Name: optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Bu çalışma, Zhejiang Çin Tıbbı Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu (2020ZG29), Zhejiang Eyaleti Temel Kamu Refahı Araştırma Projesi (LGF19H150006, LTGY23B070001), Zhejiang İl Eğitim Bakanlığı Projesi (Y202147028) ve Zhejiang Üniversitesi Laboratuvar Bölümü Deneysel Teknoloji Projesi (SJS201712, SYB202130) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü
<ol><li>%10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) bir kültür ortamını hazırlayın. İnsan pankreas kanseri hücresi PANC-1'i, 1 x 106 hücre / mL yoğunluğunda 75cm2'lik bir kültür şişesinde kültürleyin. Kültürü 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.</li>
	<li>Mikroskobik gözlem altında hücre yoğunluğu %75-%80'e ulaştığında hücreleri alt kültüre alır. Ortamı çıkarın ...

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication.">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li><li>Andaloussi, S. E. L., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content.">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).</li><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).</li><li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+isolation+of+exosomes.">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li><li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma.">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses.">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma.">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999 (2015).</li><li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches.">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+vesicles:+general+methodologies+and+latest+trends.">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+an+overview.">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry.">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li><li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry.">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry.">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li><li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles.">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity,+yield,+viability,+and+genome+stability.">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li><li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system.">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li></ol>

Bu protokol, NTA tarafından doğrulanan bir akış hücresi sıralayıcısı kullanarak 50-200 nm'lik belirtilen parçacık boyutuyla sEV'yi izole etmek ve saflaştırmak için optimize edilmiş bir yöntemi özetlemektedir. Yöntem, düzgün parçacık boyutu ve yüksek saflıkta sEV elde etme darboğazı problemini çözdü ve büyük boyutlu EV'lere sarılmış ilgisiz biyolojik moleküllerin müdahalesini önledi22. Saniyede 100.000 parçacık yakalayabilen ve saniyede 70.000 sıralama karar?...

Bir hücre, hücreler arası iletişim için önemli olan sinyal molekülleri ve membran kapanımları ile sonuçlanan çeşitli boyutlarda hücre dışı vezikülleri (EV'ler) serbest bırakır1. Farklı boyutlardaki EV'ler de farklı biyolojik roller oynar, 50-200 nm sEV, RNA, DNA ve proteinleri doğru hücre dışı konuma hassas bir şekilde dağıtabilir. sEV ayrıca, sadece immün sürveyans, kök hücre bakımı, kan pıhtılaşması ve doku onarımı gibi normal fizyolojik süreçlerin düzenlenmesini değil, aynı zamanda tümör ilerlemesi ve metastaz 2,3 gibi çeşitli hastalıkların altında yatan patolojiyi de içeren salgı mekanizmalarını belirlemeye yardımcı olur. sEV'nin etkili izolasyonu ve analizi, biyobelirteçlerin tanımlanması ve gelecekteki ilaç müdahalelerinin tasarlanması için kritik öneme sahiptir.
sEV'nin klinik uygulaması üzerine yapılan sürekli araştırmalarla, sEV'nin izolasyon yöntemleri daha yüksek gereksinimler ortaya koymuştur. sEV'nin boyut, kaynak ve içerik bakımından heterojenliğinin yanı sıra fizikokimyasal ve biyokimyasal özelliklerde diğer EV'lerle benzerliği nedeniyle, sEV izolasyonu 4,5 için standart bir yöntem yoktur. Şu anda, ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi (SEC), polimer çökeltme ve immünoaffinite yakalama en yaygın sEV izolasyon yöntemleridir6. Ultra santrifüjleme, zaman alıcı olmasına rağmen, araştırmada sEV izolasyonu için hala altın standarttır, bu da 40-500 nm'lik geniş bir boyut dağılımı ile düşük saflığa ve uzun süreli santrifüjlemeden sonra sEV'ye önemli mekanik hasara neden olur 7,8,9. Genellikle polietilen glikol (PEG) kullanan polimer çökeltmesi, hücre dışı protein agregalarının eşzamanlı çökelmesi ve polimer kontaminasyonu10,11 ile sonraki fonksiyonel analizler için kabul edilemez saflıktan muzdariptir. İmmünoaffinite yakalama tabanlı yöntemler, farklı özgüllüklere sahip yüksek maliyetli antikorlar gerektirir, ayrıca düşük işlem hacmi ve verim12,13,14 ile ilgili problemleri vardır. Partikül boyutu, izole edilmiş sEV'nin saflığını değerlendirmek için ana göstergelerden biridir. Her ne kadar sEV saflığı ulaşılamaz bir hedef olmaya devam etse de, SEC önemli miktarda orta bileşeni ortadan kaldırır ve SEC yöntemiyle ekstrakte edilen sEV parçacıkları esas olarak 50-200 nm15 aralığındadır. Mevcut tekniklerin zaman alıcı, düşük saflık, düşük verim, zayıf tekrarlanabilirlik, düşük numune verimi ve sEV'nin potansiyel hasarı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birkaç dezavantajı vardır, bu da onu klinik kullanımla uyumsuz hale getirir16. Bu nedenle, çeşitli biyosıvılara uygulanabilir hızlı, ucuz ve boyut olarak belirlenmiş bir sEV izolasyon yöntemi, çeşitli araştırma ve klinik durumlarda önemli bir ihtiyaçtır.
Akış sitometrisinde, tek parçacıklar yüksek verimli, multiparametrik bir şekilde analiz edilir ve alt kümeler17'ye ayrılır. EV'lerin heterojenliği nedeniyle, hücre analizi paradigmalarını takip eden EV'leri araştırmak için kullanılan tek parçacıklı bir akış sitometrik ölçümü ideal olacaktır, fizyoloji ile ilgili özellikleri ve protein bileşenlerini tanımlamak için ışık saçılımı ve floresan etiketleri kullanılmaktadır18,19,20. Bununla birlikte, geleneksel akış sitometrisi, küçük boyutlu sEV'ler ve düşük yüzey biyobelirteçleri bolluğu ile zorlanmaktadır. Akış sitometrisinin hassasiyeti, ileri saçılma (FSC), yan saçılma (SSC) veya floresan eşiği tetikleyici parametre19 kullanılmasına bakılmaksızın arka plan gürültüsünü ve sEV'yi ayırt etmek için algılama parametrelerini optimize ederek geliştirilebilir.
Mevcut protokolle, yüksek çözünürlüklü akış sitometrik sıralama ayarları, standart olarak floresan boncuklar kullanılarak optimize edildi. Uygun nozul boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, eşik tetikleme parametresini ve dağınık ışık yoğunluklarını kontrol eden voltajları seçerek, sEV'nin belirli bir alt kümesini karmaşık bir karışımdan izole edebildik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>SUER</td>
			<td>SUER050QY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Moflo Astrios EQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pancreatic cancer cell, PANC-1</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser particle size and zeta potential analyzer&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS 90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C20012500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene fluorescent microspheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6602336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscopy</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-1200EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1713949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra rainbow fluorescent particles</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B28479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima-L80XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW32TI</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of flow cytometric sorting parameters for high-throughput isolation and purification of small extracellular vesicles

