Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av det vitenskapelige forskningsfondet ved Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), det grunnleggende offentlige velferdsforskningsprosjektet i Zhejiang-provinsen (LGF19H150006, LTGY23B070001), prosjektet til Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) og prosjektet for eksperimentell teknologi ved Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).

1. Cellekultur
<ol><li>Forbered et dyrkningsmedium av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS). Dyrkning av humane kreftceller i bukspyttkjertelen, PANC-1, i en 75 cm2 kulturkolbe med en tetthet på 1 x 106 celler/ml. Inkuber kulturen ved 37 °C med 5 % CO2.</li>
	<li>Subkultur cellene når celletettheten når 75% -80% under mikroskopisk observasjon. Fjern mediet, og skyll 2x med 3-5 ml fosfatbuffer saltvann (PBS; 0,01 M, pH 7,...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content.">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).</li><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

Denne protokollen skisserer en optimalisert metode for å isolere og rense sEV med den spesifiserte partikkelstørrelsen på 50-200 nm ved hjelp av en flytcellesorterer, som ble validert av NTA. Metoden løste flaskehalsproblemet med å oppnå sEV med jevn partikkelstørrelse og høy renhet, og unngikk interferens fra ikke-relaterte biologiske molekyler pakket inn i store elbiler22. Raske analyser med høy gjennomstrømning er mulig med flowcytometri, som kan fange 100 000 partikler per sekund og ...

En celle frigjør ekstracellulære vesikler (EV) av varierende størrelser som resulterer i signalmolekyler og membraninneslutninger, som er viktige for intercellulær kommunikasjon1. Elbiler av forskjellige størrelser spiller også forskjellige biologiske roller, med 50-200 nm sEV som nøyaktig kan distribuere RNA, DNA og proteiner til riktig ekstracellulær plassering. sEV hjelper også med å bestemme sekresjonsmekanismene deres, og involverer ikke bare regulering av normale fysiologiske prosesser som immunovervåking, vedlikehold av stamceller, blodkoagulasjon og vevsreparasjon, men også patologien som ligger til grunn for flere sykdommer som tumorprogresjon og metastase 2,3. Effektiv isolering og analyse av sEV er avgjørende for å identifisere biomarkører og designe fremtidige legemiddelintervensjoner.
Med kontinuerlig forskning på den kliniske anvendelsen av sEV, har isolasjonsmetodene til sEV stilt høyere krav. På grunn av heterogeniteten til sEV i størrelse, kilde og innhold, samt deres likhet med andre elbiler i fysisk-kjemiske og biokjemiske egenskaper, er det ingen standardmetode for sEV-isolasjon 4,5. For tiden er ultrasentrifugering, størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), polymerutfelling og immunaffinitetsfangst de vanligste sEV-isolasjonsmetodene6. Ultrasentrifugering er fortsatt gullstandarden for sEV-isolasjon i forskning, til tross for at det er tidkrevende, noe som resulterer i lav renhet med en bred størrelsesfordeling på 40-500 nm og betydelig mekanisk skade på sEV etter langvarig sentrifugering 7,8,9. Polymerutfelling, som vanligvis bruker polyetylenglykol (PEG), lider av uakseptabel renhet for etterfølgende funksjonell analyse med samtidig utfelling av ekstracellulære proteinaggregater og polymerforurensning10,11. Fangstbaserte metoder for immunaffinitet krever kostbare antistoffer med varierende spesifisitet, samt har problemer med lavt prosesseringsvolum og gir12,13,14. Partikkelstørrelse er en av hovedindikatorene for å evaluere renheten til isolert sEV. Selv om sEV-renhet fortsatt er et uoppnåelig mål, fjerner SEC en betydelig mengde mediumkomponenter, og sEV-partiklene ekstrahert ved SEC-metoden ligger hovedsakelig i området 50-200 nm15. De eksisterende teknikkene har noen ulemper, inkludert men ikke begrenset til å være tidkrevende, lav renhet, lavt utbytte, dårlig reproduserbarhet, lav gjennomstrømning av prøver og potensiell skade på sEV, noe som gjør den uforenlig med klinisk bruk16. Dermed er en rask, billig og størrelsesspesifisert sEV-isolasjonsmetode som gjelder for forskjellige biofluider et viktig behov i flere forsknings- og kliniske situasjoner.
I flowcytometri analyseres enkeltpartikler på en multiparametrisk måte med høy gjennomstrømning, og delmengder sorteres ut17. På grunn av heterogeniteten til elbiler, ville en cytometrisk måling av enkeltpartikkelstrøm være ideell, som har blitt brukt til å undersøke elbiler etter paradigmene for celleanalyse, med lysspredning og fluorescensetiketter som brukes til å identifisere fysiologiske egenskaper og proteinkomponenter18,19,20. Likevel utfordres konvensjonell flowcytometri av den lille størrelsen på sEV og lav overflod av overflatebiomarkører. Sensitiviteten til flowcytometri kan forbedres ved å optimalisere deteksjonsparametere for å skille bakgrunnsstøy og sEV uavhengig av bruk av fremoverspredning (FSC), sidespredning (SSC) eller fluorescensgrenseutløsende parameter19.
Med den nåværende protokollen ble høyoppløselige flowcytometriske sorteringsinnstillinger optimalisert ved bruk av fluorescerende perler som standard. Ved å velge riktig dysestørrelse, kappevæsketrykk, terskelutløsende parameter og spenninger som kontrollerer spredte lysintensiteter, var vi i stand til å isolere en spesifikk delmengde av sEV fra en kompleks blanding.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

