Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Scientific Research Fund of Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), Basic Public Welfare Research Project of Zhejiang Province (LGF19H150006, LTGY23B070001), Project of Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) och Project of Experimental Technology of Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).

1. Cellodling
<ol><li>Förbered ett odlingsmedium av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Odla den humana bukspottkörtelcancercellen, PANC-1, i en 75 cm2 odlingskolv med en densitet av 1 x 106 celler/ml. Inkubera kulturen vid 37 °C med 5 %CO2.</li>
	<li>Subkultur cellerna när celldensiteten når 75% -80% under mikroskopisk observation. Ta bort mediet och skölj 2x med 3-5 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS; 0,01 M, pH...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content.">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).</li><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att isolera och rena sEV med den angivna partikelstorleken 50-200 nm med hjälp av en flödescellsorterare, som validerades av NTA. Metoden löste flaskhalsproblemet med att erhålla sEV med enhetlig partikelstorlek och hög renhet, vilket undviker störningar från obesläktade biologiska molekyler inslagna i stora EV22. Snabba analyser med hög genomströmning är möjliga med flödescytometri, som kan fånga 100 000 partiklar per sekund och fatt...

En cell släpper ut extracellulära vesiklar (EV) av varierande storlek som resulterar i signalmolekyler och membraninneslutningar, vilket är viktigt för intercellulär kommunikation1. EV i olika storlekar spelar också olika biologiska roller, med 50-200 nm sEV som exakt kan distribuera RNA, DNA och proteiner till rätt extracellulär plats. EV hjälper också till att bestämma deras utsöndringsmekanismer, som inte bara involverar reglering av normala fysiologiska processer som immunövervakning, stamcellsunderhåll, blodkoagulation och vävnadsreparation utan också patologin bakom flera sjukdomar som tumörprogression och metastasering 2,3. Effektiv isolering och analys av sEV är avgörande för att identifiera biomarkörer och utforma framtida läkemedelsinterventioner.
Med kontinuerlig forskning om den kliniska tillämpningen av sEV har isoleringsmetoderna för sEV ställt högre krav. På grund av heterogeniteten hos sEV i storlek, källa och innehåll, liksom deras likhet med andra EV i fysikalisk-kemiska och biokemiska egenskaper, finns det ingen standardmetod för sEV-isolering 4,5. För närvarande är ultracentrifugering, storleksuteslutningskromatografi (SEC), polymerutfällning och immunoaffinitetsinfångning de vanligaste sEV-isoleringsmetoderna6. Ultracentrifugering är fortfarande guldstandarden för sEV-isolering inom forskning, trots att den är tidskrävande, vilket resulterar i låg renhet med en bred storleksfördelning på 40-500 nm och betydande mekaniska skador på sEV efter långvarig centrifugering 7,8,9. Polymerutfällning, som vanligtvis använder polyetylenglykol (PEG), lider av oacceptabel renhet för efterföljande funktionell analys med samtidig utfällning av extracellulära proteinaggregat och polymerkontaminering10,11. Immunoaffinitetsinfångningsbaserade metoder kräver högkostnadsantikroppar med varierande specificitet, samt har problem med låg bearbetningsvolym och ger12,13,14. Partikelstorlek är en av huvudindikatorerna för att utvärdera renheten hos isolerad sEV. Även om sEV-renhet fortfarande är ett ouppnåeligt mål, tar SEC bort en betydande mängd medelkomponenter, och sEV-partiklarna extraherade med SEC-metoden ligger huvudsakligen i intervallet 50-200 nm15. De befintliga teknikerna har några nackdelar, inklusive men inte begränsat till att vara tidskrävande, låg renhet, lågt utbyte, dålig reproducerbarhet, låg genomströmning av prover och potentiell skada på sEV, vilket gör den oförenlig med klinisk användning16. Således är en snabb, billig och storleksspecificerad sEV-isoleringsmetod som är tillämplig på olika biofluider ett väsentligt behov i flera forsknings- och kliniska situationer.
I flödescytometri analyseras enskilda partiklar på ett multiparametriskt sätt med hög genomströmning och delmängder sorteras ut17. På grund av EV: s heterogenitet skulle en cytometrisk mätning av partikelflöde vara idealisk, som har använts för att undersöka EV efter paradigmerna för cellanalys, med ljusspridnings- och fluorescensetiketter som används för att identifiera fysiologirelaterade egenskaper och proteinkomponenter18,19,20. Ändå utmanas konventionell flödescytometri av den lilla storleken på sEV och låg överflöd av ytbiomarkörer. Flödescytometrins känslighet kan förbättras genom att optimera detektionsparametrar för att skilja bakgrundsbrus och sEV oavsett om man använder framåtspridning (FSC), sidospridning (SSC) eller fluorescenströskel som utlöser parameter19.
Med det nuvarande protokollet optimerades högupplösta flödescytometriska sorteringsinställningar med fluorescerande pärlor som standard. Genom att välja rätt munstycksstorlek, mantelvätsketryck, tröskelutlösningsparameter och spänningar som styr spridda ljusintensiteter kunde vi isolera en specifik delmängd av sEV från en komplex blandning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