Küçük hücre dışı veziküller (sEV) tüm hücre tiplerinden salınabilir ve protein, DNA ve RNA taşıyabilir. Sinyal molekülleri, bir hücrenin fizyolojik ve patolojik durumunun göstergeleri olarak hizmet eder. Bununla birlikte, aşağı akış biyobelirteci tanımlamasını ve ilaç müdahale çalışmalarını önleyen sEV izolasyonu için standart bir yöntem yoktur. Bu yazıda, bir akış hücresi sıralayıcısı ile 50-200 nm sEV'nin izolasyonu ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bunun için, iyi bir sıralama hızı ve kararlı bir yan akış elde etmek için 50 μm'lik bir nozul ve 80 psi kılıf sıvı basıncı seçildi. Standart boyutlu polistiren mikrosferler, 100, 200 ve 300 nm parçacıkların popülasyonlarını bulmak için kullanıldı. Voltaj, kazanç ve ileri saçılma (FSC) tetikleme eşiğinin ek optimizasyonu ile sEV sinyali arka plan gürültüsünden ayrılabilir. Bu optimizasyonlar, yalnızca FSC ve yan saçılma (SSC) kullanarak temsili bir sEV popülasyonu elde edilmesini sağlayan kritik sıralama ayarlarından oluşan bir panel sağlar. Akış sitometrisi tabanlı izolasyon yöntemi sadece yüksek verimli analize izin vermekle kalmaz, aynı zamanda biyobelirteç ekspresyonuna dayalı sEV'nin senkron sınıflandırmasına veya proteom analizine izin vererek çok sayıda aşağı akış araştırma uygulaması açar.

Deneysel protokolün akış şeması diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu yöntemde, partikül boyutu dağılımı için referans standartlar olarak standart boyutlu polistiren mikrosferler kullanılmıştır. Belirli enstrümantal parametre koşulu altında, parçacık sinyali, logaritmik form kullanılarak FSC ve SSC grafiğindeki arka plan gürültüsünden açıkça ayırt edilebilir. Geçit stratejileri Şekil 2'de gösterilmiştir. R4, R5 ve R6, sı...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles at JoVE.com

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Bu protokol, hava püskürtme nozulunun boyutunu, kılıf sıvısı basıncını, numune akış basıncını, voltajı, kazancı ve tetikleyici eşik parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir izolasyon yöntemi sağlar.