Små ekstracellulære vesikler (sEV) kan frigjøres fra alle celletyper og bære protein, DNA og RNA. Signalmolekyler tjener som indikatorer på en celles fysiologiske og patologiske tilstand. Imidlertid er det ingen standardmetode for sEV-isolasjon, som forhindrer nedstrøms biomarkøridentifikasjon og legemiddelintervensjonsstudier. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for isolering og rensing av 50-200 nm sEV av en flytcellesorterer. For dette ble en 50 μm dyse og 80 psi hylstervæsketrykk valgt for å oppnå en god sorteringshastighet og stabil sidestrøm. Standard størrelse polystyren mikrosfærer ble brukt til å lokalisere populasjoner av 100, 200 og 300 nm partikler. Med ytterligere optimalisering av utløserterskelen for spenning, forsterkning og fremoverspredning (FSC), kan sEV-signalet skilles fra bakgrunnsstøyen. Disse optimaliseringene gir et panel med kritiske sorteringsinnstillinger som gjør det mulig å få en representativ populasjon av sEV bare ved hjelp av FSC vs. sidespredning (SSC). Den flowcytometribaserte isolasjonsmetoden tillater ikke bare analyse med høy gjennomstrømning, men tillater også synkron klassifisering eller proteomanalyse av sEV basert på biomarkøruttrykket, noe som åpner mange nedstrøms forskningsapplikasjoner.

Flytskjemadiagrammet for den eksperimentelle protokollen er vist i figur 1. I denne metoden ble polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse brukt som referansestandarder for partikkelstørrelsesfordeling. Under den spesifikke instrumentelle parameterbetingelsen kunne partikkelsignalet tydelig skilles fra bakgrunnsstøyen i FSC vs. SSC-plottet ved hjelp av den logaritmiske formen. Gating strategier er vist i figur 2. R4, R5 og R6 refererer til posisjonene til hen...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Denne protokollen gir en rask og størrelsesspesifikk isolasjonsmetode for små ekstracellulære vesikler ved å optimalisere størrelsen på luftspraydysen, kappevæsketrykk, prøvestrømningstrykk, spenning, forsterkning og utløsende terskelparametere.