Små extracellulära vesiklar (sEV) kan frisättas från alla celltyper och bära protein, DNA och RNA. Signalmolekyler tjänar som indikatorer på cellens fysiologiska och patologiska tillstånd. Det finns dock ingen standardmetod för sEV-isolering, vilket förhindrar nedströms biomarköridentifiering och läkemedelsinterventionsstudier. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för isolering och rening av 50-200 nm sEV av en flödescellsorterare. För detta valdes ett 50 μm munstycke och 80 psi mantelvätsketryck för att få en bra sorteringshastighet och stabil sidoström. Standardstora polystyrenmikrosfärer användes för att lokalisera populationer av 100, 200 och 300 nm partiklar. Med ytterligare optimering av utlösningströskeln för spänning, förstärkning och framåtspridning (FSC) kan sEV-signalen separeras från bakgrundsbruset. Dessa optimeringar ger en panel med kritiska sorteringsinställningar som gör att man kan få en representativ population av sEV med endast FSC kontra sidospridning (SSC). Den flödescytometribaserade isoleringsmetoden möjliggör inte bara analys med hög genomströmning utan möjliggör också synkron klassificering eller proteomanalys av sEV baserat på biomarköruttrycket, vilket öppnar många forskningsapplikationer nedströms.

Flödesschemadiagrammet för experimentprotokollet visas i figur 1. I denna metod användes standardstora polystyrenmikrosfärer som referensstandarder för partikelstorleksfördelning. Under det specifika instrumentella parametervillkoret kunde partikelsignalen tydligt särskiljas från bakgrundsbruset i FSC vs. SSC-diagrammet med hjälp av den logaritmiska formen. Gating strategier visas i figur 2. R4, R5 och R6 hänvisar till positionerna för 100 nm, 200 nm ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Detta protokoll tillhandahåller en snabb och storleksspecifik isoleringsmetod för små extracellulära vesiklar genom att optimera storleken på luftsprutmunstycket, mantelvätsketrycket, provflödestrycket, spänningen, förstärkningen och utlösande tröskelparametrarna.

Optimering av flödescytometriska sorteringsparametrar för isolering med hög genomströmning och rening av små extracellulära vesiklar