Yüksek verimli izolasyon ve küçük hücre dışı veziküllerin saflaştırılması için akış sitometrik sıralama parametrelerinin optimizasyonu

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Bu protokol, akış sitometrisi sıralama parametrelerini optimize ederek küçük hücre dışı veziküller için hızlı ve boyuta özgü bir çözüm yöntemi sağlar. Bu optimizasyonlar, yalnızca boyut saçılımına karşı ileri saçılma kullanarak küçük hücre dışı veziküllerin temsili popülasyonlarını elde etmeyi sağlayan kritik sıralama ayarlarının bir panelini sağlar. Akış hücresi sıralayıcısının standart başlatma yordamını gerçekleştirerek başlayın.Başlangıç düğmesine basarak makineyi açın, ardından lazer kontrol panelindeki lazer güç düğmesini tıklayın. Akışkanları basınçlandırmak için Smart Sampler alt menüsündeki tankları değiştir düğmesine basın. Ultrasonik olarak temizlenmiş 50 mikrometre jet ve hava nozulu kullanın ve nozul tertibatına takın.Basıncı, kılıf sıvısı için 80 SI'ye ve basınç konsolundaki numune akışı için 80,3 SI'ye ayarlayın. Kılıf akışı akışını başlatmak için kılıf akışını başlat düğmesine basın. Akıllı Örnekleyici alt menüsündeki kabarcık düğmesini tıklatarak 10 dakika boyunca otomatik olarak kabarcıktan arındırın ve ardından kapatın.Akışı hizalamak ve lazer noktasını belirlemek için, akışı iğne deliklerinin üzerinden görüntülemek üzere aydınlatma odası ışığını açın. Akışı iğne deliğinde ortalamak ve akışı odaklamak için yukarı ve aşağı, sol ve sağ, ön ve arka mikrometreleri ayarlayın. Tüm lazer deklanşörlerini açın, lazer ve akış önleme sekmesini seçin ve ardından lazer durdurma ve nozul hizalama kalibrasyon işlemini tamamlamanız istendiğinde yeşil ok düğmesine sürekli basın.İnce lazer hizalama ekranına erişin. X ekseni parametresi olarak 640 nanometre lazer ve 772 bar 44 bandpass kanalını ve y ekseni parametresi olarak 405 nanometre lazer ve 448 bar 59 bandpass kanalını seçin. Tetik parametresi seçiciye basın ve 488 nanometre lazerin ileri saçılma parametresini seçin.Daha sonra, gökkuşağı floresan parçacıklarını, bir mililitre çift damıtılmış suya bir damla ekleyerek, mililitre başına bir kez 10 ila altıncı boncuk nihai konsantrasyonuna kadar seyreltin. Numune odası kapısını açın ve hazırlanmış gökkuşağı floresan parçacıklarından oluşan bir tüp yükleyin. Numuneyi başlat düğmesine basın ve floresan yoğunluğunu optimize etmek için mikrometreleri yukarı ve aşağı ayarlayarak her sinyali mümkün olduğunca yoğun hale getirin.QC'yi otomatik olarak gerçekleştirmek için dokunmatik ekran kontrol panelindeki kalite kontrolünü başlat veya QC düğmesine basın. Ardından IntelliSort başlatma düğmesine basın. Cihaz, yaklaşık 25'lik düşme gecikmesini elde etmek ve damlanın kopma noktasını net bir şekilde görselleştirebilmek için damlacık salınımının frekansını ve genliğini otomatik olarak ayarlar.Ardından, bırakma gecikme düğmesine ve bakım düğmesine basın. Sıralama çıktısı türü olarak tüpü seçin. Sıralama odasına 15 mililitrelik bir tüp tutucu yerleştirin.Plaka voltajını açın ve plaka voltajını yaklaşık 4.000 volta ayarlayın. Ardından, akış kurulumu düğmesini seçerek test desenini açın. Akışın görüntüsünün toplama tüpüyle aynı hizada olduğundan emin olmak için şarj fazı kaydırıcısını ve sapma kaydırıcısını ayarlayın.Ardından onay işareti düğmesini seçin. Bilgisayardaki Summit iş istasyonunda oturum açın. Dosya ana menüsünden yeni bir protokol oluşturun.Ardından, Summit Software kontrol panelindeki histogram sekmesini seçerek bir nokta grafiği oluşturun. X ekseni parametresi olarak ileri saçılma ve y ekseni parametresi olarak yan saçılma seçin. Ardından, çalışma alanındaki yeni nokta grafiğinin eksenine sağ tıklayın ve ileri saçılma ve yan saçılma logaritmik biçimde sunun.Alma sekmesini seçin ve alma parametreleri panelini bulun. Parametreleri etkinleştirme alt menüsündeki tüm sinyalleri etkinleştirin. Tetikleyici parametre olarak ileri dağılım'ı seçin ve 0,01 eşiğini ayarlayın.