Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di ricerca scientifica dell'Università di medicina cinese di Zhejiang (2020ZG29), dal Progetto di ricerca sul benessere pubblico di base della provincia di Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), dal Progetto del Dipartimento provinciale dell'istruzione dello Zhejiang (Y202147028) e dal Progetto di tecnologia sperimentale del Dipartimento di laboratorio dell'Università di Zhejiang (SJS201712, SYB202130).

1. Coltura cellulare
<ol><li>Preparare un terreno di coltura di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Coltura della cellula tumorale pancreatica umana, PANC-1, in un matraccio di coltura di 75 cm2 ad una densità di 1 x 106 cellule/ml. Incubare la coltura a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Subcoltura delle cellule quando la densità cellulare raggiunge il 75% -80% sotto osservazione microscopica. Rimuovere il mezzo e ...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content.">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).</li><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

Questo protocollo delinea un metodo ottimizzato per isolare e purificare sEV con la dimensione delle particelle specificata di 50-200 nm utilizzando un selezionatore di celle a flusso, che è stato convalidato da NTA. Il metodo ha risolto il problema del collo di bottiglia di ottenere sEV con dimensioni delle particelle uniformi e elevata purezza, evitando interferenze da molecole biologiche non correlate avvolte in EV di grandi dimensioni22. Analisi rapide e ad alto rendimento sono possibili con ...

