Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa Científica da Universidade de Medicina Chinesa de Zhejiang (2020ZG29), pelo Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público Básico da Província de Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), pelo Projeto do Departamento de Educação da Província de Zhejiang (Y202147028) e pelo Projeto de Tecnologia Experimental do Departamento de Laboratório da Universidade de Zhejiang (SJS201712, SYB202130).

1. Cultura celular
<ol><li>Preparar um meio de cultura de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Cultura de célula humana de câncer de pâncreas, PANC-1, em frasco de 75cm2 a uma densidade de 1 x 106 células/mL. Incubar a cultura a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Subcultivar as células quando a densidade celular atingir 75%-80% sob observação microscópica. Retire o meio e lave 2x com 3-5 mL de solução salina tam...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. 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D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

Este protocolo descreve um método otimizado para isolar e purificar sEV com o tamanho de partícula especificado de 50-200 nm usando um classificador de células de fluxo, que foi validado por NTA. O método resolveu o problema do gargalo de obtenção de sEV com granulometria uniforme e alta pureza, evitando a interferência de moléculas biológicas não relacionadas envoltas em EVs de grande porte22. Análises rápidas e de alto rendimento são possíveis com a citometria de fluxo, que pode ca...

Uma célula libera vesículas extracelulares (EVs) de tamanhos variados que resultam em moléculas sinalizadoras e inclusões de membrana, que são importantes para a comunicação intercelular1. EVs de diferentes tamanhos também desempenham diferentes papéis biológicos, com 50-200 nm sEV sendo capaz de distribuir precisamente RNA, DNA e proteínas para o local extracelular correto. A EV também ajuda a determinar seus mecanismos de secreção, envolvendo não apenas a regulação de processos fisiológicos normais, como vigilância imunológica, manutenção de células-tronco, coagulação sanguínea e reparo tecidual, mas também a patologia subjacente a várias doenças, como progressão tumoral e metástase2,3. O isolamento e a análise eficazes de sEV são críticos para identificar biomarcadores e projetar futuras intervenções medicamentosas.
Com pesquisas contínuas sobre a aplicação clínica de sEV, os métodos de isolamento de sEV apresentaram requisitos mais elevados. Devido à heterogeneidade dos EVs em tamanho, fonte e conteúdo, bem como sua semelhança com outros EVs em propriedades físico-químicas e bioquímicas, não existe um método padrão para o isolamento de EVs 4,5. Atualmente, ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), precipitação de polímero e captura de imunoafinidade são os métodos mais comuns de isolamento de sEV6. A ultracentrifugação ainda é o padrão ouro para o isolamento de sEV em pesquisas, apesar de ser demorada, resultando em baixa pureza com uma ampla distribuição de tamanho de 40-500 nm e danos mecânicos significativos ao sEV após centrifugação de longa duração 7,8,9. A precipitação polimérica, que geralmente utiliza polietilenoglicol (PEG), sofre de pureza inaceitável para posterior análise funcional com precipitação concomitante de agregados proteicos extracelulares e contaminação do polímero10,11. Métodos baseados em captura de imunoafinidade requerem anticorpos de alto custo com especificidade variável, além de apresentarem problemas com baixo volume de processamento e rendimento12,13,14. O tamanho das partículas é um dos principais indicadores para avaliar a pureza do sEV isolado. Embora a pureza do sEV continue sendo uma meta inatingível, o SEC remove uma quantidade considerável de componentes médios, e as partículas de sEV extraídas pelo método SEC estão principalmente na faixa de 50-200 nm15. As técnicas existentes apresentam algumas desvantagens, incluindo, mas não se limitando a, serem demoradas, de baixa pureza, baixo rendimento, baixa reprodutibilidade, baixo rendimento das amostras e dano potencial de sEV, o que a torna incompatível com o uso clínico16. Assim, um método de isolamento de sEV rápido, barato e com tamanho especificado aplicável a diversos biofluidos é uma necessidade essencial em várias situações clínicas e de pesquisa.
Na citometria de fluxo, partículas isoladas são analisadas de forma multiparamétrica de alto rendimento e os subconjuntos são separados17. Devido à heterogeneidade dos EVs, seria ideal uma medida por citometria de fluxo de partícula única, que tem sido utilizada para investigar EVs seguindo os paradigmas da análise celular, sendo utilizados marcadores de dispersão de luz e fluorescência para identificar características relacionadas à fisiologia e componentes proteicos18,19,20. No entanto, a citometria de fluxo convencional é desafiada pelo pequeno tamanho do sEV e baixa abundância de biomarcadores de superfície. A sensibilidade da citometria de fluxo pode ser melhorada otimizando-se os parâmetros de detecção para distinguir ruído de fundo e sEV, independentemente do uso do parâmetro de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) ou limiar de fluorescência19.
Com o presente protocolo, os ajustes de classificação por citometria de fluxo de alta resolução foram otimizados usando esferas fluorescentes como padrão. Ao selecionar o tamanho adequado do bico, a pressão do fluido da bainha, o parâmetro de disparo do limiar e as tensões que controlam as intensidades de luz espalhada, conseguimos isolar um subconjunto específico de sEV de uma mistura complexa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