İleri saçılma ve yan saçılma grafiği ve popülasyonları arasındaki olayların ayrılmasını sağlamak için ileri saçılma ve yan saçılmanın voltajını ve kazancını 250 ve 0,6'da ayarlayın. Floresan polistiren mikrosferleri, bir mililitre çift damıtılmış suya bir mikrolitre mikrosfer ekleyerek 100, 200 ve 300 nanometre süspansiyonlara seyreltin. Ardından mikrosfer süspansiyonunu art arda yükleyin.20.000 olayı kaydetmek için Summit Software'in satın alma menüsü altında Başlat'ı seçin ve ardından olayları kaydettikten sonra Durdur'u tıklatın. Dikdörtgenler oluşturmak için ileri dağılım ve yan dağılım nokta grafiğine sağ tıklayın ve yeniden boyutlandırmak için sürükleyin. Elektronik gürültü bölgelerini ve 100 nanometre mikrosfer popülasyonunu, sırasıyla R7 ve R4 olarak yeniden adlandırmak için bölgelere sağ tıklayarak yeniden konumlandırın.200 ve 300 nanometre mikrosferleri art arda dikdörtgenlerle çerçevelemek için adımları tekrarlayın ve bunları sırasıyla R5 ve R6 olarak yeniden adlandırın. Son olarak, elektronik gürültüye ve R8 olarak tanımlamak için 200 nanometre parçacıklarının konumuna dayanarak 50 ila 200 nanometre sıralama bölgesini belirleyin. Soldaki veya L1 akışının boş alanına çift tıklayıp sıralama mantığını oluşturmak için R8 adlı bölgeyi seçerek sıralama mantığını ve istatistikleri panelinde sıralama kararlarını düzenleyin. Saflığın iptal modunu seçin ve L1 akışı için bir damlanın üzerinde bir damlacık zarfı seçin.Önceden hazırlanmış hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin karışımının 500 mikrolitrelik örneğini yükleyin. Verileri almak için Summit'teki edinme menüsünün altındaki Başlat düğmesine basın ve ardından Durdur'u tıklatın. Ardından, 50 ila 200 nanometre boyutunda küçük hücre dışı vezikülleri veya sEV'yi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplamak için sıralama menüsünde Başlat'a basın.İleri saçılma ve yan saçılma grafiğinde 50 ila 200 nanometre boyut aralığını bulmak için standart boyutlu polistiren mikrosferlerin akış sitometrisi analizi, ayırt edilebilir parçacık sinyallerini ortaya çıkardı. R4, R5 ve R6, sırasıyla 100, 200 ve 300 nanometre parçacıklarının konumlarını ifade eder. R7, 50 nanometre parçacıkları için algılama sınırı olarak elektronik gürültüdür ve R8, 50 ila 200 nanometre parçacıklarının konum aralığını temsil eder.Pankreas hücrelerinden nanopartikül izleme analizi veya NTA ile türetilen EV'lerin karışımının parçacık boyutu dağılımı, ultra santrifüjlemeden sonra 40 ila 400 nanometre aralığındaydı. R8 bölgesindeki 50 ila 200 nanometre sEV'yi izole etmek ve saflaştırmak için akış sitometrik sıralama yapıldı. İzolasyon kalitesi NTA tarafından doğrulandı ve sıralamadan sonra sEV'nin parçacık boyutu aralığının 50 ila 200 nanometre arasında olduğu bulundu.sEV'nin varlığı TEM tarafından daha da gözlendi ve izole edilen sEV'lerin Western Blot Analizi ile CD6, CD63 ve CD81 belirteçleri içerdiği doğrulandı. Bu yöntem, küçük hücre dışı veziküllerin ayrılmasına ve küçük hücre dışı veziküllerin gen ekspresyonunun sınıflandırılmasına veya protem analizine izin verir ve çok sayıda aşağı akış araştırma uygulamasına yol açar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Çok Sütunlu Plaka Adaptörü Kullanan Ekonomik ve Çok Yönlü Yüksek Verimli Protein Arıtma Sistemi

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

High-Throughput Screening for Protein Crystallization

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography (Video) | JoVE 

Protein kristalografisi için kristal isabetleri elde etmek için yüksek verimli tarama

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlardan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin Peptitlerinin Tanımlanması

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...