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Detta protokoll ger en snabb och storleksspecifik lösningsmetod för små extracellulära vesiklar genom att optimera flödescytometrisorteringsparametrar. Dessa optimeringar ger en panel med kritiska sorteringsinställningar som gör det möjligt att få representativa populationer av små extracellulära vesiklar med endast spridning framåt mot storlek. Börja med att utföra standardstartproceduren för flödescellsorteraren.Slå på maskinen genom att trycka på startknappen och klicka sedan på laserströmbrytaren på laserkontrollpanelen. Tryck på knappen för att byta tankar på undermenyn Smart Sampler för att trycksätta fluidiken. Använd en ultraljudsrengjord 50 mikrometer stråle och luftmunstycke och installera den ner till munstycksenheten.Justera trycket till 80 SI för mantelvätska och 80,3 SI för provflöde på tryckkonsolen. Tryck på startmantelflödesknappen för att starta mantelströmmen. Klicka på bubbelknappen på undermenyn Smart sampler för att automatiskt debubbla i 10 minuter och stäng sedan av den.För att justera strömmen och bestämma laserfläcken, slå på belysningskammarens ljus för att se strömmen över pinhålen. Justera mikrometrarna upp och ner, vänster och höger samt fram och bak för att centrera strömmen på nålhålet och fokusera strömmen. Öppna alla laserslutare, välj fliken laser- och strömskärningspunkt och tryck sedan kontinuerligt på den gröna pilknappen när du uppmanas att slutföra kalibreringsprocessen för laserskärning och munstycksjustering.Gå till den fina laserjusteringsskärmen. Välj 640 nanometerlaser och 772 bar 44 bandpasskanal som x-axelparameter och 405 nanometerlaser och 448 bar 59 bandpasskanal som y-axelparameter. Tryck på triggerparameterväljaren och välj parametern framåt spridning för 488 nanometerlasern.Därefter späd regnbågens fluorescerande partiklar genom att tillsätta en droppe i en milliliter dubbeldestillerat vatten till en slutlig koncentration av en gånger 10 till sjätte pärlor per milliliter. Öppna provkammardörren och ladda ett rör med beredda regnbågsfluorescerande partiklar. Tryck på startprovknappen och justera upp och ner mikrometrar för att optimera fluorescensintensiteten, vilket gör varje signal så intensiv som möjligt.Tryck på startkvalitetskontrollen eller QC-knappen på pekskärmens kontrollpanel för att utföra QC automatiskt. Tryck sedan på initieringsknappen IntelliSort. Instrumentet justerar automatiskt frekvensen och amplituden för dropposcillation för att erhålla droppfördröjningen på cirka 25 och kunna visualisera droppens brytpunkt tydligt.Tryck sedan på droppfördröjningsknappen och underhållsknappen. Välj rör som sorteringsutdatatyp. Placera en 15 milliliter rörhållare i sorteringskammaren.Slå på plattspänningen och ställ in plattspänningen till cirka 4 000 volt. Aktivera sedan testmönstret genom att välja knappen för streamkonfiguration. Justera skjutreglaget för laddningsfasen och skjutreglaget för avböjning för att säkerställa att bilden av strömmen är i linje med uppsamlingsröret.Välj sedan bockmarkeringsknappen. Logga in på Summit-arbetsstationen på datorn. Skapa ett nytt protokoll från filens huvudmeny.Skapa sedan ett punktdiagram genom att välja histogramfliken i kontrollpanelen för Summit Software. Välj Framåtspridning som x-axelparameter och Sidospridning som y-axelparameter. Högerklicka sedan på axeln för det nya punktdiagrammet på arbetsytan och presentera framåtspridningen och sidospridningen i logaritmisk form.Välj anskaffningsfliken och leta reda på panelen för anskaffningsparametrar. Aktivera alla signaler i undermenyn för aktiveringsparametrar. Välj framåtspridning som utlösarparameter och ställ in tröskelvärdet på 0,01.Justera spänningen och förstärkningen för framåtspridning och sidospridning vid 250 och 0,6 för att säkerställa att händelser inom diagrammet för spridning framåt kontra sidospridning och populationer separeras. Späd de fluorescerande polystyrenmikrosfärerna i 100, 200 och 300 nanometer suspensioner genom att tillsätta en mikroliter mikrosfärer till en milliliter dubbeldestillerat vatten. Ladda sedan mikrosfärupphängningen successivt.Välj Start under förvärvsmenyn för Summit Software för att spela in 20 000 händelser och klicka sedan på Stopp efter inspelning av händelserna. Högerklicka på punktdiagrammet för framåtriktad spridning kontra sidospridning för att skapa rektanglar och dra för att ändra storlek. Flytta regionerna med elektroniskt brus och 100 nanometer mikrosfärpopulation genom att högerklicka på regionerna för att byta namn på dem som R7 respektive R4.Upprepa stegen för att rama in 200 och 300 nanometer mikrosfärer med rektanglar successivt och byt namn på dem till R5 respektive R6. Slutligen bestämmer du sorteringsområdet 50 till 200 nanometer baserat på det elektroniska bruset och positionen för 200 nanometerpartiklar för att definiera det som R8. Redigera sorteringsbeslut i sorteringslogik- och statistikpanelen genom att dubbelklicka på det tomma fältet i den vänstra eller L1-strömmen och välja området R8 för att skapa sorteringslogiken. Välj renhetsläge för avbryt och välj ett droppkuvert ovanför en droppe för L1-strömmen.Ladda 500 mikroliter prov av tidigare beredda extracellulära vesiklar eller EV-blandning. Tryck på Start-knappen under förvärvsmenyn i Summit för att hämta data och klicka sedan på Stoppa. Tryck sedan på Start i sorteringsmenyn för att samla 50 till 200 nanometer stora små extracellulära vesiklar eller sEV i ett 15 milliliter centrifugrör.Flödescytometrianalys av polystyrenmikrosfärer i standardstorlek för att lokalisera storleksintervallet 50 till 200 nanometer i diagrammet för framåtspridning kontra sidospridning avslöjade urskiljbara partikelsignaler. R4, R5 och R6 hänvisar till positionerna för 100, 200 respektive 300 nanometerpartiklar. R7 är det elektroniska bruset som detektionsgräns för 50 nanometerpartiklar och R8 representerar positionsområdet 50 till 200 nanometerpartiklar.Partikelstorleksfördelningen av EV-blandningen härledd från pankreas enceller genom nanopartikelspårningsanalys, eller NTA, var i det breda intervallet 40 till 400 nanometer efter ultracentrifugering. Flödescytometrisk sortering utfördes för att isolera och rena 50 till 200 nanometer sEV inom R8-regionen. Kvaliteten på isoleringen verifierades av NTA och det visade sig att partikelstorleksintervallet för sEV efter sortering var mellan 50 och 200 nanometer.Förekomsten av sEV observerades ytterligare av TEM och de isolerade sEVs bekräftades innehålla markörer för CD6, CD63 och CD81 genom Western Blot Analysis. Denna metod möjliggör separation av små extracellulära vesiklar och klassificering eller protemanalys av små extracellulära vesiklars genuttryck, vilket öppnar många forskningstillämpningar nedströms.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Isolering av vävnads extracellulära blåsor från levern

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Avbildning av extracellulära blåsor med atomkraft mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Ett ekonomiskt och mångsidigt proteinreningssystem med hög genomströmning med en plattadapter med flera kolumner

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

High-throughput screening för att erhålla kristallträffar för proteinkristallografi

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identifiering av peptider av små extracellulära vesiklar från makrofager från benmärg

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...