Optimalisering av flowcytometriske sorteringsparametere for høykapasitetsisolering og rensing av små ekstracellulære vesikler

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Denne protokollen gir en rask og størrelsesspesifikk løsningsmetode for små ekstracellulære vesikler ved å optimalisere sorteringsparametere for flowcytometri. Disse optimaliseringene gir et panel med kritiske sorteringsinnstillinger som gjør det mulig å oppnå representative populasjoner av små ekstracellulære vesikler ved bare å bruke foroverspredning mot størrelsesspredning. Begynn med å utføre standard oppstartsprosedyre for flytcellesorteringen.Slå på maskinen ved å trykke på oppstartsknappen, og klikk deretter på laserstrømknappen på laserkontrollpanelet. Trykk på endringstankknappen på Smart Sampler-undermenyen for å sette fluidikken under trykk. Bruk en ultrasonisk rengjort 50 mikrometer stråle og luftdyse og installer den ned til dyseenheten.Juster trykket til 80 SI for hylstervæske og 80,3 SI for prøvestrøm på trykkkonsollen. Trykk på startknappen for kappeflyt for å starte kappestrømmen som strømmer. Klikk bobleknappen på undermenyen Smart Sampler for å deboble automatisk i 10 minutter og deretter slå den av.For å justere strømmen og bestemme laserpunktet, slå på lyset i belysningskammeret for å se strømmen over knappenålshullene. Juster opp og ned, venstre og høyre, og foran og bak mikrometer for å sentrere strømmen på pinhole og fokusere strømmen. Åpne alle laserskodder, velg kategorien laser og strømavskjæring, og trykk deretter på den grønne pilknappen kontinuerlig når du blir bedt om å fullføre kalibreringsprosessen for laserskjæring og dysejustering.Få tilgang til den fine laserjusteringsskjermen. Velg 640 nanometer laser og 772 bar 44 bandpass kanal som x-akse parameter og 405 nanometer laser og 448 bar 59 bandpass kanal som y-akse parameter. Trykk på utløserparametervelgeren og velg fremoverspredningsparameteren til 488-nanometerlaseren.Deretter fortynnes regnbuefluorescerende partikler ved å tilsette en dråpe i en milliliter dobbeltdestillert vann til en endelig konsentrasjon på en gang 10 til den sjette perler per milliliter. Åpne prøvekammerdøren og legg i et rør med tilberedte regnbuefluorescerende partikler. Trykk på startprøveknappen og juster opp og ned mikrometer for å optimalisere fluorescensintensiteten, noe som gjør hvert signal så intenst som mulig.Trykk på start kvalitetskontroll eller QC-knappen på berøringsskjermens kontrollpanel for å utføre QC automatisk. Trykk deretter på IntelliSort-initialiseringsknappen. Instrumentet justerer automatisk frekvensen og amplituden til dråpeoscillasjonen for å oppnå fallforsinkelsen på ca. 25 og være i stand til å visualisere dråpens bruddpunkt tydelig.Deretter trykker du på slippforsinkelsesknappen og vedlikeholdsknappen. Velg rør som sorteringsutdatatype. Plasser en 15 milliliter rørholder i sorteringskammeret.Slå på platespenningen og sett platespenningen til ca. 4.000 volt. Deretter slår du på testmønsteret ved å velge strømoppsett-knappen. Juster glidebryteren for ladefase og avbøyning for å sikre at bildet av strømmen er på linje med oppsamlingsrøret.Velg deretter hakeknappen. Logg på Summit-arbeidsstasjonen på datamaskinen. Opprett en ny protokoll fra filhovedmenyen.Deretter oppretter du et punktdiagram ved å velge histogramfanen i kontrollpanelet til Summit Software. Velg fremoverpunkt som x-akseparameter og sidepunkt som y-akseparameter. Høyreklikk deretter på aksen til det nye punktplottet i arbeidsområdet og presenter fremoverspredningen og sidespredningen i den logaritmiske formen.Velg anskaffelsesfanen, og finn panelet for anskaffelsesparametere. Aktiver alle signaler i undermenyen for å aktivere parametere. Velg fremoverspredning som utløserparameter og