Una cellula rilascia vescicole extracellulari (EV) di varie dimensioni che si traducono in molecole di segnalazione e inclusioni di membrana, che sono importanti per la comunicazione intercellulare1. Anche le EV di diverse dimensioni svolgono ruoli biologici diversi, con 50-200 nm sEV in grado di distribuire con precisione RNA, DNA e proteine nella corretta posizione extracellulare. Il sEV aiuta anche a determinare i loro meccanismi di secrezione, coinvolgendo non solo la regolazione dei normali processi fisiologici come la sorveglianza immunitaria, il mantenimento delle cellule staminali, la coagulazione del sangue e la riparazione dei tessuti, ma anche la patologia alla base di diverse malattie come la progressione del tumore e le metastasi 2,3. Un isolamento e un'analisi efficaci della sEV sono fondamentali per identificare i biomarcatori e progettare futuri interventi farmacologici.
Con la continua ricerca sull'applicazione clinica di sEV, i metodi di isolamento di sEV hanno avanzato requisiti più elevati. A causa dell'eterogeneità di sEV in termini di dimensioni, fonte e contenuto, nonché della loro somiglianza con altri EV nelle proprietà fisico-chimiche e biochimiche, non esiste un metodo standard per l'isolamento di sEV 4,5. Attualmente, l'ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la precipitazione polimerica e la cattura per immunoaffinità sono i metodi di isolamento sEV più comuni6. L'ultracentrifugazione è ancora il gold standard per l'isolamento di sEV nella ricerca, nonostante richieda molto tempo, con conseguente bassa purezza con un'ampia distribuzione dimensionale di 40-500 nm e danni meccanici significativi al sEV dopo centrifugazione a lungo termine 7,8,9. La precipitazione polimerica, che di solito utilizza glicole polietilenico (PEG), soffre di purezza inaccettabile per la successiva analisi funzionale con concomitante precipitazione di aggregati proteici extracellulari e contaminazione polimerica10,11. I metodi basati sulla cattura dell'immunoaffinità richiedono anticorpi ad alto costo con specificità variabile, oltre ad avere problemi con bassi volumi di elaborazione e rese12,13,14. La dimensione delle particelle è uno dei principali indicatori per valutare la purezza del sEV isolato. Sebbene la purezza di sEV rimanga un obiettivo irraggiungibile, SEC rimuove una notevole quantità di componenti medi e le particelle sEV estratte con il metodo SEC sono principalmente nell'intervallo 50-200 nm15. Le tecniche esistenti presentano alcuni svantaggi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la lunga durata, la bassa purezza, la bassa resa, la scarsa riproducibilità, la bassa produttività dei campioni e il potenziale danno della sEV, che la rende incompatibile con l'utilizzo clinico16. Pertanto, un metodo di isolamento sEV rapido, economico e dimensionale applicabile a diversi biofluidi è una necessità essenziale in diverse situazioni di ricerca e cliniche.
Nella citometria a flusso, le singole particelle vengono analizzate in modo multiparametrico ad alto rendimento e i sottoinsiemi vengono selezionati17. A causa dell'eterogeneità delle EV, sarebbe ideale una misurazione citometrica a flusso di particelle singole, che è stata utilizzata per studiare le EV seguendo i paradigmi dell'analisi cellulare, con etichette di dispersione della luce e fluorescenza utilizzate per identificare le caratteristiche correlate alla fisiologia e i componenti proteici18,19,20. Tuttavia, la citometria a flusso convenzionale è messa alla prova dalle piccole dimensioni di sEV e dalla bassa abbondanza di biomarcatori di superficie. La sensibilità della citometria a flusso potrebbe essere migliorata ottimizzando i parametri di rilevamento per distinguere il rumore di fondo e il sEV indipendentemente dall'utilizzo di scatter in avanti (FSC), dispersione laterale (SSC) o parametro di attivazione della soglia di fluorescenza19.
Con il presente protocollo, le impostazioni di ordinamento citometrico a flusso ad alta risoluzione sono state ottimizzate utilizzando sfere fluorescenti come standard. Selezionando la dimensione corretta dell'ugello, la pressione del fluido della guaina, il parametro di attivazione della soglia e le tensioni che controllano le intensità della luce diffusa, siamo stati in grado di isolare un sottoinsieme specifico di sEV da una miscela complessa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) possono essere rilasciate da tutti i tipi di cellule e trasportare proteine, DNA e RNA. Le molecole di segnalazione servono come indicatori dello stato fisiologico e patologico di una cellula. Tuttavia, non esiste un metodo standard per l'isolamento di sEV, che impedisce l'identificazione dei biomarcatori a valle e gli studi di intervento farmacologico. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la purificazione di 50-200 nm sEV da parte di una selezionatrice di celle a flusso. Per questo, sono stati selezionati un ugello da 50 μm e una pressione del fluido della guaina da 80 psi per ottenere una buona velocità di selezione e un flusso laterale stabile. Sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard per localizzare popolazioni di particelle di 100, 200 e 300 nm. Con un'ulteriore ottimizzazione della soglia di attivazione di tensione, guadagno e diffusione diretta (FSC), il segnale sEV potrebbe essere separato dal rumore di fondo. Queste ottimizzazioni forniscono un pannello di impostazioni di ordinamento critiche che consente di ottenere una popolazione rappresentativa di sEV utilizzando solo FSC vs. side scatter (SSC). Il metodo di isolamento basato sulla citometria a flusso non solo consente l'analisi ad alto rendimento, ma consente anche la classificazione sincrona o l'analisi del proteoma di sEV in base all'espressione del biomarcatore, aprendo numerose applicazioni di ricerca a valle.

Il diagramma di flusso per il protocollo sperimentale è mostrato nella Figura 1. In questo metodo, sono state utilizzate microsfere di polistirene di dimensioni standard come standard di riferimento per la distribuzione granulometrica. Nella condizione del parametro strumentale specifico, il segnale delle particelle potrebbe essere chiaramente distinto dal rumore di fondo nel grafico FSC vs. SSC usando la forma logaritmica. Le strategie di gating sono illustrate nella F...

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Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento rapido e specifico per le dimensioni delle piccole vescicole extracellulari ottimizzando le dimensioni dell'ugello di nebulizzazione dell'aria, la pressione del fluido della guaina, la pressione del flusso del campione, la tensione, il guadagno e i parametri di soglia di attivazione.

