैं। हालांकि, एसईवी अलगाव के लिए कोई मानक विधि नहीं है, जो डाउनस्ट्रीम बायोमार्कर पहचान और दवा हस्तक्षेप अध्ययन को रोकती है। इस लेख में, हम एक प्रवाह सेल सॉर्टर द्वारा 50-200 एनएम एसईवी के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके लिए, एक अच्छी छंटाई दर और स्थिर साइड स्ट्रीम प्राप्त करने के लिए 50 μm नोजल और 80 psi शीथ द्रव दबाव का चयन किया गया था। मानक आकार के पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स का उपयोग 100, 200 और 300 एनएम कणों की आबादी का पता लगाने के लिए किया गया था। वोल्टेज, लाभ और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) ट्रिगरिंग थ्रेसहोल्ड के अतिरिक्त अनुकूलन के साथ, एसईवी सिग्नल को पृष्ठभूमि शोर से अलग किया जा सकता है। ये ऑप्टिमाइज़ेशन महत्वपूर्ण प्रकार सेटिंग्स का एक पैनल प्रदान करते हैं जो केवल एफएससी बनाम साइड स्कैटर (एसएससी) का उपयोग करके एसईवी की प्रतिनिधि आबादी प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित अलगाव विधि न केवल उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देती है, बल्कि बायोमार्कर अभिव्यक्ति के आधार पर एसईवी के तुल्यकालिक वर्गीकरण या प्रोटिओम विश्लेषण की भी अनुमति देती है, जिससे कई डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोग खुलते हैं।

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए प्रवाह चार्ट आरेख चित्रा 1 में दिखाया गया है। इस विधि में, कण आकार वितरण के लिए संदर्भ मानकों के रूप में मानक आकार पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स का उपयोग किया गया ?...

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Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

यह प्रोटोकॉल एयर स्प्रे नोजल, शीथ द्रव दबाव, नमूना प्रवाह दबाव, वोल्टेज, लाभ और ट्रिगरिंग थ्रेशोल्ड मापदंडों के आकार को अनुकूलित करके छोटे बाह्य पुटिकाओं के लिए एक तेजी से और आकार-विशिष्ट अलगाव विधि प्रदान करता है।

उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

यह प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री सॉर्टिंग मापदंडों को अनुकूलित करके छोटे बाह्य पुटिकाओं के लिए एक तेजी से और आकार-विशिष्ट समाधान विधि प्रदान करता है। ये अनुकूलन महत्वपूर्ण प्रकार सेटिंग्स का एक पैनल प्रदान करते हैं जो केवल फॉरवर्ड स्कैटर बनाम आकार स्कैटर का उपयोग करके छोटे बाह्य पुटिकाओं की प्रतिनिधि आबादी प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। प्रवाह कक्ष सॉर्टर की मानक स्टार्टअप प्रक्रिया निष्पादित करके प्रारंभ करें।स्टार्टअप बटन दबाकर मशीन चालू करें, फिर लेजर नियंत्रण कक्ष पर लेजर पावर बटन पर क्लिक करें। तरल पदार्थ पर दबाव डालने के लिए स्मार्ट सैंपलर सबमेनू पर टैंक बदलें बटन दबाएं। अल्ट्रासोनिक रूप से साफ किए गए 50 माइक्रोमीटर जेट और एयर नोजल का उपयोग करें और इसे नोजल असेंबली में स्थापित करें।दबाव कंसोल पर शीथ द्रव के लिए 80 एसआई और नमूना प्रवाह के लिए 80.3 एसआई पर दबाव समायोजित करें। शीथ स्ट्रीम बहने शुरू करने के लिए स्टार्ट शीथ फ्लो बटन दबाएं। स्मार्ट सैंपलर सबमेनू में बबल बटन पर क्लिक करें ताकि 10 मिनट के लिए स्वचालित रूप से डिबबल हो सके और फिर इसे बंद कर दें।धारा को संरेखित करने और लेजर स्पॉट निर्धारित करने के लिए, पिनहोल पर धारा को देखने के लिए रोशनी कक्ष प्रकाश चालू करें। पिनहोल पर धारा को केंद्र में रखने और धारा पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ऊपर और नीचे, बाएं और दाएं, और सामने और पीछे के माइक्रोमीटर को समायोजित करें। सभी लेजर शटर खोलें, लेजर और स्ट्रीम इंटरसेप्ट टैब का चयन करें और फिर लेजर इंटरसेप्ट और नोजल संरेखण अंशांकन प्रक्रिया को पूरा करने के लिए संकेत के रूप में हरे तीर बटन को लगातार दबाएं।ठीक लेजर संरेखण स्क्रीन तक पहुंचें। एक्स-एक्सिस पैरामीटर के रूप में 640 नैनोमीटर लेजर और 772 बार 44 बैंडपास चैनल और वाई-एक्सिस पैरामीटर के रूप में 405 नैनोमीटर लेजर और 448 बार 59 बैंडपास चैनल का चयन करें। ट्रिगर पैरामीटर चयनकर्ता दबाएं और 488 नैनोमीटर लेजर के फॉरवर्ड स्कैटर पैरामीटर चुनें।इसके बाद, इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट कणों को डबल आसुत जल के एक मिलीलीटर में एक बूंद जोड़कर पतला करें, जो प्रति मिलीलीटर 10 से छठे मोतियों की अंतिम एकाग्रता में है। नमूना कक्ष दरवाजा खोलें और तैयार इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट कणों की एक ट्यूब लोड करें। प्रारंभ नमूना बटन दबाएं और प्रतिदीप्ति तीव्रता को अनुकूलित करने के लिए माइक्रोमीटर को ऊपर और नीचे समायोजित करें, जिससे प्रत्येक संकेत यथासंभव तीव्र हो जाए।स्वचालित रूप से QC निष्पादित करने के लिए टचस्क्रीन नियंत्रण कक्ष पर प्रारंभ गुणवत्ता नियंत्रण या QC बटन दबाएँ। फिर IntelliSort प्रारंभिककरण बटन दबाएँ। उपकरण लगभग 25 की ड्रॉप देरी प्राप्त करने के लिए बूंद दोलन की आवृत्ति और आयाम को स्वचालित रूप से समायोजित करता है और ड्रॉप के ब्रेक ऑफ पॉइंट को स्पष्ट रूप से कल्पना करने में सक्षम होता है।इसके बाद, ड्रॉप देरी बटन और रखरखाव बटन दबाएं। आउटपुट प्रकार को सॉर्ट करने के रूप में ट्यूब का चयन करें। सॉर्ट चैंबर में 15 मिलीलीटर ट्यूब धारक रखें।प्लेट वोल्टेज चालू करें और प्लेट वोल्टेज को लगभग 4,000 वोल्ट पर सेट करें। इसके बाद, स्ट्रीम सेटअप बटन का चयन करके परीक्षण पैटर्न चालू करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्ट्रीम की छवि संग्रह ट्यूब के अनुरूप है, चार्ज चरण स्लाइडर और विक्षेपण स्लाइडर समायोजित करें।फिर चेक मार्क बटन का चयन करें। कंप्यूटर पर Summit वर्कस्टेशन में लॉग इन करें। फ़ाइल मुख्य मेनू से एक नया प्रोटोकॉल बनाएँ।फिर समिट सॉफ्टवेयर कंट्रोल पैनल में हिस्टोग्राम टैब का चयन करके एक डॉट प्लॉट बनाएं। एक्स-अक्ष पैरामीटर के रूप में फॉरवर्ड स्कैटर चुनें और वाई-एक्सिस पैरामीटर के रूप में साइड स्कैटर चुनें। फिर कार्यक्षेत्र में नए डॉट प्लॉट की धुरी पर राइट-क्लिक करें और आगे के स्कैटर और साइड स्कैटर को लघुगणकीय रूप में प्रस्तुत करें।अधिग्रहण टैब का चयन करें और अधिग्रहण पैरामीटर पैनल का पता लगाएं। सक्षम मापदंडों के उप-मेनू में सभी संकेतों को सक्षम करें। ट्रिगर पैरामीटर के रूप में फॉरवर्ड स्कैटर चुनें और 0.01 की सीमा सेट करें।