Pequenas vesículas extracelulares (sEV) podem ser liberadas de todos os tipos celulares e transportar proteínas, DNA e RNA. As moléculas sinalizadoras servem como indicadores do estado fisiológico e patológico de uma célula. No entanto, não há um método padrão para o isolamento de sEV, o que impede a identificação de biomarcadores a jusante e estudos de intervenção medicamentosa. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento e purificação de sEV de 50-200 nm por um classificador de células de fluxo. Para isso, um bocal de 50 μm e uma pressão de fluido de bainha de 80 psi foram selecionados para obter uma boa taxa de classificação e fluxo lateral estável. Microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas para localizar populações de partículas de 100, 200 e 300 nm. Com a otimização adicional do limiar de disparo de tensão, ganho e dispersão direta (FSC), o sinal sEV pode ser separado do ruído de fundo. Essas otimizações fornecem um painel de configurações de classificação crítica que permite obter uma população representativa de sEV usando FSC vs. dispersão lateral (SSC) somente. O método de isolamento baseado em citometria de fluxo não só permite a análise de alto rendimento, mas também permite a classificação síncrona ou análise de proteoma de sEV com base na expressão de biomarcadores, abrindo inúmeras aplicações de pesquisa a jusante.

O fluxograma do protocolo experimental é mostrado na Figura 1. Neste método, microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas como padrões de referência para distribuição de tamanho de partículas. Sob a condição de parâmetro instrumental específico, o sinal de partícula pode ser claramente distinguido do ruído de fundo no gráfico FSC vs. SSC usando a forma logarítmica. As estratégias de gating são mostradas na Figura 2. R4, R5 e R6 r...

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Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Este protocolo fornece um método de isolamento rápido e específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando o tamanho do bico de pulverização de ar, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra, a tensão, o ganho e os parâmetros do limiar de disparo.

Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Este protocolo fornece um método de solução rápida e de tamanho específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando os parâmetros de classificação por citometria de fluxo. Essas otimizações fornecem um painel de configurações de classificação crítica que permite obter populações representativas de pequenas vesículas extracelulares usando apenas dispersão direta versus dispersão de tamanho. Comece executando o procedimento de inicialização padrão do classificador de células de fluxo.Ligue a máquina pressionando o botão de inicialização e clique no botão liga/desliga do laser no painel de controle do laser. Pressione o botão de troca de tanques no submenu Smart Sampler para pressurizar os fluidos. Use um jato e um bico de ar de 50 micrômetros limpos ultrassonicamente e instale-o até o conjunto do bico.Ajuste a pressão para 80 SI para o fluido da bainha e 80,3 SI para o fluxo da amostra no console de pressão. Pressione o botão de fluxo da bainha inicial para iniciar o fluxo da bainha. Clique no botão de bolha no submenu Smart Sampler para desborbulhar automaticamente por 10 minutos e, em seguida, desativá-lo.Para alinhar o fluxo e determinar o ponto laser, ligue a luz da câmara de iluminação para visualizar o fluxo sobre os orifícios. Ajuste os micrômetros para cima e para baixo, esquerdo e direito, e dianteiro e traseiro para centralizar o fluxo no orifício e focalizar o fluxo. Abra todos os obturadores a laser, selecione a guia de interceptação de laser e fluxo e, em seguida, pressione o botão de seta verde continuamente conforme solicitado para concluir o processo de calibração de interceptação a laser e alinhamento do bico.Acesse a tela de alinhamento a laser fino. Selecione o laser de 640 nanômetros e o canal passa-banda 772 bar 44 como parâmetro do eixo x e o laser de 405 nanômetros e o canal passa-banda de 448 bar 59 como parâmetro do eixo y. Pressione o seletor de parâmetros de gatilho e escolha o parâmetro de dispersão direta do laser de 488 nanômetros.Em seguida, dilua as partículas fluorescentes do arco-íris adicionando uma gota em um mililitro de água destilada dupla para uma concentração final de uma vez 10 até o sexto grânulo por mililitro. Abra a porta da câmara de amostra e carregue um tubo de partículas fluorescentes do arco-íris preparadas. Pressione o botão de início da amostra e ajuste os micrômetros para cima e para baixo para otimizar a intensidade da fluorescência, tornando cada sinal o mais intenso possível.Pressione o botão Start Quality Control ou QC no painel de controle touchscreen para executar o QC automaticamente. Em seguida, pressione o botão de inicialização IntelliSort. O instrumento ajusta automaticamente a frequência e a amplitude de oscilação da gota para obter o atraso da queda de aproximadamente 25 e ser capaz de visualizar o ponto de ruptura da queda claramente.Em seguida, pressione o botão drop delay e o botão manter. Selecione tubo como o tipo de saída de classificação. Coloque um suporte de tubo de 15 mililitros na câmara de classificação.Ligue a tensão da placa e ajuste a tensão da placa para aproximadamente 4.000 volts. Em seguida, ative o padrão de teste selecionando o botão de configuração de fluxo. Ajuste o controle deslizante da fase de carga e o controle deslizante de deflexão para garantir que a imagem do fluxo esteja alinhada com o tubo de coleta.Em seguida, selecione o botão de marca de seleção. Faça login na estação de trabalho do Summit no computador. Crie um novo protocolo no menu principal do arquivo.Em seguida, crie um gráfico de pontos selecionando a guia histograma no painel de controle do Summit Software. Escolha a dispersão para frente como o parâmetro do eixo x e a dispersão lateral como o parâmetro do eixo y. Em seguida, clique com o botão direito do mouse no eixo do novo gráfico de pontos na área de trabalho e apresente a dispersão direta e lateral na forma logarítmica.Selecione a guia de aquisição e localize o painel de parâmetros de aquisição. Habilite todos os sinais no submenu de parâmetros de ativação. Escolha a dispersão direta como o parâmetro de gatilho e defina o limite de 0,01.Ajuste a tensão e o ganho de dispersão direta e dispersão lateral em 250 e 0,6 para garantir que os eventos dentro do gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral e as populações sejam separados. Diluir as microesferas de poliestireno fluorescente em suspensões de 100, 200 e 300 nanômetros adicionando um microlitro de microesferas a um mililitro de água destilada dupla. Em seguida, carregue a suspensão da microesfera sucessivamente.Selecione Iniciar no menu de aquisição do Summit Software para gravar 20.000 eventos e clique em Parar após gravar os eventos. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos de dispersão frontal versus dispersão lateral para criar retângulos e arraste para redimensionar. Reposicione as regiões de ruído eletrônico e população de microesferas de 100 nanômetros clicando com o botão direito do mouse nas regiões para renomeá-las como R7 e R4, respectivamente.Repita os passos para enquadrar as microesferas de 200 e 300 nanômetros com retângulos sucessivamente e renomeie-as como R5 e R6, respectivamente. Finalmente, determine a região de classificação de 50 a 200 nanômetros com base no ruído eletrônico e na posição das partículas de 200 nanômetros para defini-la como R8. Edite as decisões de classificação no painel de lógica de classificação e estatísticas clicando duas vezes no campo em branco do fluxo esquerdo ou L1 e selecionando a região chamada R8 para criar a lógica de classificação. Escolha o modo de interrupção de pureza e selecione um envelope de gota acima de uma gota para o fluxo L1.Carregar amostra de 500 microlitros de vesículas extracelulares previamente preparadas ou mistura de EVs. Pressione o botão Iniciar no menu de aquisição no Summit para adquirir os dados e clique em Parar. Em seguida, pressione Iniciar no menu de classificação para coletar pequenas vesículas extracelulares de 50 a 200 nanômetros ou sEV em um tubo centrífugo de 15 mililitros.A análise por citometria de fluxo de microesferas de poliestireno de tamanho padrão para localizar a faixa de tamanho de 50 a 200 nanômetros no gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral revelou sinais de partículas distinguíveis. R4, R5 e R6 referem-se às posições de partículas de 100, 200 e 300 nanômetros, respectivamente. R7 é o ruído eletrônico como limite de detecção para partículas de 50 nanômetros e R8 representa a faixa de posição de partículas de 50 a 200 nanômetros.A distribuição granulométrica da mistura de EVs derivada de células pancreáticas por nanopartículas, ou NTA, estava na ampla faixa de 40 a 400 nanômetros após ultracentrifugação. A classificação por citometria de fluxo foi realizada para isolar e purificar o sEV de 50 a 200 nanômetros dentro da região R8. A qualidade do isolamento foi verificada por NTA e verificou-se que a faixa de tamanho de partícula de sEV após a classificação estava entre 50 e 200 nanômetros.A presença de sEV foi ainda observada por TEM e os sEVs isolados foram confirmados como contendo marcadores de CD6, CD63 e CD81 pela Análise de Western Blot. Este método permite a separação de pequenas vesículas extracelulares e a classificação ou análise da expressão genética de pequenas vesículas extracelulares, abrindo inúmeras aplicações de investigação a jusante.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Um sistema econômico e versátil de purificação de proteínas de alto rendimento usando um adaptador de placa de várias colunas

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Triagem de alto rendimento para obter hits de cristal para cristalografia de proteínas

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identificação de Peptídeos de Pequenas Vesículas Extracelulares de Macrófagos Derivados da Medula Óssea

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...