angi terskelen på 0,01.Juster spenningen og forsterkningen for fremoverspredning og sidespredning ved 250 og 0,6 for å sikre at hendelser innenfor sprednings- og sidespredningsplottet fremover og populasjoner er atskilt. Fortynn fluorescerende polystyrenmikrosfærer i 100, 200 og 300 nanometer suspensjoner ved å tilsette en mikroliter mikrosfærer til en milliliter dobbeltdestillert vann. Fyll deretter mikrosfærefjæringen suksessivt.Velg Start under anskaffelsesmenyen i Summit Software for å registrere 20 000 hendelser, og klikk deretter på Stopp etter at hendelsene er registrert. Høyreklikk på plottet for punktpunktet fremover kontra sidespredning for å lage rektangler og dra for å endre størrelse. Flytt regionene med elektronisk støy og 100 nanometer mikrosfærepopulasjon ved å høyreklikke på regionene for å gi dem nytt navn til henholdsvis R7 og R4.Gjenta trinnene for å ramme inn 200 og 300 nanometer mikrosfærer med rektangler suksessivt, og gi dem nytt navn til henholdsvis R5 og R6. Til slutt bestemmer du sorteringsområdet på 50 til 200 nanometer basert på elektronisk støy og posisjonen til 200 nanometer partikler for å definere den som R8. Rediger sorteringsbeslutninger i panelet for sorteringslogikk og statistikk ved å dobbeltklikke på det tomme feltet i den venstre eller L1-strømmen og velge området kalt R8 for å opprette sorteringslogikken. Velg avbruddsmodus for renhet og velg en dråpekonvolutt over en dråpe for L1-strømmen.Last inn 500 mikroliter prøve av tidligere tilberedte ekstracellulære vesikler eller EV-blanding. Trykk på Start-knappen under anskaffelsesmenyen i Summit for å hente dataene, og klikk deretter på Stopp. Deretter trykker du Start i sorteringsmenyen for å samle 50 til 200 nanometer størrelse små ekstracellulære vesikler eller sEV i et 15 milliliter sentrifugerør.Flowcytometrianalyse av polystyrenmikrosfærer i standardstørrelse for å lokalisere størrelsesområdet 50 til 200 nanometer i fremoverspredning versus sidespredningsplottet avslørte gjenkjennelige partikkelsignaler. R4, R5 og R6 refererer til posisjonene til henholdsvis 100, 200 og 300 nanometer partikler. R7 er den elektroniske støyen som deteksjonsgrensen for 50 nanometerpartikler og R8 representerer posisjonsområdet på 50 til 200 nanometerpartikler.Partikkelstørrelsesfordelingen av EV-blandingen avledet fra bukspyttkjertelen en celler ved nanopartikkelsporingsanalyse, eller NTA, var i det brede området 40 til 400 nanometer etter ultrasentrifugering. Flowcytometrisk sortering ble utført for å isolere og rense 50 til 200 nanometer sEV i R8-regionen. Kvaliteten på isolasjonen ble verifisert av NTA, og det ble funnet at partikkelstørrelsesområdet for sEV etter sortering var mellom 50 og 200 nanometer.Tilstedeværelsen av sEV ble videre observert av TEM, og de isolerte sEV-ene ble bekreftet å inneholde markører for CD6, CD63 og CD81 ved Western Blot-analyse. Denne metoden tillater separasjon av små ekstracellulære vesikler og klassifisering eller pro tem-analyse av små ekstracellulære vesikler, genuttrykk, noe som åpner for mange nedstrøms forskningsapplikasjoner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering av tissue ekstracellulære blemmer fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging av ekstracellulære blemmer av Atomic Force mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Et økonomisk og allsidig proteinrensesystem med høy gjennomstrømning ved hjelp av en adapter med flere kolonner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Høy gjennomstrømningsscreening for å oppnå krystalltreff for proteinkrystallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identifisering av peptider av små ekstracellulære vesikler fra benmargsavledede makrofager

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...