250 और 0.6 पर फॉरवर्ड स्कैटर और साइड स्कैटर के वोल्टेज और लाभ को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि फॉरवर्ड स्कैटर बनाम साइड स्कैटर प्लॉट और आबादी अलग हो गई है। फ्लोरोसेंट पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स को 100, 200 और 300 नैनोमीटर सस्पेंशन में पतला करें, माइक्रोसेफर्स के एक माइक्रोलीटर को डबल डिस्टिल्ड पानी के एक मिलीलीटर में जोड़कर। फिर माइक्रोसेफर्स निलंबन को क्रमिक रूप से लोड करें।20,000 ईवेंट रिकॉर्ड करने के लिए समिट सॉफ़्टवेयर के अधिग्रहण मेनू के तहत प्रारंभ का चयन करें और फिर ईवेंट रिकॉर्ड करने के बाद रोकें क्लिक करें. आयताकार बनाने के लिए फॉरवर्ड स्कैटर बनाम साइड स्कैटर डॉट प्लॉट पर राइट-क्लिक करें और आकार बदलने के लिए खींचें। इलेक्ट्रॉनिक शोर और 100 नैनोमीटर माइक्रोसेफर्स आबादी के क्षेत्रों को क्रमशः आर 7 और आर 4 के रूप में नाम देने के लिए क्षेत्रों पर राइट-क्लिक करके पुनर्स्थापित करें।आयताकारों के साथ 200 और 300 नैनोमीटर माइक्रोसेफर्स को क्रमिक रूप से फ्रेम करने के चरणों को दोहराएं, और उन्हें क्रमशः आर 5 और आर 6 के रूप में नाम दें। अंत में, इलेक्ट्रॉनिक शोर के आधार पर 50 से 200 नैनोमीटर सॉर्टिंग क्षेत्र और इसे आर 8 के रूप में परिभाषित करने के लिए 200 नैनोमीटर कणों की स्थिति निर्धारित करें। बाएं या एल 1 स्ट्रीम के रिक्त फ़ील्ड पर डबल क्लिक करके और सॉर्ट लॉजिक बनाने के लिए आर 8 नामक क्षेत्र का चयन करके सॉर्ट लॉजिक और सांख्यिकी पैनल में सॉर्ट निर्णय संपादित करें। शुद्धता का गर्भपात मोड चुनें और एल 1 स्ट्रीम के लिए एक बूंद के ऊपर एक बूंद लिफाफा चुनें।पहले से तैयार बाह्य पुटिकाओं या ईवी मिश्रण का लोड 500 माइक्रोलीटर नमूना। डेटा प्राप्त करने के लिए समिट में अधिग्रहण मेनू के तहत प्रारंभ बटन दबाएं और फिर रोकें क्लिक करें. इसके बाद, 50 से 200 नैनोमीटर आकार के छोटे बाह्य पुटिकाओं या एसईवी को 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र करने के लिए सॉर्ट मेनू में स्टार्ट दबाएं।आगे के स्कैटर बनाम साइड स्कैटर प्लॉट में 50 से 200 नैनोमीटर आकार की सीमा का पता लगाने के लिए मानक आकार के पॉलीस्टाइनिन माइक्रोसेफर्स के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से अलग-अलग कण संकेतों का पता चला। R4, R5, और R6 क्रमशः 100, 200 और 300 नैनोमीटर कणों की स्थिति को संदर्भित करते हैं। आर 7 50 नैनोमीटर कणों के लिए पहचान सीमा के रूप में इलेक्ट्रॉनिक शोर है और आर 8 50 से 200 नैनोमीटर कणों की स्थिति सीमा का प्रतिनिधित्व करता है।नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, या एनटीए द्वारा अग्नाशयी एक कोशिकाओं से प्राप्त ईवी मिश्रण का कण आकार वितरण अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद 40 से 400 नैनोमीटर की विस्तृत श्रृंखला में था। आर 8 क्षेत्र के भीतर 50 से 200 नैनोमीटर एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग की गई थी। अलगाव की गुणवत्ता को एनटीए द्वारा सत्यापित किया गया था और यह पाया गया था कि छंटाई के बाद एसईवी की कण आकार सीमा 50 से 200 नैनोमीटर के बीच थी।एसईवी की उपस्थिति को टीईएम द्वारा आगे देखा गया और अलग किए गए एसईवी में वेस्टर्न ब्लोट एनालिसिस द्वारा सीडी 6, सीडी 63 और सीडी 81 के मार्कर होने की पुष्टि की गई। यह विधि छोटे बाह्य पुटिकाओं के पृथक्करण और कई डाउनस्ट्रीम अनुसंधान अनुप्रयोगों को खोलने वाले छोटे बाह्य पुटिकाओं जीन अभिव्यक्ति के वर्गीकरण या प्रोटेम विश्लेषण की अनुमति देती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

HCN1 और TRIP8b बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के छोटे अणु inhibitors की पहचान के लिए विधि

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellular प्रोटीन Microarray कम संबध रिसेप्टर का उच्च प्रवाह का पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकी-Ligand बातचीत

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

जिगर से ऊतक extracellular Vesicles के अलगाव

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा extracellular Vesicles की इमेजिंग

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

स्क्रीनिंग छोटे अणु अवरोधकों के लिए NADH-युग्मित ATPase परख के एक अर्द्ध उच्च Throughput अनुकूलन

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

मल्टी-कॉलम प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके एक किफायती और बहुमुखी उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए क्रिस्टल हिट प्राप्त करने के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के पेप्टाइड्स की पहचान

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...