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Questo protocollo fornisce un metodo di soluzione rapido e specifico per le dimensioni di piccole vescicole extracellulari ottimizzando i parametri di ordinamento della citometria a flusso. Queste ottimizzazioni forniscono un pannello di impostazioni di ordinamento critiche che consente di ottenere popolazioni rappresentative di piccole vescicole extracellulari utilizzando solo la dispersione diretta rispetto alla dispersione dimensionale. Iniziare eseguendo la procedura di avvio standard dello smistatore di celle di flusso.Accendere la macchina premendo il pulsante di avvio, quindi fare clic sul pulsante di accensione laser sul pannello di controllo laser. Premere il pulsante di cambio serbatoi nel sottomenu Smart Sampler per pressurizzare la fluidica. Utilizzare un getto da 50 micrometri pulito ad ultrasuoni e un ugello dell'aria e installarlo nel gruppo ugello.Regolare la pressione a 80 SI per il fluido della guaina e 80,3 SI per il flusso del campione sulla console di pressione. Premere il pulsante di avvio del flusso della guaina per avviare il flusso della guaina. Fare clic sul pulsante a bolla nel sottomenu Campionatore avanzato per disattivare automaticamente per 10 minuti, quindi disattivarlo.Per allineare il flusso e determinare il punto laser, accendere la luce della camera di illuminazione per visualizzare il flusso sopra i fori di spillo. Regola i micrometri su e giù, sinistra e destra e anteriore e posteriore per centrare il flusso sul foro stenopeico e focalizzare il flusso. Aprire tutti gli otturatori laser, selezionare la scheda di intercettazione laser e flusso, quindi premere continuamente il pulsante freccia verde come richiesto per completare il processo di calibrazione dell'intercettazione laser e dell'allineamento degli ugelli.Accedi allo schermo di allineamento laser fine. Selezionare il laser a 640 nanometri e il canale passa banda 44 a 772 bar come parametro dell'asse x e il laser a 405 nanometri e il canale passa-banda a 448 bar 59 come parametro dell'asse y. Premere il selettore del parametro trigger e scegliere il parametro di diffusione diretta del laser a 488 nanometri.Quindi, diluire le particelle fluorescenti arcobaleno aggiungendo una goccia in un millilitro di acqua doppia distillata a una concentrazione finale di una volta 10 alla sesta perla per millilitro. Aprire lo sportello della camera di campionamento e caricare un tubo di particelle fluorescenti arcobaleno preparate. Premere il pulsante di avvio del campione e regolare i micrometri su e giù per ottimizzare l'intensità della fluorescenza, rendendo ogni segnale il più intenso possibile.Premere il pulsante Start Quality Control o QC sul pannello di controllo touchscreen per eseguire automaticamente il controllo qualità. Quindi premere il pulsante di inizializzazione IntelliSort. Lo strumento regola automaticamente la frequenza e l'ampiezza dell'oscillazione delle goccioline per ottenere il ritardo di caduta di circa 25 ed essere in grado di visualizzare chiaramente il punto di interruzione della goccia.Quindi, premere il pulsante di ritardo di rilascio e il pulsante di manutenzione. Selezionate tubo come tipo di output di ordinamento. Posizionare un portatubo da 15 millilitri nella camera di smistamento.Accendere la tensione della piastra e impostare la tensione della piastra su circa 4.000 volt. Quindi, attiva il modello di test selezionando il pulsante di impostazione del flusso. Regolare il cursore della fase di carica e il cursore di deflessione per assicurarsi che l'immagine del flusso sia in linea con il tubo di raccolta.Quindi selezionare il pulsante con il segno di spunta. Accedere alla workstation Summit sul computer. Creare un nuovo protocollo dal menu principale del file.Quindi creare un dot plot selezionando la scheda istogramma nel pannello di controllo Summit Software. Scegliete Dispersione diretta come parametro dell'asse X e Dispersione laterale come parametro dell'asse y. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'asse del nuovo grafico a punti nel workspace e presentare la dispersione diretta e la dispersione laterale nella forma logaritmica.Selezionare la scheda di acquisizione e individuare il pannello dei parametri di acquisizione. Abilita tutti i segnali nel sottomenu dei parametri di abilitazione. Scegliete la dispersione diretta come parametro di attivazione e impostate la soglia di 0,01.Regolare la tensione e il guadagno dello scatter in avanti e dello scatter laterale a 250 e 0,6 per garantire che gli eventi all'interno del grafico a dispersione diretta rispetto al grafico a dispersione laterale e le popolazioni siano separati. Diluire le microsfere fluorescenti in polistirene in sospensioni da 100, 200 e 300 nanometri aggiungendo un microlitro di microsfere a un millilitro di acqua bidistillata. Quindi caricare successivamente la sospensione della microsfera.Selezionare Start nel menu di acquisizione di Summit Software per registrare 20.000 eventi, quindi fare clic su Stop dopo aver registrato gli eventi. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico a punti a dispersione in avanti rispetto al grafico a dispersione laterale per creare rettangoli e trascinare per ridimensionare. Riposizionare le regioni di rumore elettronico e la popolazione di microsfere a 100 nanometri facendo clic con il pulsante destro del mouse sulle regioni per rinominarle rispettivamente come R7 e R4.Ripetere i passaggi per inquadrare le microsfere da 200 e 300 nanometri con rettangoli successivamente e rinominarle rispettivamente come R5 e R6. Infine, determinare la regione di ordinamento da 50 a 200 nanometri in base al rumore elettronico e alla posizione delle particelle di 200 nanometri per definirla come R8. Modificare le decisioni di ordinamento nel pannello Logica di ordinamento e statistiche facendo doppio clic sul campo vuoto del flusso sinistro o L1 e selezionando la regione denominata R8 per creare la logica di ordinamento. Scegliete la modalità di interruzione della purezza e selezionate un inviluppo di gocce sopra una goccia per il flusso L1.Caricare un campione da 500 microlitri di vescicole extracellulari precedentemente preparate o miscela EV. Premere il pulsante Start sotto il menu di acquisizione in Summit per acquisire i dati, quindi fare clic su Stop. Quindi, premere Start nel menu di ordinamento per raccogliere da 50 a 200 piccole vescicole extracellulari di dimensioni nanometriche o sEV in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.L'analisi della citometria a flusso di microsfere di polistirene di dimensioni standard per localizzare l'intervallo di dimensioni da 50 a 200 nanometri nel grafico a dispersione diretta rispetto al grafico a dispersione laterale ha rivelato segnali di particelle distinguibili. R4, R5 e R6 si riferiscono rispettivamente alle posizioni di particelle da 100, 200 e 300 nanometri. R7 è il rumore elettronico come limite di rilevamento per particelle a 50 nanometri e R8 rappresenta l'intervallo di posizione da 50 a 200 nanometri.La distribuzione delle dimensioni delle particelle della miscela EV derivata da cellule pancreatiche mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle, o NTA, era nell'ampio intervallo da 40 a 400 nanometri dopo l'ultracentrifugazione. La selezione citometrica a flusso è stata eseguita per isolare e purificare il sEV da 50 a 200 nanometri all'interno della regione R8. La qualità dell'isolamento è stata verificata da NTA e si è scoperto che l'intervallo di dimensioni delle particelle di sEV dopo la selezione era compreso tra 50 e 200 nanometri.La presenza di sEV è stata ulteriormente osservata da TEM e i sEV isolati sono stati confermati contenere marcatori di CD6, CD63 e CD81 mediante Western Blot Analysis. Questo metodo consente la separazione di piccole vescicole extracellulari e la classificazione o l'analisi temporanea dell'espressione genica di piccole vescicole extracellulari, aprendo numerose applicazioni di ricerca a valle.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Ricerca

Biochimica

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Un sistema di purificazione delle proteine ad alta produttività economico e versatile che utilizza un adattatore a piastre multi-colonna

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Screening ad alta produttività per ottenere colpi cristallini per la cristallografia proteica

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identificazione di peptidi di piccole vescicole extracellulari da macrofagi derivati dal midollo osseo

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...